JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Аннотация

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Введение

Правильная идентификация ядер кардиомиоцитов и состояния клеточного цикла имеет решающее значение для определения сердечного оборота мышц и регенерации. Это особенно верно для использования ядерных маркеров, таких как pHH3, Ki-67, или аналоги тимидина, для идентификации клеточного цикла активности. По мере того как пролиферативную способность взрослых кардиомиоцитов млекопитающих очень мала 1, ложная идентификация ядра положительного для маркера пролиферации ядра кардиомиоцитов может внести существенное различие в результатах анализе пролиферации. Кроме того, кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, такие как эндоредупликации и acytokinetic митоза, которые приводят к полиплоидных и многоядерные клетки, а не в делении клеток. С этой целью, интерпретация меченых антител против маркеров общего клеточного цикла не является окончательным во всех случаях.

Здесь мы представляем методы прямой-forwa й признание кардиомиоцитов мышей и их ядерность в родных изолированных клеток и участков толстой ткани на послеродовом и взрослых этапах путем однозначной идентификации их ядер. Для этой цели, трансгенной линии мышей с кардиомиоциты экспрессией слитого белка , состоящего из Н2В человеческого гистона и mCherry под контролем промотора Myh6 (Myh6-Н2В-MCH) использовали 2. Скрещивание этой мыши линии с трансгенной индикатором пролиферации линии мыши, в которой экспрессия слитого белка EGFP-anillin находится под контролем повсеместной курица актина с CMV энхансер (CAG-EGFP-anillin), допускает определение статуса клеточного цикла. Подмости белок anillin специфически экспрессируется в клеточном цикле активных клеток 3, а его дифференциал субклеточном локализации во время клеточного цикла позволяет прогрессии клеточного цикла живого слежения с высоким разрешением M-фазыЭФ "> 4. Таким образом, двойной трансгенные мыши могут быть использованы для различения между пролиферирующих кардиомиоцитов и те , которые претерпевают изменения клеточного цикла. Это доказывает , особенно полезным при скрининге пролиферации индуцирующих веществ в пробирке.

протокол

Все процедуры этого протокола с участием животных в соответствии с этическими нормами Боннского университета и соответствовали руководящим принципам из Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента по защите животных, используемых для научных целей.

1. Экстракорпоральное Визуализация клеточного цикла активность в послеродовом кардиомиоцитов

  1. Послеродовая кардиомиоциты диссоциации
    1. Предварительно экспериментальные препараты
      1. Подготовка культуральной среды (IMDM, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, 0,1% β-меркаптоэтанол); среда 1: добавить FCS до 2%; среда 2: добавить FCS до 20%.
      2. Шерсть 96-луночного блюдо культуры (площадь половинной рост: 15 мм 2) с 0,1% желатина в растворе PBS.
    2. Сердце рассечение
      1. Приготовьте чашку Петри с 15 мл PBS и хранить его на льду. Стерилизовать два пинцета и маленькие ножницы, помещая их в сухое стекло шарика стерилизатор.
      2. Жертвоприношение неонатальной трансгенных мышей (CAG-EGFP-anillin / Myh6-Н2В-MCH) путем обезглавливания. Откройте грудную клетку, рассекают сердце, как описано в Ehler и др. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 DOI: 10,3791 / 50154), и передать его на ледяной PBS. Переход к следующей мыши.
      3. При использовании не-гомозиготные гнездящихся пар, выявить трансгенные сердца с флуоресцентным микроскопом. Положите сердца в PBS под флуоресцентным микроскопом. Проверьте выражение EGFP-anillin (Напр .: 488 нм; Em .: 509 нм) и экспрессию H2B-МЧ (напр .: 587 нм, Em .: 610 нм) с соответствующими наборами фильтров.
    3. изоляция кардиомиоцитов
      1. Диссоциируют выбранные сердца с помощью неонатального набора сердца диссоциации. Выдержите смеси ферментов 1 при 37 ° С в течение 5 мин. Для получения 1 мл конечного ферментной смеси, добавляют 945 мкл смеси ферментов 1 до 55 мкл смеси ферментов 2.
      2. Трансфер до 4 сердца от P1 - P3 мышей или до 2-х сердец от P4 - P6 мышей к 1,5 мл гeaction пробирку, содержащую 1 мл смеси ферментов и вырезать сердце на мелкие кусочки ножницами. Переносят раствор в 15 мл реакционных труб.
      3. Инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин. Для того, чтобы максимально увеличить контакт между тканью и ферментами, положить трубку объемом 15 мл почти горизонтально в инкубаторе. Смешайте с помощью пипетки 5 - 10 раз вверх и вниз с помощью пипетки 5 мл. Повторите этот шаг три раза.
      4. Добавить 7,5 мл среды 2 (20% FCS), чтобы остановить реакцию фермента. Фильтр суспензии клеток через клеточный фильтр 70 мкм. Промыть фильтр грубой очистки клеток 3 мл среды 2.
      5. Центрифуга клеточной суспензии при 300 × г в течение 15 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл среды 1; красных клеток крови лизис не требуется для дальнейших экспериментов. Пипеткой 10 мкл суспензии клеток в счетной камере и клеток определяют количество клеток.
      6. Для 96-луночного планшета: семян 10000 клеток на лунку в 120 мкл среды 1 (2% FCS). Местоклетки в инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) и сразу же приступить к трансфекции.
  2. Трансфекция неонатальных кардиомиоцитов с миРНК или микроРНК
    1. Протрите скамью с обеззараживающим раствором РНКазы, чтобы удалить РНКазы. Очистите следующий материал с обеззараживающим раствором РНКазы: 10-мкл, 100 мкл, и 200-мкл пипетки и коробку льда. Оттепель миРНК акции аликвоты (100 мкМ) на льду.
    2. Приготовьте 2 мкм рабочие запасы Si / микроРНК в уменьшенном сыворотки среде (98 мкл восстановленного сыворотки среды + 2 мкл миРНК 100 мкМ акций). Рабочий запас должен быть использован в тот же день. Замораживание не рекомендуется.
    3. Добавить 4 мкл 2 мкМ запаса до 6 мкл восстановленного сыворотки среды в реакционную пробирку 0,5 мл (количество для одного 96-луночного, окончательная концентрация Si / микроРНК в 140 мкл: ~ ​​57 нм). Выберите подходящий объем для количества скважин, предназначенных для трансфекции с определенным отношением Si / микроРНК.
    4. Подготовка мастер смеси реагента для трансфекции. Используйте 10 мкл (0,6 мкл реагента для трансфекции + 9,4 мкл восстановленного сыворотки среды) для каждой лунки (всего 96 лунок).
    5. Добавьте си / микроРНК смешивания в смесь трансфекция реагента. Инкубировать в течение 5 минут на льду. Пипеткой 20 мкл в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 ° С и 5% СО 2 , а затем заменить среду в каждую лунку с 120 мкл среды 1. Через 24 ч или более, перейти к фиксации и иммунофлуоресцентного окрашивания.
  3. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание
    1. Удалите среду и промыть клетки один раз PBS. Накройте клетки с 4% -ным раствором формальдегида в течение 20 мин. Снимают раствор формальдегида и промыть клетки один раз PBS, а затем покрывают их PBS для хранения или перейти к иммунным окрашиванием.
    2. Инкубируйте с первичным антителом (концентрация в соответствии с инструкциями изготовителя) в 0,2% Triton-X и 5% осла сыворотки в течение не менее 2 ч.Если окрашивание на альфа-актинин (разбавление 1: 400; моноклональное анти-α-актинины), пятно в течение ночи при температуре 4 ° С.
    3. Удалить первичное антитело и промыть 3 раза PBS. Разведите вторичные антитела в Hoechst растворе 1: 400 и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Удалить антитело, промывают PBS, 3 раза, и покрывают клетки с PBS для хранения при 4 ° С.
  4. Конфокальной микроскопии видео
    1. С помощью конфокальной микроскопии для получения изображения. Откройте программу обработки изображений. Откройте "Настройки A1plus" и установите флажки для CH1, CH2 и СН3. Установите СН1 DAPI, СН2- к EGFP, Ch3 к Cy3 и СН4 к Cy4, нажав на выпадающее меню.
      1. Для каждого канала, нажмите на HV и установить его на 80 с помощью ползунка. Установите Смещение 0, используя ползунки, и нажмите на кнопку "Home", чтобы установить крошечное отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования 1,024 х 1,024, нажав на выпадающее меню.
      2. Нажмите Оптимизировать, чтобы открытьОкно "XYZ Размер установки". Флажок "Perfect Voxel" в разделе "Шаг (предложил г)". Увеличение интенсивности лазерного излучения, пока изображение не является ни недоэкспонирован, ни передержано.
        Примечание: Например; Ch1 (DAPI): 16%, СН2- (EGFP): 12%, СН3 (Су3): 100%, СН4 (Cy5): 1%. Задать смещение для всех каналов до 0.
    2. Делайте снимки с использованием объектива 20X (200-кратное увеличение). Сканирование большое изображение , состоящее из плитки изображений (например, 3 х 3).
      1. В программном обеспечении визуализации, перейдите в раздел "Приобретите" и выберите "Сканировать большое изображение" из выпадающего меню. Под "Площадь", выберите "текущая позиция находится в верхнем левом углу" из выпадающего меню и установите "Количество полей в X и Y" до 3 х 3. Нажмите кнопку "Сканировать".
  5. анализ изображений
    1. Определить количество ядер кардиомиоцитов путем подсчета Н2В-Ch сигналов и количество кардиомиоцитов путем подсчета α-актинин сигналы.
      1. Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" из следующего выпадающего меню. Нажмите на ядрах с сигналами Н2В-МЧ, таким образом, маркировки и подсчета их. Сделайте то же самое для α-актинин-позитивных клеток, чтобы получить число кардиомиоцитов.
    2. Граф G2 фазы кардиомиоциты S / с сигналами ядерных EGFP-anillin (EGFP-anillin + / + H2BmCh ядер). Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" из следующего выпадающего меню. Все ядра с EGFP-anillin сигналов и сигналов Н2В-МЧ, нажав на них.
    3. Граф кардиомиоциты с митозом конкретным EGFP-anillin сигналов (например, рис 1F и G), таких как цитоплазматических сигналов, сократительных кольца и midbodies. Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" со следующего импldown меню. Марк кардиомиоцитов с митоза конкретным EGFP-anillin сигналов (например, рис 1F и G), цитоплазматических сигналов, сократительных колец и midbodies, нажав на них.

2. Определение нуклеации у взрослых кардиомиоцитов по Лангендорфа Диссоциация и Толстые тканевых секций

  1. Выделение взрослых кардиомиоцитов путем Лангендорфа диссоциации
    1. Подготовка перед рассечением сердца
      1. Заполните инсулиновый шприц (30-го калибра иглы) с гепарином (20 ед / г массы тела). Захватите мышью на загривок. Поднимите и поверните мышь назад, чтобы обнажить живот для инъекций.
      2. Выполните внутрибрюшинную инъекцию. Поместите гепарином мышь обратно в клетку и ждать по крайней мере за 15 минут до начала сердца рассечение. Промыть и проветрить аппарат Лангендорфа с 5 - 10 мл перфузионного буфера (перфузии буфер: 135 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 2,5 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, и 25 мМ БДМ в DDH 2 O, доведения рН до 7,4 с помощью NaOH).
    2. Сердце рассечение
      1. Подготовьте 10 см чашку Петри с охлажденной (4 ° С) PBS и поместить его на льду. Заполнить и проветривать 1-мл шприц, соединенный с канюлей (20 калибра) с PBS. Закрепите канюлю с пластилином на границе чашки Петри. Поместите кончик полой иглы чуть ниже поверхности PBS.
      2. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков. Протрите живота с 70% -ным раствором этанола. Сделайте надрез от середины живота к грудине с хирургическими ножницами. Снимите диафрагму и разрезать грудную клетку на двусторонней основе с хирургическими ножницами.
      3. Поднимите и закрепите грудины с 20-го калибра иглы, откройте грудную полость, и осторожно возьмитесь за сердце с анатомическими щипцов. Поднимите сердце и удалить его из легких и сосудистую систему, сокращая сосуды тракта оттока.
        Примечание: Для того, чтобы определить аорту, расположите сердцеего вентральной стороной вверх. Это уменьшает расстояние между обоими предсердиями, поэтому аорта с ее ветвей можно найти между предсердиями. В зависимости от индивидуальных особенностей архитектуры сердца, ветви могут быть удалены, если главная ветвь аорты все еще достаточно долго.
      4. Передача сердце в 10-см чашки Петри, содержащей охлажденным PBS (смотри стадию 2.1.2.1). Сердце иглу, потянув за восходящую аорту на инъекционной канюлей G20x1 ½, который был тупого колеблющимся многофункциональный инструмент, чтобы избежать повреждения тканей. Закрепите аорту с резьбой на канюлю. Осторожно промыть сердце PBS, чтобы удалить лишнюю кровь, нажав на поршень шприца. Небольшое расширение сердца должно быть видно.
    3. Langendorff сердце диссоциации
      1. Подключите каннюлирован сердце быстро к адаптеру замка Luer в перфузионной аппарате Лангендорфа. Заливать сердца с 30 мл насыщенной кислородом буфера перфузионного при 37 ° С в течение 5 мин со скоростью потока 1 капли / с. ThСкорость потока д может быть адаптирован путем регулирования потока O 2 в устройстве Лангендорфа с использованием редукционного клапана (давление в диапазоне от 0 до 200 мбар).
      2. Подготовка пищеварения буфера непосредственно перед использованием: перфузионной буфера с 6 U коллагеназы B, 10000 единиц трипсин, и 50 мкМ CaCl 2. Удалить буфер перфузию и начать ферментативного расщепления путем добавления 30 мл теплого (37 ° С) и насыщенным кислородом буфера пищеварения.
        Примечание: Количество коллагеназы B должно быть титруют в зависимости от активности различных партий.
      3. Отрегулируйте поток в размере 1 капля / с и переварить сердце в течение 10 - 13 мин. Во избежание загрязнения, не используйте оттоку снова. Перенести сердце к 10-см чашки Петри с 5 мл буфера пищеварения. Рассеките ткани вручную с помощью щипцов, удерживая сердце с одной парой щипцов и с помощью другой пары, чтобы разорвать сердце на мелкие кусочки.
        Примечание: На этом шаге предсердия могут быть разделены, разрезают на небольшиештук (с радужной оболочки глаза ножницами), и переваривают в течение 30 мин в 750 мкл буфера для переваривания в инкубаторе при 37 ° С, чтобы получить изолированные предсердных клеток. Для того, чтобы получить чистые предсердные кардиомиоциты, пипетку вверх и вниз несколько раз с использованием 1-мл пипетки. Остановить ферментативную реакцию путем добавления 750 мкл стоп-раствора.
      4. Остановить пищеварение путем добавления 5 мл останавливающего раствора (перфузионное буфер с 5% FBS и 50 мкМ CaCl 2). С помощью серологической пипетки, фильтровать суспензии клеток через клеточный фильтр 100 мкм и собирают клетки в центрифужную пробирку на 50 мл. Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии при 80 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
      5. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 10 мл останавливающего раствора с помощью серологической пипетки на 10 мл. Центрифуга клеточной суспензии при 80 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
      6. После центрифугирования, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в 1 мл культуральной среды (IMDM с 20% FCS, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг / мл каждого из пенициллина и стрептомицина и 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола) с последующим культивированием. С другой стороны, перейдите к шагу 2.2, "иммунофлюоресценции окрашивание" и зафиксировать клетки.
      7. Для фиксации на 24-луночные планшеты, пластины 10000 изолированных клеток на лунку на 8 мкг / мл ламинин покрытием покровные в 24-луночные планшеты с 500 мкл культуральной среды при 37 ° С и 5% СО 2 в течение по меньшей мере 3 ч ,
  2. Иммунофлуоресценции окрашивание на Langendorff-изолированных кардиомиоцитов в суспензии
    1. Закрепить Лангендорфа-изолированные кардиомиоцитов в 1 мл 4% PFA в PBS, рН 7,4, в течение 15 мин при комнатной температуре. Центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре, удалите закрепитель, и промыть клетки дважды PBS.
    2. Ресуспендируют фиксированные кардиомиоцитов в 1 мл PBS и либо продолжить иммунофлюоресценции окрашиванием или хранить их в 500 мкл PBS на лунку на24-луночный планшет при температуре 4 ° С. Перенести часть клеточной суспензии (~ 100 - 200 мкл) в микроцентрифужных трубки. Центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
    3. Проницаемыми, блок, и окрашивать клетки с первичными антителами против альфа-актинин путем добавления 200 мкл первичного антитела, разбавленного 1: 400 в PBS с 0,2% тритона Х-100 и 5% ослиной сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Центрифуга при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Промывают осадок клеток ПБС, а затем центрифугируют при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и инкубировать в 200 мкл Alexa-Fluor-конъюгированного вторичного антитела (анти-мышиного IgG1), разведенным 1: 400 в Hoechst красителя (рабочий раствор: 1 мкг / мл) в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    5. Центрифуга при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Повторите этот шаг. Защита образца от света. рesuspend клеток в 200 - 500 мкл PBS и переносят 100 - 300 мкл суспензии клеток в лунку микроскопии камеры. Закройте крышку камеры и не хранить клетки при 4 ° С до обработки изображений. Защита от света.
  3. Анализ нуклеарностью Langendorff-изолированных кардиомиоцитов
    1. Возьмем изображения с α-актинины окрашенных кардиомиоцитов с целью 25X, что соответствует увеличении 250х. Подсчитайте количество ядер Н2В-MCH + только в тех кардиомиоцитов, которые регулярно окрашивали альфа-актинин и показывают типичные стержнеобразные морфологии и поэтому считаются неповрежденными.
    2. Граф, по крайней мере 100 кардиомиоцитов из трех разных сердец. Вычислить процент одноядерных, биядерных и трехъядерных кардиомиоцитов.
      Примечание: Как правило, двуядерные клетки должны составлять около 80 - 90%, в то время как трехъядерные клетки и те, с большим числом ядер встречаются редко (<1% в Langendorff-изолированные кардиомиоцитов, <3% в толстых ломтиков). Предсердные кардиомиоциты значительно меньше, чем желудочковых кардиомиоцитов. Как правило, одноядерные клетки составляют 90% от общей численности населения.
  4. Изоляция, фиксация и криоконсервация взрослых сердец как подготовка к толстых ломтиков
    1. Собирают перфузионное устройство для фиксации посредством соединения 50-мл шприц с 3-ходовым запорным краном с удлинительной трубкой Heidelberger и второй 3-ходовым запорным краном. Закрепить шприц в подставке таким образом, что проточный включена под действием силы тяжести. Заполните систему с 15 мл PBS.
    2. Выполните шаги 2.1.2.1-2.1.2.4, «Подготовка сердца." Подключите инъекции канюлю G20x1 ½ с сердцем блокировки адаптера Luer пузырьковой освобождающего PBS заполненный перфузионного устройства и заливать его с PBS. Заполните систему с 10 - 15 мл 4% -ного формальдегида в PBS, который затем увлажненную через сердце. Погружение исправить сердце в 4% растворе формальдегида в течение ночи.
    3. Заменить 4% формальдегидараствора ПБС, а затем моют сердце в PBS на горизонтальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту в течение 8 часов при комнатной температуре. Заменить PBS с 20% -ным раствором сахарозы к обезвоживанию сердца в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Замораживание сердце в крио-вложение среды в небольшой пресс-форме.
      1. Настроенный химический стакан, заполненный 2-метилбутана и поместить его в коробку с сухим льдом. Положите сердце в морозильную формы ранее наполовину заполненной с крио вложением среды и покрыть его полностью с крио вложение среды. Осторожно поместите форму в холодный химический стакан, предотвращая контакт крио-вложение среды с 2-метилбутана. Хранить замороженные ткани при -80 ° С до использования.
  5. Получение толстых срезов сердца
    1. Используйте следующую установку в замораживающий микротом: температура объекта от -18 до -20 ° С, температура в камере от -21 до -23 ° С, угол клиринговую на держателе ножа 4 °, и микротомных лезвия Перо R35.
    2. Возьмите КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ Organ из морозильного контейнера и закрепить его на образец диска с крио-вложение среды с использованием быстрого замораживания шельфа. Поместите сердце таким образом, что секционирование начинается в вершине.
    3. Отрезать 50-мкм срезы, пока еще секущую плоскость не будет достигнута и орган становится видимым. Вырезать 50 мкм срезы тканей, используя замораживающий микротом в ручном режиме с малой скоростью и с противодействующего крену пластины, расположенной на ноже. Маунт ломтики на обработанных солевым раствором микроскопа. Пусть кусочки высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре и хранить слайды при температуре -80 ° С или пятна непосредственно.
  6. Окрашивание толстые ломтики сердца (ядра и клеточные мембраны)
    1. Застойная сердечная ломтиков РНКазой А (20 мкг / мл) в буфере для промывки (0,5 М NaCl, 0,1 М Трис, рН 7,5, и 50 мМ ЭДТА) в кювете в течение 1 ч при 37 ° С. Инкубируйте ломтики в 0,2% Triton-X в промывочном буфере в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть ломтики дважды в течение 5 минут каждый в буфере для промывки в кювете нагоризонтальном шейкере при комнатной температуре.
    2. Пятно на ночь с 1 мкМ до-Pro3 йодида (642/661) и флуоресцеин-связанных агглютинина зародышей пшеницы (WGA, 1: 100) в буфере для промывки при температуре 4 ° С. Промыть Срезы три раза в течение 5 мин каждый с промывочным буфером в кюветах на горизонтальном шейкере и покрывают их поливинилового спирта монтажной среды с анти-выцветания реагента и покровным стеклом.
  7. получение изображений
    1. В идеале, используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопа, оборудованного с целью NA воды Погружение 40X / 1.15. Поиск по глазом для области в срезе, который состоит из продольно выровненных кардиомиоцитов; для этой цели, канал флуоресцеин-WGA (напр .: 488 нм) лучше всего подходит.
      Примечание: Этот шаг имеет важное значение, поскольку верхний и нижний пределы кардиомиоциты должны быть видны в пределах Z-стека для последующих анализов. По мере того как глубина изображения ограничивается ~ 30 нм, а толщина среза составляет 50 мкм, не представляется возможным, чтобы имПоперечные возраст сечения этих клеток (длина ячейки: ~ 120 мкм).
    2. Отрегулируйте настройки в программном обеспечении визуализации. Откройте программу обработки изображений. Открыть A1plus Настройки и установите флажки для CH2, CH3 и СН4. Набор для EGFP Ch2, ch3 к Alx546 и СН4 к Alx647, нажав на выпадающее меню.
      1. Для каждого канала, нажмите на HV и установить его на 80 с помощью ползунка. Установите смещение 0, используя ползунки. Нажмите на кнопку "Home", чтобы установить крошечное отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования 1,024 х 1,024, нажав на выпадающее меню и нажмите кнопку оптимизации, чтобы открыть окно "XYZ Size Setup". Установите флажок "Perfect Voxel" в разделе "Шаг (предложил г)".
    3. Нажмите на "живом" сканирования и настройки интенсивности лазерного излучения, нажав на ползунков на отдельных каналах. Установите флажок "Z Series" на окне "ND" Приобретение и нажмите на "определенную верхнюю кнопку" окно. Определить верхнюю иКнопка Z-стека, нажав на соответствующие кнопки после регулировки фокуса на микроскопе. Установите ширину Z-шага до 0,5 мкм.
      Примечание: Глубина Z-стека ограничен оптическим проникновением в ткани и отношением сигнал-шум.
    4. Перейти в раздел "Настройки A1plus" и установите Line Average / Integral 2-4, нажав на выпадающее меню. Тонкая настройка интенсивности лазерного излучения; пинхола должно быть как можно меньше, чтобы изображения в фокальной плоскости.
  8. Анализ нуклеации
    1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и загрузить Z-стек интерес.
    2. Вручную определить зарождение в Z-стеков путем прокрутки через различные уровни стека для того, чтобы идентифицировать клетки, которые лежат полностью в пределах стека; это тот случай, когда окрашивание РГА видна во всех измерениях. Подсчитайте число ядер (большинство из них будет двухядерный) и отметьте анализируемую ячейку аннотацией в программном обеспечении.
    3. Определить количество ядер CM (H2B-MCH +) и суммарных ядер (TO-Pro3 +) в 3D - реконструкций для отдельных каналов (рис 2D). В программном обеспечении формирования изображения, нажмите на кнопку "Binary" и выберите "Определение пороговых значений 3D" из выпадающего меню. Выберите из меню канала выпадающего меню либо Alx546 для числа ядер см или Alx647 для подсчета общего числа ядер. При нажатии на соответствующие стрелки, установите программу на "Smooth 4x", чистый 1x, и заполнить отверстия ON. Проверьте "Размер" окна и установить его на 5 мкм с помощью ползунка. Установите порог, используя ползунок, пока не появятся отдельные объекты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После применения фрагментации, окно результатов показывает таблицу количественных событий и цветной фрагментации изображения. Поскольку некоторые ядра непосредственно контактируют друг с другом, вручную корректировать автоматический результат измерения дублетов, которые не могут быть корректно разделены программным обеспечением.

Результаты

Для того чтобы проанализировать влияние миРНК / микроРНК на активность клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов в пробирке, кардиомиоцитов двойных трансгенных мышей Myh6-Н2В-МЧ / CAG-EGFP-anillin были выделены на постнатальный день 3 (P3) и трансфицировали клеточный ци?...

Обсуждение

Существует спор по поводу того, кардиомиоциты способны повторно клеточный цикл и разделить после травмы и в течение гомеостаза тканей. Значения для основного оборота кардиомиоцитов были даны в диапазоне от 1% до 1 и 80% 7. Кроме того, после повреждения сердца, инд?...

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

We thank S. Grünberg (Bonn, Germany) and P. Freitag (Bonn, Germany) for their technical assistance.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dishSarstedt821472
100 µm cell strainerBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ injection cannula, StericanBraun, Melsungen4657519
20 gauge needleBecton Dickinson GmbH301300
24-well platesBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Methyl-butaneCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37% formaldehyde solutionAppliChem GmbH A0936,1000
3-way stopcockB. Braun Medical Inc.16494C
50 mL syringeB. Braun Medical Inc.8728810F
70% ethanolOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibodyJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half AreaGreiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
donkey serumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
fetal calf serumPromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatine from porcine skin, Type ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
glass coverslipsVWR631-0146
GlucoseSigma-AldrichG7021
Heidelberger extension tubeIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond microscope slidesMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Insulin syringeBecton Dickinson GmbH300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
microcentrifuge tubeSarstedt72690
Mini shakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negative control(scrambled RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Neonatal Heart Dissociation KitMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum MediumGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicillin/StreptomycinGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifadingSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
sample containersVitlab80731
Serological pipetteGreiner607180
software NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 iodide (642/661)Molecular probes/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeledVector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
α-actinin antibodySigma-AldrichA7811
β-MercaptoethanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148

Ссылки

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

120

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены