JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Рестеноз после сердечно-сосудистых процедур (шунтирование, ангиопластика или стентирование) является значительной проблемой, снижающей долговечность этих процедур. Идеальная терапия ингибирует пролиферацию гладких мышечных клеток (VSMC), способствуя регенерации эндотелия. Мы описываем модель одновременной оценки пролиферации VSMC и эндотелиальной функции in vivo.

Аннотация

Артериальная реконструкция, будь то ангиопластика или шунтирование, связана с ятрогенной травмой, вызывающей нарушение эндотелия и пролиферацию гладких мышц сосудов (VSMC). Обычные мышиные модели исследуют небольшие сосуды, такие как сонные и бедренные артерии. Здесь мы описываем систему in vivo , в которой как VSMC-пролиферацию, так и функцию эндотелиального барьера можно одновременно оценить в большом сосуде. Мы изучили реакцию инфарренальной аорты на повреждение у мышей C57BL / 6. Аорта была повреждена от левой почечной вены до бифуркации аорты на 30 трансмуральных давлений продолжительностью 5 секунд с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Морфологические изменения оценивали с помощью обычной гистологии. Толщина стенки аорты измерялась от поверхности просвета до адвентиции. Для демонстрации VSMC-пролиферации использовали интеграцию ЭДУ и противодействующее окрашивание с помощью DAPI и альфа-актина. Активация ERK1 / 2, известного замедлителя формирования гиперплазии интимы, сдерживаласьПроведенный Вестерн-блот-анализом. Эффект воспаления определяли иммуногистохимией для В-клеток, Т-клеток и макрофагов . На участках эндотелия были выделены сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Эндотелиальную барьерную функцию определяли окрашиванием Evans Blue. Трансмуральная травма привела к утолщению стенки аорты. Эта рана индуцировала пролиферацию VSMC, наиболее заметно через 3 дня после травмы и раннюю активацию ERK1 / 2 и снижение экспрессии p27 kip1. Травма не приводила к увеличению В-клеток, Т-клеток или инфильтрации макрофагов в стенке сосуда. Травма вызвала частичную денудацию эндотелиальных клеток и потерю контакта клеток. Травма привела к значительной потере функции эндотелиального барьера, которая вернулась к исходному состоянию через семь дней. Модель трансмуральной тупой аортальной модели мыши обеспечивает эффективную систему для одновременного изучения как пролиферации VSMC, так и функции эндотелия в большом сосуде.

Введение

рестеноз Следующие сердечно-сосудистые процедуры (обходная хирургия, ангиопластика или стентирование) являются значительной проблемой, снижающей долговечность этих процедур. Все процедуры реваскуляризации страдают рестенозом. Существующие стратегии профилактики рестеноза (стенты с лекарственным покрытием и покрытые лекарством шары) ингибируют как сосудистую гладкомышечную клетку (VSMC), так и пролиферацию эндотелиальных клеток (EC). Следовательно, эти вмешательства предотвращают опосредуемый VSMC рестеноз, но также предотвращают регенерацию эндотелия. Без интактного эндотелия пациенты должны находиться на мощных антиагрегантных средствах, чтобы снизить риск тромбоза in situ при риске осложнений кровотечения. Идеальная терапия будет ингибировать пролиферацию VSMC, способствуя регенерации эндотелия. Таким образом, необходимо одновременно изучать пролиферацию VSMC и функцию эндотелиального барьера i n vivo .

В настоящее время естьМышиные модели рестеноза 1 . Эти модели включают каротидную лигирование и повреждение проволоки бедренной артерии 2 . Модели аорты включают размещение стента 3 , повреждение 4 баллонов и аллотрансплантат аорты 5 . Все существующие модели ограничены. Перевязка сонной артерии генерирует опосредованное потоком неоинтимальное поражение и не имеет эндотелиального повреждения. Кроме того, обе сонные и бедренные артерии имеют в несколько раз меньше клеточных слоев, чем сосуды для человека, что ограничивает их поступательное значение. Аорта мыши диаметром около 1,3 мм является единственным сосудом, который аппроксимирует клинически значимую (коронарную) человеческую артерию (3).

Несмотря на поступательный потенциал мышиных аортальных моделей болезни, существующие модели имеют ограничения. Эти модели требуют передовых микрохирургических навыков и специализированного оборудования, такого как аэропланы и стенты ангиопластики. Здесь мы представляемНовый, воспроизводимый метод, чтобы одновременно индуцировать пролиферацию VSMC и нарушать функцию эндотелиального барьера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Заявление об этике: Протоколы обработки животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата Мэриленд (протокол № 0416009) и проводились в соответствии со стандартами AAALAC-International.

1. Хирургическая процедура

  1. Анестезирующая техника
    1. Стерилизовать все инструменты, используемые в хирургии выживания, с паровой стерилизацией при 121 ° C в течение 30 мин.
    2. Индуцировать анестезию через индукционный резервуар со 100% O 2 и 2,5% изофлураном, поставляемым через прецизионный испаритель. После индукции прекратите изофлуран и промойте камеру с помощью O 2 . Поддерживайте анестезию с использованием 1,5-2% изофлурана через лицевую маску и 1 л / мин O 2 при вдыхании.
    3. Прикрепите как индукционную камеру, так и лицевую маску к поглотителю углей для адсорбции отработанного газа для защиты персонала. Обеспечить адекватную анестезирующую плоскость демонстрациейЧто нет ответа на ядовитые стимулы (пальцы).
    4. Создайте оперативное поле, состоящее из хирургического лотка с изотермической подушечкой для обеспечения тепловой поддержки во время операции. Дополнительная изотермическая подушка обеспечит тепловую поддержку животным в их клетке для извлечения.
  2. Подготовка животных
    1. Проведите следующее исследование на мышах C57BL / 6 у мужчин 10-12 недель.
    2. Удалите волосы на брюшной брюшной поверхности животного от грудины до паховой области с помощью депиляционного агента или электрического клипера с лезвием номер 40.
      1. В случае депиляционного агента нанесите это соединение на хирургическую зону в течение 2-3 минут, а затем удалите его хлопком. Мы используем коммерчески доступное соединение гидроксида кальция и гидроксида натрия.
    3. Подготовьте область над плечом 70% спиртом и подкожно вводите карпрофен (5 мг / кг) с помощью иглы диаметром 25 или меньше. ЭтаЛечение обеспечит послеоперационную аналгезию для животного.
    4. Перенесите животное в хирургическое поле и положение в дорзальном положении.
    5. Подготовьте хирургический участок, очистив 8-12% провидон-йода чистым аппликатором для хлопка или хлопковой сеткой. Затем промыть кожу дважды 70% -ным спиртом.
    6. Поместите глазную смазку в оба глаза, чтобы уменьшить частоту высушивания роговицы. Накройте хирургический участок стерильной драпировкой.
  3. Оперативная техника
    1. Сделайте средний разрез лапаротомии брюшной полости приблизительно 2-2,5 см в длину, с скальпелем, начинающим сразу же хвостовой отростк и продвигаясь к тазу.
    2. Мобилизовать тонкую кишку и двенадцатиперстную кишку и отразить в поперечном направлении вправо. Сверните полосу стерильного хлопка, просеянного и пропитанного стерильным физиологическим раствором для инъекций, чтобы можно было убрать внутреннюю оболочку для улучшения воздействия.
    3. При тонком кишечнике, мобилизованном в правую сторонуЖивот, выставить забрюшинную полость и выставить брюшную аорту из левой почечной вены в бифуркацию аорты ( рис. 1 ).
    4. С помощью стерильного аппликатора с хлопковым наконечником дайте 30 последовательных давлений, каждые пять секунд.
    5. Снимите упаковку и позвольте внутренности вернуть в исходное положение.
    6. Закройте фасцию бегущим волокнистым монофиламентом 4-0 (полидиоксанон). Кожа закрыта беговым нитевидным монофиламентом 6-0 (нейлон).
  4. Восстановление и послеоперационное лечение
    1. После процедуры поместите животное в клетку для восстановления с чистыми постельными принадлежностями на изотермической подушечке, чтобы продолжить термальную поддержку до тех пор, пока животное не сможет нормально передвигаться. Не оставляйте животное без присмотра, пока оно не продемонстрирует способность поддерживать грудь.
    2. Наблюдайте за животными каждый час в течение первых 4 часов после операции. Как только животное перемещается, обычно возвращаются i Т к назначенной комнате для разведения животных. Животное не будет размещено в компании другого животного, пока оно полностью не восстановится.
    3. Контролируйте животное дважды в день в течение первых 72 часов после операции и по меньшей мере 3 раза в неделю после этого. Мониторинг включает взвешивание животного три раза в неделю.
    4. Администрирование carpofen (5 мг / кг) подкожно два раза в день в течение первых 72 часов после операции.

2. Закупка ткани

  1. Метод эвтаназии
    1. Усыплять животных в заранее определенные моменты времени.
    2. Индуцировать анестезию через индукционный резервуар со 100% O 2 и 2,5% изофлураном, поставляемым через прецизионный испаритель.
      1. Чтобы изучить целостность эндотелия, введите животное Эванс Блю.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Эванс Синий - это отрицательно заряженный азо-краситель с высокой аффинностью связывания с альбумином и может только окрашивать кровеносные сосуды в отсутствие интактного эндотелияS = "xref"> 6.
      2. Для исследований эндотелиальной целостности во время эвтаназии перфузируйте животных 5 мл 0,3% красителя Evans Blue, а затем 5 мл PBS при физиологическом давлении в течение 5 мин. Животное содержится в хирургическом плане анестезии во время процедуры перфузии.
    3. После достижения глубокого анестезирующего плана откройте сундук с помощью стернотомии. Сделайте рану в правом предсердии, чтобы дать дренаж крови у животного, и доступ к левому желудочку осуществляется с помощью иглы 21 G и вводить забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) до тех пор, пока поток эфлюента из правого предсердия не станет прозрачным.
    4. После перфузии с PBS, вводите живот через срединный разрез.
    5. Еще раз мобилизуйте тонкую кишку в правую сторону брюшной полости, обнажая инфаренальную аорту, резко рассеивайте аорту из соседних тканей и вырезайте ее из левой почечной вены в бифуркацию аорты.
    6. Храните вырезанную аорту в 4% параформальдеЭхид до тех пор, пока не произойдет обработка тканей.
      1. Для исследований целостности эндотелия, откройте аорту в продольном направлении и прикрепите ее к восковому листу, обнажающему всю поверхность просвета 6 . Проведите качественную оценку целостности эндотелия по степени окрашивания краской Evans Blue 6 .
      2. Для других гистологических анализов отрежьте аорту поперечно и вложите ее в соединения оптимальной температуры резки (OCT), как это определено гистологическим методом, который будет использоваться 7 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Поперечные участки аорты, внедренные в ОКТ, секционировали и окрашивали гематоксилином и эозином, затем контуром окрашивали пятно Верхофф-Ван Гисона (ВВГ), чтобы идентифицировать внутреннюю и внешнюю эластичную пластину 7 . Раздражение травмы вызвало уто...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы охарактеризовали влияние модели повреждения мышиной аорты, которая приводит к медиальной гиперплазии и дисфункции эндотелиальных барьеров. Частичное отделение EC вдоль аорты интимы сопровождалось потерей клеточного клеточного контакта и усилением клеточных выступов. Соответств?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Эта работа финансировалась Департаментом по вопросам развития карьеры в области ветеранов (1IK2BX001553-01) (TSM) и стипендией Vascular Cures EJ Wylie (TSM).

Благодарности

Мы благодарим докторскую степень Hsia Ru-ching от Главной основы электронной микроскопии Школы медицины Университета Мэриленда за ее техническую поддержку в обработке образцов сканирующей электронной микроскопии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ocular lubricantDechra17033-211-38Pharmaceutical agents
IsofluraneVetOne502017Pharmaceutical agents
CarprofenZoetis26357Pharmaceutical agents
Precision vaporizerSummit Medical10675Surgical supplies
Charcoal scavengerBickford Inc.80120Surgical supplies
Isothermal padHarvard Apparatus50-7053-RSurgical supplies
Sterile cotton-tipped applicatorFisher Scientific23-400-124Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture Ethicon, IncJ310Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament sutureEthicon,Inc1666Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needleBD Biosciences305165Surgical supplies
25-gauge x 1 inch  needleBD Biosciences305125Surgical supplies
Dry sterilizerCellpoint 7770Surgical supplies
Fine scissorsFine Science Tools14058-09Surgical instruments
Adson forcepsFine Science Tools11006-12Surgical instruments
Dumont #5 fine forcepsFine Science Tools11254-20Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edgeFine Science Tools15000-00Surgical instruments
Needle driverFine Science Tools91201-13Surgical instruments
Scalpel handle #4Fine Science Tools10004-13Surgical instruments
Scalpel blades #10Fine Science Tools10010-00Surgical instruments
PBS Lonza17-516FReagents for tissue processing
Evans BlueSigma-AldrichE2129Reagents for tissue processing
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Reagents for tissue processing
Modeling waxBego40001Reagents for tissue processing
OCT compoundTissue-Tek Sakura4583Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solutionSigma-AldrichMHS16Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic Sigma-AldrichHT110316Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kitSigma-AldrichHT25AReagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging KitInvitrogenC10337Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibodyCell Signaling Technology4695Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibodyCell Signaling Technology4370Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibodyCell Signaling Technology3698Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acidSigma-AldrichT9159Reagents for immunohistological analysis

Ссылки

  1. Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
  2. Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
  3. Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
  4. Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
  5. Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
  6. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062(2013).
  7. Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
  8. Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
  9. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  10. Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
  11. Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
  12. Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
  13. Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397(2015).
  14. Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Cellular Biology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены