Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM

Резюме

Здесь мы приводим протокол для мозаичной техники маркировки, которая позволяет визуализировать нейронов, полученных из общей клетки-предшественника в двух различных цветах. Это облегчает нейронную анализ клонов с возможностью рождения-знакомства отдельных нейронов и изучения функции гена в одних и тех же нейронов разных людей.

Аннотация

M osaic в НАЛИЗ с г epressible с ELL м arker (MARCM) является положительным система маркировки мозаики, которая широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований , чтобы изобразить сложные морфологию и манипулировать функции генов в подмножества нейронов в противном случае без опознавательных знаков и невозмущенной организмы. Генетические мозаики, генерируемые в системе MARCM опосредуется через сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами в пределах деления клеток-предшественников, чтобы производить как отмеченные знаком (MARCM клоны) и немаркированные дочерние клетки во время митоза. Расширение метода MARCM, называемый твин-спот MARCM (tsMARCM), этикетки и сдвоенных клеток, полученных от общего предка с двумя разными цветами. Этот метод был разработан для того, чтобы извлекать полезную информацию из обоих Hemi-родословных. Путем всестороннего анализа различных пар tsMARCM клонов, система tsMARCM позволяет высокого разрешения нейронального происхождения MAPPINг выявить точное порядка рождения меченых нейронов, полученных из обычных клеток-предшественников. Кроме того, система tsMARCM также расширяет исследования функции гена, позволяя фенотипический анализ идентичных нейронов различных животных. Здесь мы опишем , как применять систему tsMARCM , чтобы облегчить изучение развития нервной системы у дрозофилы.

Введение

Мозг, состоящий из огромного количества разнообразных и типов нейронов, жертвует животных со способностью воспринимать, обрабатывать и реагировать на вызовы от внешнего мира. Нейроны взрослого Drosophila центрального мозга получают из ограниченного количества нервных стволовых клеток, называемых нейробласты (NBS), в течение развития ^{1, 2.} Большинство НБС участвующих в нейрогенез головного мозга у дрозофилы проходят асимметричное деление для генерации самообновляющихся NBS и ганглий материнские клетки (GMCS), и GMCs затем пройти через еще один раунд разделения , чтобы произвести две дочерние клетки , которые дифференцируются в нейроны ³ (рис 1А ). Из-за запутанности нейронного морфологии и проблемы, связанные с определением конкретных нейронов, положительно мозаичную технологии маркировки, мозаика анализ с репрессируемый клеток маркером (MARCM), был изобретен для того, чтобы visualizatион одного нейрона или небольшой группы нейронов из популяции окружающих, немеченых нейронов ^4.

MARCM использует флиппазы (FLP) / ФЛП целевой системы распознавания (FRT) посредничать сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами внутри клетки - предшественника разделяющая несущего гетерозиготную аллель гена репрессора, экспрессия которого обычно ингибирует экспрессию гена - репортера ^4. После того, как митотического деления, рекомбинантные хромосомы разделены на близнецов клетки, таким образом, что одна клетка содержит гомозиготные аллели гена репрессора и другая ячейка не имеет репрессор гена-экспрессию репортера в этой ячейке (и его потомков) больше не является ⁴ заблокирован. Три клоновых узоры обычно встречаются в MARCM эксперименте, когда ФЛП стохастически индуцируется в NBS или ГМО: одноклеточные и двухкамерные-GMC клоны, которые изображают нейронную морфологию в одноклеточных Resolutioп, и многоклеточные-NB клонов, раскрывающие целые морфологические закономерности нейронов , происходящих от общего NB (рис. 1В) Методика MARCM широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований, в том числе в идентификации нейронов типа для реконструкции мозга по всей проводки сетей, нейронная линия анализа для раскрытия истории развития нейронов, фенотипической характеризации генов функций , участвующих в спецификации клеточных судеб, и нейронный морфогенез и дифференциация изучает ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Поскольку обычные MARCM только этикетки одну из двух дочерних клеток (и родословных) после индуцированного события митотической рекомбинации, потенциально полезной информации от немаркированной стороны теряется. Это ограничение исключает применение основного МСистема ARCM с высокой разрешающей способностью анализа многих нейронных линий , которые переключают клеточные судьбы в быстром темпе или точности анализа функций генов в одинаковых нейронов различных животных ^{11, 12.}

Twin-спот MARCM (tsMARCM) представляет собой развитую систему , которая маркирует нейроны , полученные от общего предка с двумя различными цветами, что делает возможным восстановление полезной информации с обеих сторон близнецов клеток, таким образом преодолевая ограничения исходной системы MARCM ¹¹ ( Фигура 2А - 2С). В системе tsMARCM, две РНК - интерференция (RNAi) основе супрессоры расположены в транс-сайтов гомологичных хромосом в клетке - предшественника, и экспрессию этих супрессоров независимо друг от друга ингибируют экспрессию соответствующих репортеров (Фигура 2В). После сайт-специфической рекомбинации митотического опосредованное через систему FLP / FRT, то ТВто RNAi основе супрессоры стали разделены на две односпальные клетки , чтобы разрешить экспрессию различных репортеров (рис 2В). Два клоновых модели, одноклеточные , связанные с одноклеточных клонах и двуклеточной-GMC , связанных с многоклеточным-NB клонов, как правило , рассматривается в эксперименте tsMARCM (рис 2C). Информация, полученная от одной стороны сдвоенных ячеек могут быть использованы в качестве ссылки на другую сторону, что позволяет с высокой разрешающей способностью анализов нейронального происхождения, такие как рождение датирующим меченых нейронов, и фенотипический анализ идентичных нейронов у различных животных для точного расследования нейронной функции гена ^{11, 12.} Здесь мы приводим протокол шаг за шагом , описывающий , как провести эксперимент tsMARCM, который может быть использован в других лабораториях , чтобы расширить свои исследования развития нервной системы (а также развитие других тканей, если это применимо) у дрозофилы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Построить tsMARCM готовый Мухи с использованием требуемой трансгенов ^{11, 13}

1. Сформировать оригинальную версию tsMARCM-готовых мух от трансгенов, которые выполняются отдельными мухами ¹¹ (таблица 1). Проведение стандартных генетических схем пересечения летать, которые были описаны ранее, путем ввода нескольких трансгенов в одних и тех же мух акций ^13.
   1. В одной родительской линии, собрать трансгены FRT ^40а, UAS-mCD8 :: GFP (первый репортер, mCD8 :: GFP, экспрессия трансгена под контролем промотора вверх по течению последовательности активации, которая производит мембранную-привязанными репортер кластера мыши дифференциации 8 белка , слитого с белком зеленого флуоресцентного) и UAS-rCD2RNAi (супрессора , который ингибирует экспрессию второго репортера, а RNAi против экспрессии кластера крысы Oе дифференциация 2, rcd2) на левой руке на 2 - ^й хромосомы. Место тканеспецифическая драйвер -GAL4 на X или 3 - ^й хромосомы, если это возможно.
   2. В другой родительской линии, собрать трансгены FRT ^40А, УАС-rCD2 :: RFP (второй репортер, rCD2 :: RFP, другая мембрана-привязи репортер , состоящий из rCD2 белка , слитого с красным флуоресцентным белком) и UAS-GFPRNAi (супрессор , который ингибирует экспрессию mCD8 :: GFP, а RNAi против экспрессии GFP) на левой руке на 2 - ^й хромосомы. Поместите теплового шока (ГВ) -FLP или тканевую-ФЛП на специфичность Х или 3 - ^й хромосомы, если это возможно.
2. Сформировать новую версию tsMARCM-готовых мух от трансгенов, которые выполняются отдельными мухами ¹⁴ (таблица 1). Проведение стандартных схем летать генетические пересечения, которые были описаны рreviously, путем ввода нескольких трансгенов в одних и тех же мух акций ^13.
   1. В одной родительской линии, собрать трансгены на сайте FRT и UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (комбинированный трансгеном mCD8 :: GFP и глушителем , который ингибирует экспрессию rCD2 :: RFP) вместе в одной руке 2 - ^й или 3 - ^й хромосомы (соответствующие пары трансгены FRT и UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i указаны в таблице 1). Поместите драйвер тканеспецифическая-GAL4 , отличных хромосому выбранного участка FRT, если это возможно хромосом.
   2. В другой родительской линии, собрать трансгены на сайте FRT и UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (другой комбинированной трансгеном rCD2 :: RFP и глушителем , который ингибирует экспрессию mCD8 :: GFP) в той же руке 2 - ^го или 3 - ^й хромосомы (соответствующие пары трансгены FRT и УАС-rCD2.RFP.UAS-GFPi указаны в таблице 1). Место HS-FLP или тканеспецифическая-ФЛП на отличных хромосому выбранного участка FRT, если это возможно хромосом.

2. Крест tsMARCM готовых Мухи для генерации tsMARCM Клоны в их потомству

1. Кросс-tsMARCM готовые мухи вместе (например, положить 10-15 самцов мух от стадии 1.1.1 или 1.2.1 и 20-30 девственной самки мух от стадии 1.1.2 или 1.2.2 вместе) во флаконе-муха пищи со свежим -Made дрожжи пасты на стенке флакона.
2. Поддерживать скрещенные tsMARCM готовые мух при 25 ° С в течение 2-х дней, чтобы повысить шансы на спаривание до сбора оплодотворенных яиц.
3. Часто передавать скрещенные tsMARCM-готовые мух в свеже дрожжевого флаконы, чтобы избежать скученности (нажмите вниз мух или использовать углекислый газ обезболить мух для облегчения передачи; держать не более 80-100 оплодотворенных яиц в 10 мл FLY-пищи с помощьюл, чтобы избежать слишком много вылупившихся личинок).
4. Культура животных tsMARCM (т.е. оплодотворенные яйца; пример генотипа tsMARCM животных, используемый на рисунке 3, является HS-ФЛП ^[22], ж / д, УАС-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40А , GAL4-GH146 / БАС-rCD2 :: ЗП, УАС-GFPRNAi, FRT ^40A + +) , которые были заложены в серийно передаваемых флаконах при температуре 25 ° с , пока они не развиваются до желаемых стадий (например, эмбрионов, личинок, или куколки).
5. Поместите переданные флаконы, которые содержат tsMARCM животных на той же стадии развития в ванну с 37 ° C водой в течение 10, 20, 30, 40 и 50 мин, чтобы определить оптимальное время теплового шока, который индуцирует экспрессию ФЛП для генерации tsMARCM клоны интерес. Пропустить этот шаг , если ткань-ФЛП специфичность используется в эксперименте tsMARCM (HS-ФЛП является предпочтительным для нейронной линии анализа, причины этого предпочтения были описаны ранее ¹⁵).
   Примечание: Повторите шаг 2,5, используя оптимальное время теплового шока в будущих экспериментах tsMARCM если больше tsMARCM клоны интерес хотели; как правило, более ФЛП экспрессия индуцируется в HS-FLP ^[22] по сравнению с ГВ-ЛПФ ^[1] с тем же время теплового шока.
6. Культура не в тепловому шоку tsMARCM животных при 25 ° С до тех пор, как они достигли соответствующего стадии развития, а затем перейти к шагу 3.

3. Подготовка, Пятно, и горы Fly Мозги Содержащие tsMARCM Клоны

1. Готовят блюда щипцов-защиты. Смешать части А (30 г) и части В (3 г) Kit силиконового эластомера с активированным углем (0,25 г). Вылейте смесь в соответствующие блюда.
2. Dissect личиночной, пупальный или взрослых мозги животных tsMARCM в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) с помощью щипцов на блюдо пинцеты защиты от рассматривании через микроскоп рассечение. Примечание: Протокол для рассечения муха мозга была убываниеribed ранее ^16.
3. Закрепить Муха мозги в стеклянной пластине с точечной 1X PBS, содержащего 4% формальдегида при комнатной температуре в течение 20 мин. Процесс Муха мозги в этой стеклянной пластине пятна на оставшуюся часть шагов.
4. Полоскание муха мозги три раза 1% PBT (1x PBS, содержащего 1% Тритон Х-100) и промойте их три раза в течение 30 минут каждый 1% PBT (полоскание: удалить PBT и добавлять новые PBT быстро, мыть: удалить PBT, добавить новый PBT и инкубировать муха мозги в новом ПБТ, используя орбитальный шейкер).
5. Выдержите Муха мозги со смесью первичных антител в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре. Примером смеси первичных антител крысы анти-CD8 антител (1: 100), анти-кролик DsRed антитела (1: 800), и мышиное анти-Bruchpilot (Brp) антитело (1:50) в 1% PBT, содержащий 5% нормальной козьей сыворотки (NGS).
6. Промыть Муха мозги три раза с помощью 1% PBT, а затем промыть их три раза в течение 30 мин каждый с 1% PBT.
7. Выдержите Муха мозги со смесью вторичными антителами в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре. Примером смеси вторичных антител IgG антитела козы к антигенам крысу, конъюгированного с зеленым флуоресцентным красителем (1: 800), козы против кроличьего IgG антител, конъюгированных с желто-флуоресцентный краситель (1: 800), и козы против мыши IgG-антитела, конъюгированного с дальним красным-флуоресцентный краситель (1: 800) в 1% PBT, содержащем 5% NGS.
8. Промыть Муха мозги три раза с помощью 1% PBT, а затем промыть их три раза в течение 30 мин каждый с 1% PBT. Установите их на микро слайд с реагентом анти-закаливания. Положите микро покровного стекла на микро слайд, чтобы покрыть и защитить муха мозги. Печать края микро покровного стекла и микро слайд, используя ясный лак для ногтей. Храните эти смонтированы и запечатаны полететь образцов мозга при 4 ° С.

4. Возьмите, обработки и анализа флуоресцентных изображений tsMARCM Клонов

1. Захват флуоресцентных изображений tsMARCM клонов фром образцы, созданный на шаге 3.8 с помощью конфокальной микроскопии системы выбора.
2. Стеки Проектные tsMARCM конфокальной флуоресцентных изображений в двумерную, сплющенные изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений , поставляемый с конфокальной системой микроскопии выбора (см Рисунок 3B - 3E, 3G - 3J, 3л - 3О и 3 - й квартал - 3Т примеры сплющенные софокусные флуоресцентные изображения).
3. Подсчитайте количество клеток в многоклеточные-NB сторонах клонов tsMARCM с использованием программного обеспечения для обработки соответствующего изображения (например, функцию "Счетчик клеток" в ImageJ ^17, см Рисунок 3E, 3J, 3О и 3Т примеры клетки тела нейронов).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Система tsMARCM была использована для облегчения нейронального происхождения анализов и исследований функции генов путем извлечения важной информации о нейронов, происходящих от общих NBS. Система была использована для идентификации большинство (если не все) нейронные ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Шаги 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, 3.2 и имеют решающее значение для получения хороших результатов tsMARCM. Тканеспецифические драйверы -GAL4 , которые не экспрессируют GAL4 в нервных клеток - предшественников являются предпочтительными для стадий 1.1.1 и 1.2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones