Эффективное Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; панкреатических Предшественники

Здесь мы опишем протокол 4 этапа к дифференцировке эмбриональных стволовых клеток человека к NKX6-1 ⁺ панкреатических клеток - предшественников в пробирке. Этот протокол может быть применен к различным плюрипотентных стволовых клеточных линий человека.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью самостоятельно возобновлять и дифференцироваться в нескольких родословных, что делает их привлекательным источником для генерации панкреатических клеток-предшественников, которые могут быть использованы для изучения и дальнейшего лечения сахарного диабета. В данной статье рассматривается протокол дифференциации четыре этапа, предназначенный для создания панкреатических клеток-предшественников из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Этот протокол может быть применен к ряду человеческого плюрипотентных стволовых клеток (HPSC) линий. Подход, используемый для создания панкреатических клеток-предшественников, чтобы дифференцировать ЭСК точно моделировать основные этапы развития поджелудочной железы. Это начинается с индукцией окончательного эндодермы, что достигается посредством культивирования клеток в присутствии активин A, базовый фактор роста фибробластов (bFGF) и CHIR990210. Дальнейшая дифференциация и структурирование с фактор роста фибробластов 10 (Fgf10) и Dorsomorphin формирует клетки, напоминающие задней кишки. Добавление Сетчаткаовая кислота, башка, САНТ-1 и FGF10 различает клетки задней передней кишки в клетки поджелудочной железы, характерных энтодермы. И, наконец, сочетание эпидермального фактора роста (EGF), никотинамид и Noggin приводит к эффективной генерации Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ клеток. Проточная цитометрия проводится для подтверждения экспрессии специфических маркеров на ключевых этапах развития поджелудочной железы. В Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ панкреатические клетки - предшественники в конце 4 -й стадии, способные генерировать зрелые бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей и может быть дополнительно дифференцированы , чтобы генерировать инсулин-продуцирующие клетки в пробирке. Таким образом, эффективная генерация Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ панкреатические клетки - предшественники, как показано в этом протоколе, имеет большое значение , поскольку она обеспечивает платформу для изучения развития поджелудочной железы человека в пробирке и обеспечивает источник клеток с потенциалом дифференциации в -клетки, которые могли бы Э.В.entually использоваться для лечения сахарного диабета.

Введение

Распространенность сахарного диабета возрастает , и в соответствии с Канадской ассоциации диабета, по оценкам, более 11 миллионов человек , в Канаде являются диабетическая или prediabetic, 5-10% этих лиц , имеющих сахарный диабет 1 типа (СД1) ^1. СД1 является аутоиммунным заболеванием, которое вызывается разрушением продуцирующих инсулин бета-клеток, которые расположены в островках Лангерганса. В настоящее время, люди , живущие с СД1 требуют экзогенных источников инсулина ^2. Несмотря на успехи в инсулинотерапии, у пациентов СД1 продолжают иметь трудное время регулируя уровень глюкозы в крови и продолжают страдать как гипо- и гипергликемии. Перспективной формой лечения для восстановления нормогликемии в СД1 является использование человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые могут быть использованы для создания неограниченный запас инсулина производства бета - клеток , как в естественных условиях и в пробирке ^{^3,} ^4, ^{^5,} ^{^6,} ^7. Дифференциация ЭСК к бета-подобные клетки могли бы сделать возможным изучение диабета в пробирке, что позволяет для идентификации новых терапевтических мишеней для лечения диабета 2 типа и обеспечивают клетки для трансплантации пациентам СД1.

Самая успешная попытка генерации продуцирующих инсулин клеток из ЭСК в пробирке является резюмировать эмбриональных события , которые происходят во время развития поджелудочной железы ^{^4,} ^5. Это включает в себя манипуляции различных сигнальных путей, чтобы точно моделировать основные этапы развивающейся поджелудочной железе. Поджелудочной развития начинается с индукцией окончательного энтодермы, которая характеризуется выражением CXCR4 и CD117 (c-KIT) ^{^8,} ^9. Точное регулирование definitАйв организация энтодермы необходим для формирования кишечной трубки, который затем подвергается передне-к-задней и вентральной-дорсального кучность стрельбы. Спинной и брюшные панкреатические почки выходят из области задней кишки, выражающего поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки гомеобоксный ген (Pdx1), который необходим для развития поджелудочной железы ^10. Спинной и брюшные почки предохранителей , чтобы сформировать поджелудочную железу, которая затем подвергается интенсивному эпителиальной ремоделирования и расширение ^11. Стремление к эндокринную и экзокринной линии сопровождается поколением мультипотентных клеток - предшественников (ПДК) , которые выражают, среди прочего, транскрипционные факторы Pdx1, Nkx6.1 и Ptf1a ^{^12,} ^13. ПДКп , которые станут эндокринные и протоковой клетки продолжают выражать Nkx6-1 при одновременном снижении экспрессии Ptf1a. В противоположность этому, клетки линии преемственности экзокринных потеряет expressioп Nkx6-1 и поддерживать Ptf1a выражение ^12.

Фактор транскрипции Nkx6-1 играет ключевую роль в развитии рака поджелудочной, в частности , во время дифференцировки эндокринных клеток - предшественников к бета - клеток. Как было описано выше, удаление результатов Nkx6-1 в нарушенного формирования бета - клеток поджелудочной железы в процессе развития ^14. Поэтому, создавая производящие инсулин бета - клеток в пробирке и в естественных условиях требует эффективной индукции Nkx6-1.

Недавно мы разработали протокол , чтобы эффективно генерировать Pdx1 ⁺ / NKX6-1 ⁺ панкреатических клеток - предшественников из hPSCs. Эти HPSC полученные из панкреатических прародителей образованием зрелых бета - клеток при трансплантации в иммунодефицитных мышей ^3. Протокол дифференциации можно разделить на 4 этапа характеристику: 1) окончательной индукции энтодермы, 2) задняя передняя кишка структурирование, 3) поджелудочная спецификации и 4) NKX6-1 индукции. Здесь мы приводим подробное описание каждого шага направленной дифференцировки.

протокол

1. Приготовление растворов и средств массовой информации

Примечание: Подготовьте все средства массовой информации для культивирования клеток в стерильной среде. СМИ должны быть сделаны и использованы немедленно. Детали Реагент представлены в таблице материалов.

Дифференциация СМИ
1. Приготовьте день 0 Дифференциация Носитель: RPMI среде с 1% глутамина, 2 мкМ CHIR 99021, 100 нг / мл активин А, 10 ⁴ M MTG.
2. Подготовка День 1-2: дифференцировки RPMI среде с 1% глутамина, 100 нг / мл активин A, 10 ⁴ M MTG, 5 нг / мл bFGF, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
3. Подготовка День 3-5: дифференцировки RPMI среде с 1% глутамина, 1% B27, 10 ⁴ M MTG, 0,75 мкМ Dorsomorphin, 50 нг / мл FGF10.
4. Подготовьте 6-7 сут дифференцировки: DMEM с 1% глутамина, 1% B27, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл FGF10, 0,25 мкМ SANT-1, 2 мкМ ретиноевой кислоты, 50 нг / мл Noggin.
  Примечание: ретиноевойКислота должна быть добавлена в средствах массовой информации в последний раз, и средства массовой информации должны быть защищены от света для предотвращения окислительной деструкции ^15.
5. Готовят день 8-12 дифференцировки: DMEM с 1% глутамина, 1% B27, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл Noggin, 100 нг / мл hEGF, 10 мМ никотинамид.
Подготовка FACS буфера: 10% FBS в PBS, минус кальция и магния.

2. дифференцировке ЭСК

Примечание: HESC оттаивают, пассированные и расширена на облученный мышиных эмбриональных фибробластов в присутствии KOSR сред на основе дополненной bFGF ^16. ЭСК готовы к дифференциации, когда клетки достигают 80-95% слитности. В это время колонии должны быть большими с определенными границами и 'купольного' структуры (Рис . 1А) Вся культура клеток выполняется в плоскодонных, культуры тканей обрабатывали планшеты, покрытые 0,1% желатином. Как правило, клетки выращивают в 6 или12-луночные планшеты, в объемах средств по 2 мл или 1 мл.

В день 0 начинают дифференцировку путем замены KOSR на основе средств массовой информации с дня 0 Дифференциация Media.
В дни 1 и 2, осторожно встряхните пластину, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя до того аспирационных. Заменить на день 1-2 Дифференциация Media.
На 3-й день, урожай клеток для проточной цитометрии. Если клетки экспрессируют более чем на 90% CXCR4 ⁺ / CD117 ^+, перейдите к шагу 2.4.
В те дни, 3 и 5, осторожно встряхните пластину, чтобы удалить мертвые клетки из монослоя до аспирационных. Заменить День 3-5 Дифференциация Media.
В дни 6 и 7, заменить День 6-7 Дифференциация СМИ.
В дни 8, 10 и 12, заменить День 8-12 Дифференциация СМИ.
На 13-й день, урожай клеток для проточной цитометрии для определения Pdx1 и NKX6-1 выражение.

3. Сбор клеток для анализа потока цитометрии

Диссоциируют клетки с1x раствор коммерческий трипсин в соответствии с протоколом производителя и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
Удалить коммерческое решение трипсина и ресуспендируют отдельных клеток в 1000 мкл FACS буфера с 30 мкл ДНКазы I.
Фильтрующие элементы с использованием 35 мкм нейлоновый сетчатый фильтр клеток и перенос в микроцентрифужных трубки.
Центрифуга клетки при 455 мкг в течение 5 мин. Подготовка клетки для живого или любой фиксированной окраски.

4. Окрашивание для проточной цитометрии

Расход препарата для живого окрашивания на 3 -й день
1. Ресуспендируют клеток в 1000 мкл FACS буфера. Передача 200 мкл (приблизительно 1-3 × 10 ⁵ клеток) на две лунки 96-луночного планшета (для обоих неокрашенных и окрашенных образцов).
2. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
3. Пятно с первичными конъюгированные с антителами, CXCR4: APC и CD117: PE (см M aterials таблицу) для 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
4. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
5. Образцы Ресуспендируют в 100 мкл FACS буфера.
6. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
7. Ресуспендируют каждого образца и перенос в общем объеме 300-500 мкл FACS буфера для 1 мл микропробирок или 5 мл с круглым дном пробирки.
8. Выполнить образцов на проточном цитометре ^17. Если образцы не могут быть запущены сразу же, хранят при температуре 4 ° С в защищенном от света.
Расход препарата для фиксированного окрашивания на 13 -й день
1. Ресуспендируют осадок клеток в коммерческом растворе фиксации / пермеабилизации в течение 24 ч при температуре 4 ° С.
2. Центрифуга образца при 455 х г в течение 5 мин. Ресуспендируют в 400 мкл раствора Пермь / промывочного.
3. Передача 200 мкл образца (приблизительно 0,5-1 × 10 ⁶ клеток) к ТВтO лунки 96-луночного планшета (для IgG контроля и Pdx1 / NKX6-1 окрашивания). Центрифуга при 931 мкг в течение 2 мин.
4. Ресуспендируют гранул клеток в 100 мкл раствора Пермь / промывочного содержащего анти-Pdx1 и анти-NKX6-1 антитела первичного или изотипа контроля (см Материалы таблицу). Инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
5. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета. Образцы Ресуспендируют в 100 мкл раствора Пермь / промывочного.
6. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
7. Ресуспендируют образцы в 100 мкл / Пермь Wash, содержащие вторичные антитела, при комнатной температуре в течение 1 ч, защищенном от света месте.
8. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
9. Образцы Ресуспендируют в 100 мкл Пермского / промывочного раствора.
10. Центрифуга пластину на 931. х г в течение 2 мин. Удалить супернатант опрокидыванием планшета.
11. репседят шаг 4.2.9 и 4.2.10.
12. Ресуспендируют каждого образца и перенос в общем объеме 300-500 мкл FACS буфера для 1 мл микропробирок или 5 мл с круглым дном пробирки.
13. Выполнить образцов на проточном цитометре ^17. Если образцы не могут быть запущены сразу же, хранят при температуре 4 ° С в защищенном от света.

Результаты

Эффективная генерация панкреатических клеток - предшественников опирается на правильный рост и поддержание недифференцированных клеток с последующим точным добавлением специфических сигнальных молекул во время протокола дифференцировки, как показано на схеме на ...

Обсуждение

Успешно генерации NKX6-1 ⁺ панкреатических клеток - предшественников из hPSCs в пробирке основана на использовании высоких культур качества hPSCs и направленной дифференцировки , включающих точное регулирование конкретных сигнальных путей , которые регулируют основные этапы разв?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта рукопись была поддержана финансирование из Торонто общего и Западного Фонда и Высшей премии Бантинг и Лучший Диабет Центр-университет сеть здравоохранения.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419