JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы подробно остановимся на способе S- выравнивания P soralen, сшитого, Ligated, и S, выбранного H ybrids (SPLASH), который позволяет проводить генома внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия РНК-РНК in vivo . SPLASH может применяться для изучения РНК-взаимодействий организмов, включая дрожжи, бактерии и людей.

Аннотация

Зная, как РНК взаимодействуют с собой и с другими, является ключом к пониманию регуляции генов на основе РНК в клетке. Несмотря на то, что примеры взаимодействия РНК-РНК, такие как взаимодействия микроРНК-мРНК, как было показано, регулируют экспрессию генов, полная степень взаимодействия РНК в клетке остается неизвестной. Предыдущие методы изучения взаимодействий РНК были в основном сосредоточены на подмножествах РНК, которые взаимодействуют с конкретным видом белка или РНК. Здесь мы подробно описываем метод, названный S, состоящий из P soralen, сшитого, Ligated, и S, избранных H ybrids (SPLASH), который позволяет геномному захвату взаимодействий РНК in vivo беспристрастно. SPLASH использует in vivo сшивание, лигирование близости и высокую пропускную последовательность для идентификации внутримолекулярных и межмолекулярных партнеров по связыванию оснований РНК в глобальном масштабе. SPLASH может применяться для различных организмов, включая бактерии, дрожжи и клетки человека, а такжеС тем чтобы облегчить понимание динамики организации РНК в различных клеточных контекстах. Весь экспериментальный протокол SPLASH занимает около 5 дней, а процесс вычисления занимает около 7 дней.

Введение

Изучение того, как макромолекулы складываются и взаимодействуют друг с другом, является ключом к пониманию регуляции генов в клетке. Несмотря на то, что в последнее десятилетие были предприняты значительные усилия для понимания того, как ДНК и белки способствуют регуляции генов, относительно меньше посттранскрипционной регуляции экспрессии генов известно относительно меньше. РНК несет информацию как в своей линейной последовательности, так и в ее вторичной и третичной структуре 1 . Его способность основывать пар с собой и с другими имеет важное значение для его функции in vivo . Недавние успехи в зондировании вторичной структуры с высокой пропускной способностью РНК дали ценную информацию о расположении двойных и одноцепочечных областей в транскриптоме 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeВерная информация о партнерах по парному взаимодействию все еще в значительной степени отсутствует. Чтобы определить, какая последовательность РНК взаимодействует с другой областью РНК в транскриптоме, нам нужна глобальная парная информация.

Традиционно картографирование парных взаимодействий РНК глобальным, беспристрастным образом является серьезной проблемой. В то время как предыдущие подходы, такие как CLASH 9 , hiCLIP 10 и RAP 11 , используются для идентификации взаимодействий РНК широкомасштабным образом, эти методы обычно отображают спаривание оснований РНК для подмножества РНК, которые либо взаимодействуют с конкретным видом белка, либо РНК. Недавние разработки в изучении взаимодействий в глобальной РНК включают метод RPL 12 , который не стабилизирует взаимодействия РНК in vivo и, следовательно, может захватывать только часть взаимодействий in vivo . Чтобы преодолеть эти трудности, мы и другие разработали универсальные, беспристрастные стратегии для маР-РНК взаимодействует in vivo с использованием модифицированных вариантов сшивающего агента psoralen 13 , 14 , 15 . В этом протоколе мы описываем детали для выполнения S- согласования P сoralen сшитого, Ligated и S выбранных H ybrids (SPLASH), который использует биотинилированный псорален для сшивания базовых спаривающих РНК in vivo с последующим лигированием близости и высокой пропускной последовательностью, чтобы Идентифицировать партнеров по связыванию с основанием РНК по всему геному ( Рисунок 1 ) 15 .

В этой рукописи мы описываем шаги для выполнения SPLASH с использованием культивируемых клеток-приверженцев, в данном случае клеток HeLa. Тот же протокол может быть легко адаптирован к суспензионным клеткам млекопитающих и дрожжевым и бактериальным клеткам. Вкратце, клетки HeLa обрабатывают биотинилированным псораленом и облучают при 365 нм для сшивания взаимодействующих пар оснований РНК in vivo, РНК затем экстрагируют из клеток, фрагментируют и обогащают для сшивания областей, используя стрептавидиновые гранулы. Взаимодействующие фрагменты РНК затем лигируют вместе с использованием лигирования по близости и превращают в библиотеку кДНК для глубокого секвенирования. После секвенирования химерные РНК отображаются на транскриптом / геном, чтобы идентифицировать области взаимодействия РНК, которые спарены друг с другом. Мы успешно использовали SPLASH для идентификации тысяч взаимодействий РНК in vivo у дрожжей и различных человеческих клеток, включая внутримолекулярное и межмолекулярное спаривание РНК в различных классах РНК, таких как snoRNAs, lncRNAs и мРНК, чтобы заглянуть в структурную организацию и образцы взаимодействия РНК в клетке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Лечение клеток HeLa биотинилированным псораленом и экстракцией РНК

  1. Культурные клетки HeLa в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) и 1% стрептомицином пенициллина (PS) в пластине диаметром 10 см.
  2. Промывают клетки HeLa дважды 5 мл 1х PBS. Слейте избыток PBS полностью из блюда, поставив блюдо вертикально на 1 мин.
  3. Добавить 1 мл PBS, содержащего 200 мкМ биотинилированного псоралена и 0,01% вес. / Об. Дигитонина, к клеткам равномерно и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин. Хотя биотинилированный псорален может проникать в клетку, его проницаемость намного выше, когда клетки подвергаются воздействию малых количеств дигитонина (0,01%) в течение 5 мин
  4. Снимите крышку 10-сантиметровой пластины, содержащей обработанные клетки HeLa, и поставьте блюдо на лед. Облучите блюдо, содержащее клетки, с 365 нм УФ в течение 20 минут на льду, на расстоянии 3 см от УФ-луковиц, используя УФ-сшиватель.
  5. Изолировать тОтальной РНК из клеток HeLa путем экстракции гуанидинием тиоцианат-фенолхлороформ в соответствии с протоколом изготовителя. Добавляют объем изопропанола 1: 1 для осаждения РНК при комнатной температуре в течение 30 мин.
    Точка паузы: РНК может храниться при -20 ° C в изопропаноле неограниченно долго. На этом этапе можно провести дот-блот, чтобы проверить, что биотинилированный псорален успешно проник в клетки и имеет сшитые РНК in vivo ( рисунок 2 ).
  6. Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалить супернатант и добавить 1 мл 70% холодного этанола в РНК таблетки для промывки РНК.
  7. Центрифугируют образцы при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Удалите надосадочную жидкость и высушите ее на воздухе в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Добавляют воду, свободную от нуклеазы, к РНК-гранулу и количественно определяют концентрацию РНК с помощью УФ-спектрометра.
    Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после fЗамораживание ресниц в жидком азоте.

2. Фрагментация РНК

  1. Разогреть 15 мкл 2х РНК-фрагментационного буфера и 10 мкл образца РНК (1 мкг / мкл) индивидуально в 0,2 мл пробирках для ПЦР при 95 ° С в течение 1 мин. Смешайте 10 мкл нагретого фрагментации 2 РНК-буфера с 10 мкл образца РНК с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте образец при 95 ° С в течение 5 мин. Остановите реакцию путем быстрого охлаждения реакции на льду.
  2. Переносят и объединяют 2 реакции фрагментации в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Добавьте к реакционной смеси 40 мкл свободной от нуклеазы воды, 10 мкл 3 М ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола. Инкубируйте РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч для осаждения РНК.
  3. Центрифуга выпадающая РНК при 20000 мкг в течение 30 мин, удалите супернатант и промыть РНК с использованием 1 мл 70% этанола.
  4. Центрифугируют РНК при 20000 мкг в течение 15 мин, бетСупернатант и растворяют РНК в 20 мкл свободной от нуклеазы воды.

3. Выбор и элюирование размера РНК

  1. Добавьте 20 мкл красящего красителя РНК к извлеченной РНК в микроцентрифужной пробирке. Нагревают РНК красителем для загрузки РНК при 95 ° С в течение 3 мин и помещают его на лед в течение 2 мин.
  2. Добавьте 3 мкл красящего красителя РНК к 0,25 мкл ДНК-лестницы 10 нт в микроцентрифужной пробирке. Нагревают лестницу при 95 ° С в течение 3 мин и помещают ее на лед в течение 2 мин.
  3. Загрузите денатурированную лестницу и образцы на 8,6 см х 6,8 см 6% -ный гель мочевины и гранулометрический состав с помощью электрофореза в течение 40 мин при 180 В. Окрасьте гель в 10 мл буфера TBE, содержащего 1:10 000 гель-окраски нуклеиновой кислоты, в течение 5 Мин в темноте.
  4. Проколите чистую пробирку для микроцентрифугирования на 0,6 мл на дне с помощью иглы 24 G и поместите ее в пробирку для микроцентрифуги 2 мл.
  5. Визуализируйте полосы на пост-окрашенном геле с помощью трансиллюминатора и нарежьте срез геля, соответствующий 90-110 нт. Перенесите срез геля в проколотую пробирку для микроцентрифугирования объемом 0,6 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Этот выбор размера выполняется, чтобы позволить химерным фрагментам иметь минимальную длину для сопоставления с транскриптомом и различать между лигированными продуктами близости и незагрязненными продуктами на этапах выбора размера ниже по потоку.
  6. Центрифуга гель разрезает на 12000 xg при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы нарезать ломтик геля и собрать его в 2 мл микроцентрифужной пробирке. Откажитесь от пустой пробирки для микроцентрифугирования 0,6 мл. Добавьте 700 мкл буфера для элюции к измельченному срезу геля в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл и инкубируйте при 4 ° С в течение ночи с постоянным вращением, чтобы обеспечить диффузию образцов в буфер.
  7. Перенесите ломтики геля и буфер для элюирования в центрифужный трубчатый фильтр и центрифугируйте при 20000 мкг в течение 2 мин. Ломтики геля будут захвачены в верхнем отсеке фильтра. Отбросьте ломтики геля и верхний отсек.
  8. Добавить 1 мкл гликогена и 700 мкл 100% изопропанола в фильтрат в микроцентрифужной пробирке и осаждают РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
    Точка паузы: РНК может быть осаждена в изопропаноле неопределенно при -20 ° C.
  9. Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки РНК-таблетки. Центрифуга промывают осадок при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
  10. Удалите промывочный буфер и добавьте 20 мкл воды, свободной от нуклеазы, для ресуспендирования РНК. Количественное определение концентрации РНК с помощью УФ-спектрометра.
    Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в ​​жидком азоте.

4. Обогащение областей сшивания РНК

  1. Вихревые стрептавидиновые покрытые магнитные шарики энергично ресуспендируют шарики однородно в трубке. Перенесите 100 мкл шариков в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку и поместите ее на магнитIc выдерживают в течение 1 минуты, чтобы позволить шарикам прилипать к магнитной стороне трубки. Аккуратно выньте буфер хранения из бусинок и извлеките трубку из подставки для магнитов.
  2. Добавьте 1 мл буфера для лизиса к бусинам в микроцентрифужной пробирке и пипеткой вверх и вниз. Поместите шарики, содержащие микроцентрифуги, на магнитную подставку на 1 мин для отделения шариков от промывочного буфера. Повторите это для всего 3 моет.
  3. Удалите промывочный буфер с гранул, поместив микросферические гранулы на магнитную подставку на 1 мин. Добавить ингибитор РНКазы (1: 200) в буфер для лизиса и добавить 100 мкл буфера для лизиса к промытым гранулам в микроцентрифужной пробирке.
  4. Добавить 2 мл свежеприготовленного гибридизационного буфера, 1 мл добавленного буфера для лизиса, 1,5 мкг фракционированной фракции по размеру и 100 мкл ресуспендированных гранул в 15 мл коническую центрифужную пробирку. Вортекс пробирку осторожно.
  5. Инкубируйте 15 мл коническую центрифужную пробирку при 37 ° С в течение 30 мин при вращении от конца до конца.Предварительно подогревают промывочный буфер при 37 ° C.
  6. Поместите 15 мл конические центрифужные пробирки на магнитную подставку для 15 мл пробирок в течение 2 мин, чтобы отделить бусины от буфера. Тщательно выньте буфер из трубки и выбросьте его.
  7. Добавьте 1 мл предварительно нагретого промывочного буфера к шарикам, пипеткой вверх и вниз и перенесите бусины в пробирку для микроцентрифуги 1,5 мл. Инкубируйте на бусинах при 37 ° С в течение 5 мин, при вращении от конца до конца.
  8. Кратко центрифугируйте содержимое микроцентрифужной пробирки. Поместите промытые 1,5 мл шарики в микроцентрифужные пробирки на магнитную подставку для 2 мл пробирок в течение 1 минуты, чтобы отделить шарики от промывочного буфера. Удалите буфер из бусинок, осторожно выливая буфер из микроцентрифужной пробирки.
  9. Добавьте 1 мл предварительно нагретого промывочного буфера к шарикам и пипеткой вверх и вниз, чтобы повторить промывку. Выполните в общей сложности 5 стирок. В конце 5 -го мытья удалите промывочный буфер, поместив микросферические гранулы на магнитную подставку для1 мин.

5. Лигирование близости

  1. Добавьте 1 мл холодного буферного раствора полинуклеотидкиназы (PNK) T4 к промытым шарикам и инкубируйте шарики в течение 5 мин при 4 ° C с вращением от конца до конца. Поместите пробирку для микроцентрифугирования с шариками на магнитную полосу на 1 мин и аккуратно удалите буфер T4 PNK. Повторите этот шаг для всего двух стирок и удалите буфер T4 PNK после последнего стирки.
  2. Добавьте буферы в соответствии с таблицей 1 . Чтобы позволить 3'-концам фрагмента РНК лигировать с 3'-адаптерами ниже, инкубировать шарики в буфере при 37 ° С в течение 4 ч с постоянным перемешиванием для превращения 3 'циклической фосфатной группы в конце РНК в 3 'OH.
  3. Добавьте буферы к предыдущей реакции, согласно таблице 2 . Чтобы позволить 5'-концу фрагментов РНК быть компетентными для лигирования, инкубировать реакцию при 37 ° С в течение 1 ч с постоянным перемешиванием в присутствии АТФ, Чтобы превратить 5 'OH в РНК в 5' фосфат.
  4. Добавьте буфер к предыдущей реакции для выполнения лигирования близости, согласно таблице 3 . Инкубируйте реакцию при 16 ° С в течение 16 ч при постоянном перемешивании,
  5. Поместите микроцентрифугу, содержащую лигированную РНК, на магнитную подставку в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл буфера для промывки комнатной температуры. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз.
  6. Поместите пробирку для микроцентрифугирования на магнитную подставку на 1 мин и осторожно снимите промывочный буфер. Выполните в общей сложности 2 стирки и удалите промывочный буфер из бусинок в конце второй стирки.
  7. Добавить 100 мкл буфера РНК PK к бусинам и ресуспендировать пипетированием вверх и вниз. Нагрейте образцы при 95 ° C в течение 10 минут на тепловом блоке.
  8. Охладите образец на льду в течение 1 мин и добавьте 500 мкл гуанидиния тиоцианат-фенол-хлороформ к образцу. Перемешивают энергично в течение 10 с. Инкубируйте смесь.При комнатной температуре в течение 10 мин.
    Точка паузы: РНК может храниться в гуанидиний-тиоцианат-фенол-хлороформ при -80 ° C в течение нескольких месяцев.
  9. Добавить 100 мкл хлороформа к образцам, выделенным из гуанидиния-тиоцианат-фенол-хлороформ. Вихрь энергично в течение 10 с. Центрифугируют образцы при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
  10. Перенесите 400 мкл водного слоя в новую пробирку для микроцентрифуги на 1,5 мл. Добавить 800 мкл (2 объема) 100% этанола и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
  11. Перенесите раствор РНК в колонны очистки РНК и восстановите РНК в соответствии с инструкциями производителя, чтобы обеспечить сохранение даже малых РНК. Элюируют РНК в 100 мкл воды, свободной от нуклеазы.
    Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в ​​жидком азоте.

6. Обратное сшивание биотинилированного псоралена

  1. Передача 100 мкл элюированных образцов в лунку 24-луночного планшетаел. Снимите крышку и облучите образец при УФ 254 нм, в течение 5 минут на льду.
  2. Перенесите обратный сшитый образец в чистую микроцентрифужную пробирку. Добавить 10 мкл ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола и осадить РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
    Точка паузы: РНК может быть осаждена в этаноле неограниченно при -20 ° C.
  3. Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки РНК-таблетки.
  4. Центрифуга промывают осадок при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Удалите промывочный буфер и добавьте 4,25 мкл воды, свободной от нуклеазы, для ресуспендирования РНК. Перенесите РНК в пробирку для ПЦР на 0,2 мл.
    Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в ​​жидком азоте.

7. Обратная транскрипция и циркуляция кДНК

  1. Добавить 0,75 мкл(0,5 мкг / мкл) к ресуспендированному образцу в пробирке с ПЦР и нагреванию до 80 ° С в течение 90 с. Поместите образец на лед в течение 2 мин.
  2. Добавьте буферы к денатурированному образцу для 3 'лигирования адаптера, согласно таблице 4 . Инкубируйте реакцию при 25 ° С в течение 2,5 ч.
  3. Перенесите реакцию в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Добавьте к реакционной смеси 90 мкл воды, свободной от нуклеазы, затем 10 мкл ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола. Осаждают РНК при -20 ° C в течение не менее 1 часа или в течение ночи.
    Точка паузы: РНК может быть осаждена в этаноле неограниченно при -20 ° C.
  4. Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки РНК-таблетки.
  5. Центрифуга промывают осадок при 20000 g в течение 15 мин при 4 ° C. Удалить промывочный буфер ресуспендируют осадок в 5 мкл без нуклеазы wАтер.
  6. Добавьте 5 мкл красящего красителя РНК к извлеченной РНК в микроцентрифужной пробирке. Нагревают РНК красителем для загрузки РНК при 95 ° С в течение 3 мин и помещают его на лед в течение 2 мин.
  7. Добавьте 3 мкл красящего красителя РНК к 0,25 мкл ДНК-лестницы 10 нт в микроцентрифужной пробирке. Нагревают лестницу при 95 ° С в течение 3 мин и помещают ее на лед в течение 2 мин.
  8. Выполните фракционирование по размеру с использованием 8,6 см х 6,8 см 6% TBE гель-мочевины, как на этапах 3.3 и 3.4.
  9. Визуализируйте гель, окрашенный пятном нуклеиновой кислоты, используя трансиллюминатор, и нарежьте полоску геля, соответствующую 110-140 нт на лестнице. Перенесите ломтик геля в проколотую пробирку для микроцентрифугирования объемом 0,6 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и следуйте протоколу, указанному на шагах 3.6-3.9.
  10. Добавьте 5 мкл свободной от нуклеазы воды для повторного суспендирования РНК-гранул. Перенесите РНК в пробирку для ПЦР на 0,2 мл.
    Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в ​​жидком азоте.
  11. Добавить 1 мкл праймера RT при 1,2581; М к РНК в пробирке ПЦР и нагревают при 80 ° С в течение 2 мин. Поместите образец на лед в течение 2 мин.
  12. Добавьте буферы для обратной транскрипции в соответствии с Таблицей 5 . Инкубируйте реакцию при 50 ° С в течение 30 мин.
  13. Добавить 1,1 мкл 1 N NaOH к реакции и нагревать при 98 ° C в течение 20 мин. Поместите реакцию на лед.
  14. Перенесите реакцию в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Добавьте к реакционной смеси 90 мкл воды, свободной от нуклеазы, затем 10 мкл ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола. Осаждают ДНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
    Точка паузы: ДНК может быть осаждена в этаноле неограниченно при -20 ° C.
  15. Центрифуга осажденной ДНК при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения ДНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки ДНК-осадка. Центрифуга промывают осадок при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Удалите промывочный буфер, ресуспендируйте егоВпустить в 5 мкл свободной от нуклеазы воды.
  16. Выполните фракционирование по размеру с использованием 8,6 см х 6,8 см 6% TBE гель-мочевины, как на этапах 3.3 и 3.4.
  17. Визуализируйте пост-окрашенный гель с помощью трансиллюминатора и нарежьте срез геля, соответствующий 200-240 нт на лестнице. Обратная транскрибированная кДНК теперь на 96 оснований длиннее, чем фрагмент РНК, благодаря добавлению праймера 96 оснований RT. Перенесите срез геля в проколотую пробирку для микроцентрифугирования объемом 0,6 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
  18. Центрифуга гель разрезает на 12000 xg при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы нарезать ломтик геля и собрать его в 2 мл микроцентрифужной пробирке. Откажитесь от пустой пробирки для микроцентрифугирования 0,6 мл.
  19. Добавить 700 мкл буфера для элюции в измельченный срез геля в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл и инкубировать при 37 ° С в течение 2 часов при постоянном вращении. Следуйте протоколу, как описано в шагах 3.7- 3.8.
  20. Добавьте 6 мкл воды, свободной от нуклеазы, для ресуспендирования ДНК-осадка. Перенесите ДНК в пробирку для ПЦР на 0,2 мл.
    Точка паузы: ДНК можно хранить при -80 ° C после замораживания вспышкой в ​​жидком азоте.
  21. Добавьте буферы к реакции для циркуляции кДНК, согласно таблице 6 . Инкубируйте реакцию при 60 ° С в течение 1 ч и нагревайте при 80 ° С в течение 10 мин для инактивации реакции.
  22. Перенесите реакцию в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Очистите кольцевую кДНК, используя колонку для очистки ДНК, следуя инструкциям производителя. Добавьте 20 мкл воды, свободной от нуклеазы, в колонку для элюирования очищенной кДНК.
    Точка паузы: ДНК может храниться при -20 ° C в течение нескольких месяцев.

8. ПЦР-амплификация (ПЦР с малым весом)

  1. Добавьте буферы к реакции согласно таблице 7 для ПЦР-амплификации, чтобы проверить минимальное количество циклов, необходимое для амплификации библиотеки.
  2. Настройте условия циклизации PCR в соответствии с таблицей 8 . Приостанавливают реакцию и переносят 5 мклРеакцию ПЦР при 10, 15 и 20 циклах, в отдельные пробирки для микроцентрифугирования объемом 1,5 мл.
  3. Добавьте 1 мкл 6x красящего ДНК-красителя к каждой из 5 мкл реакции ПЦР в разные циклы. Выполните гель-электрофорез на 3% агарозном геле при 120 В в течение 1 часа для визуализации продуктов ПЦР.
    1. Используйте наименьшее число циклов ПЦР (Y), которые показывают амплификацию на уровне около 250 оснований (на рисунке 3 имеется сильная полоса при 15 циклах амплификации и слабая полоса при 10 циклах). 12 циклов ПЦР большого размера вероятнее всего Генерируют достаточно материала для глубокого секвенирования, так как количество используемой кДНК в 10 раз больше, чем при ПЦР небольшого масштаба).

9. ПЦР-амплификация (крупномасштабная ПЦР) и очистка

  1. Добавьте буферы к реакции согласно таблице 9 для ПЦР-амплификации для крупномасштабной ПЦР.
  2. Настройте условия циклизации PCR в соответствии сТаблица 10 .
  3. Добавьте 5 мкл 6x красящего ДНК-красителя к 25 мкл реакции ПЦР и загрузите в лунку 3% агарозного геля. Загрузите 1 кб плюс лестницу ДНК в отдельную лунку. Выполните гель-электрофорез при 100 В в течение 1,5 ч.
  4. Визуализируйте законченный гель, используя УФ-трансиллюминатор.
  5. Размер экстракта гель срез, содержащий ПЦР-продуктов из 200-300 оснований и передачи гель чистую 2 мл микроцентрифужной трубки.
  6. Добавить 1 мл буфера для растворения геля из набора для экстракции ДНК-геля на срез геля и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин или до тех пор, пока гель не будет растворяться с постоянным перемешиванием.
  7. Добавить 200 мкл изопропанола в растворенный гель и хорошо перемешать с помощью пипетки. Передача 700 мкл образца в колонку для очистки ДНК гель-экстракции и центрифугирование при 13000 мкг в течение 30 с. Продолжайте перенос растворенного образца в колонку до тех пор, пока весь образец не будет загружен в колонку.
  8. Добавить 500 мкл буфера для гелеобразования,С последующим добавлением 700 мкл буфера для промывки колонки, в колонку, в соответствии с протоколом изготовителя. Добавьте 12 мкл воды, свободной от нуклеазы, в центр колонки, чтобы ускользнуть от ДНК. Точка паузы: ДНК может храниться при -20 ° C.
  9. Количественное определение концентрации ДНК с использованием флуориметрического количественного определения. Если несколько библиотек сконструированы и объединены вместе для упорядочивания, добавьте равное количество каждого образца в пул для последовательности высокой пропускной способности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1 показана схема рабочего процесса SPLASH. После добавления биотинилированного псоралена в присутствии 0,01% дигитонина и УФ-сшивки из клеток экстрагируют общую РНК и проводят дот-блот, чтобы обеспечить эффективное сшивание биотинилированных с ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы подробно опишем экспериментальный и вычислительный рабочий процесс для SPLASH, метод, который позволяет нам идентифицировать парные взаимодействия РНК в геномо-широкой манере. Мы успешно использовали SPLASH в бактериальных, дрожжевых и человеческих культурах и ожидаем, что эта ст?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим членов лаборатории Wan и лаборатории Nagarajan за содержательные обсуждения. Финансирование NNARARAN поддерживается A * STAR. Y.Wan поддерживается при финансовой поддержке A * STAR и Общества в науке - стипендии Бранко Вайсс.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026DNA ladder
10 bp DNA ladderLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015DNA ladder
20% SDS solutionFirst BASEBUF-2052-1L  
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate SolutionFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2  Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1Bio-Rad1610145TBE Urea gel component
Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade  PromegaV3131 TBE Urea gel component
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
ChloroformMerck1.02445.1000RNA extraction
Single strand DNA ligaseEpicentreCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filtersSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINESigma-AldrichD5628-1GFor cell treatment
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X TransilluminatorBlue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beadsLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL HitachiF8T5/BL 365 nm UV bulb
Fetal Bovine SerumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106  Components of Hela medium
FormamidePromegaH5052  Component in hybridization buffer
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm UV bulb
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Required for nucleic acid precipitation
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water First BASEBUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin  Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122  Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1New England BiolabsE7335L PCR primers
DNA Gel Extraction KitQIAgen28106QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kitLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kitQiagen74106RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase InhibitorLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Reverse transcriptaseLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201LEnd repair enzyme
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373LEnzyme for adaptor ligation
TemedBio-Rad1610801TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reagent for RNA extraction
UreaFirst BASEBIO-2070-5kg  
UV crosslinkerStratagene400072UV Stratalinker 1800
UV TransilluminatorUVP95-0417-01For visualizing of bands
Xylene Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
DNA cleanup itZymo Research D4004Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK scriptAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence:
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

Ссылки

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены