JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описан способ измерения аллореактивности в смешанной популяции Т-клеток с использованием проточной цитометрии изображений.

Аннотация

Измерение иммунологической реактивности к антигенам доноров, у реципиентов трансплантата, вероятно, будет решающим для успешного снижения или отмены иммуносупрессии. Неоднозначную реакцию лейкоцитов (MLR), предельное разведение пробы, и транс-виво гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) анализа все были применены к этому вопросу, но эти методы имеют ограниченную предсказательную способность и / или существенные практические ограничения , которые уменьшают их полезность. Изображений проточной цитометрии является метод, который сочетает в себе многопараметрических количественные полномочия проточной цитометрии с возможностями обработки изображений флуоресцентной микроскопии. Недавно мы использовали в проточной цитометрии подхода визуализации для определения доли реципиентов Т-клеток, способных к образованию зрелых иммунным синапсов с донорскими антигенпрезентирующими клетками (АРС). Использование хорошо охарактеризованных мыши модели по пересадке сердца, мы показали , что частота в пробирке иммунных синапсов между Т-APC MembrАНЭ контактные события сильно предсказал исход аллотрансплантата в отторжении, толерантности, и ситуации, где выживание трансплантата зависит от индуцированных регуляторных Т-клеток. Частота Т-APC контактов увеличивается с Т-клетками от мышей во время острого отторжения и уменьшается с Т-клетками от мышей, оказываемой невосприимчивы к Аллоантигену. Добавление регуляторных Т - клеток к системе в пробирке уменьшается длительные контакты Т-APC. Чрезвычайно важно, этот эффект также был отмечен с человеческим поликлонально расширенной, встречающихся в природе регуляторных Т-клеток, которые, как известно, контролируют отторжение тканей человека в гуманизированных мышиных моделях. Дальнейшее развитие этого подхода может позволить более глубокой характеристику аллореактивного Т-клетки в отсеке реципиентов. В будущем, дальнейшее развитие и оценка этого метода с использованием человеческих клеток может служить основой для анализов, используемых для отбора пациентов для минимизации иммуносупрессии, и он может быть использован для измерения воздействия tolerogenIC терапии в клинике.

Введение

Твердые трансплантации органов превратило уход за пациентами с терминальной стадии заболеваний почек, печени, сердца и легких. Из-за различий в основных и второстепенных антигенов гистосовместимости, однако, Аллотрансплантаты незамедлительно отвергнуто реципиентов Т-клетками, если иммунодепрессанты не используются. Эти агенты имеют многочисленные неблагоприятные последствия, в том числе риски для рака и органной дисфункции. Поэтому основная клиническая цель состоит в том, чтобы снизить дозу иммуносупрессии до минимального уровня, необходимого для предотвращения отторжения трансплантата. Этот уровень может меняться в зависимости от степени активации врожденной иммунной системы; степень донор-реципиент несоответствия аллоантигена; и различия между пациентом в иммунной функции, фармакокинетики, фармакодинамики и.

К сожалению, врачи пересадки не имеют каких - либо инструментов для точной оценки донорской реактивности у отдельных пациентов 1. смешанныйРеакция лейкоцитов (MLR) может обнаружить донор реактивность, но он не может надежно предсказать исход трансплантата 2, 3. Лимитирующее разведение, анализы цитокин ELISPOTs, и транс-виво анализ либо измерить ограниченный диапазон ответов или не практичны 4, 5, 6, 7, 8 профилей экспрессии .Gene выявили сигнатур , связанные с оперативной толерантностью 9, 10, 11, 12 и отторжение 13, 14, 15, но это не всегда обобщенные по населению 16 и в конечном счете , может иметь ограниченную полезность в отдельных пациентах. Последовательность на основе AnalyГОС Т-клеточного рецептора (TCR) Т - клеток в периферической крови 17 или пролиферирующих в MLR 18 также были разработаны , но требуют дальнейшей проверки.

Концептуально, было бы желательно иметь анализ, который обнаруживает самые ранние шаги необходимые в активации Т-клеток реципиента с помощью антигена донора. Поскольку культивирования клеток в течение нескольких дней (как в MLR) можно ввести артефакты, такой тест, в идеале, не требуют измерений последующих событий, например, пролиферации или эффекторной функции. В равной степени, однако, было бы также желательно, чтобы тест, чтобы зависеть от некоторого элемента функции Т-клеток, так как чисто описательных оценок (Например, TCR - секвенирование) может быть не в состоянии различать анергические и функциональные Т - клетки.

Многочисленные исследования показали, что длительный Т-АРС контакт необходим для формирования иммунного синапса, который является важным первымшаг в ответ Т-клеток 19, 20, 21, 22. Мы недавно сообщили , что во время динамического в пробирке время покадровой обработки изображений, около 5 - 10% от мыши CD4 + Т - клетки образуют длительные контакты с аллогенной полученных из костного мозга дендритных клеток (BMDCs) 23. Частота длительного контакта была увеличена у животных, отклоненных трансплантата, тогда как у мышей , ранее оказываемых толерантными к тем же антигены, она оставалась на уровне видели в untransplanted мышей 23. Продолжительные взаимодействия были уменьшены в присутствии получателя Tregs и увеличение в их отсутствие, и мы наблюдали подобные явления с помощью Т - клеток человека и аллогенных моноцитов ДК (MoDCs) 23.

Тем не менее, перечисление длительных контактов сделано в поликлональном Т-клеток populatioп отнимает много времени и трудоемким. Поэтому мы сделали использование изображений проточной цитометрии для изучения формирования аллогенного иммунного синапса. Изображений проточной цитометрии включает в себя многопараметрических сбора и анализа данных, возможности обычного проточной цитометрии с возможностями визуализации одноклеточного флуоресцентной микроскопии. Эта техника была использована другими исследователями для изучения формирования иммунного синапса с помощью моноклональных Т - клеток 24, 26, 27 или в присутствии суперантигенов 28. В таких условиях, однако, частота реагирующих Т - клеток в диапазоне от 30-100%, в то время как аллореактивные Т - клетки , как правило , по оценкам, представляют 5-15% от общего репертуара Т-клеток 29, 30, 31, 32. Важно отметить, что мы показали, что поток изображений цитометрии может производить аиERy сопоставимой мера аллореактивных частот Т-клетки 23 и что изменения в частоте синапса внутри популяции Т-клеток поликлональной позволяют прогнозировать исход трансплантата 23. В настоящее время этот подход был оптимизирован для измерения прямой аллореактивности CD4 + Т - клеток, но, в принципе, также могут быть разработаны для изучения CD8 + Т - клеток , и косвенный путь. Косвенное аллореактивность , как полагают, становится все более актуальным при более длительном времени после трансплантации 33. Мы в настоящее время разрабатываем этот метод, чтобы использовать клетки человека, что позволит для тестирования больных. Таким образом, в будущем, общий подход может быть полезен для функциональной оценки Т-клеточных реакций в реципиентов трансплантата перед трансплантацией; сразу же после трансплантации; и в долгосрочной перспективе, когда минимизация наркотиков становится важной задачей.

протокол

1. Подготовка реагентов и материалов, необходимых

  1. Приготовьте фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащую 2% фетальной телячьей сыворотки (FBS) ( "промывочный буфер"). Подготовьте PBS с 2% FCS, содержащим 0,1% неионного детергентом ( «завивка-промывочный буфером», см Таблицы материалов). Подготовьте PBS с 1,5% формальдегида.
    Примечание: ВНИМАНИЕ! Формальдегид вызывает коррозию и потенциально канцерогенный и должен быть обработан во время ношения соответствующих средств индивидуальной защиты.
  2. Подготовьте PBS, содержащей 2% FBS и 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТ) для разделения магнитных клеток ( «MCS буфера»).
  3. Подготовьте 50 мкг / мл фаллоидин-изотиоцианат флуоресцеина (фаллоидин-FITC) в диметилсульфоксиде (ДМСО). Подготовьте 1 мг / мл , окрашивающим ядра (например , 1 мг / мл 7-aminoactinomycin D (7-ААР) в ДМСО или бис-benzimide красителя, см Таблицу материалов) в ДМСО. Подготовка Флуорохром меченных антител подходит для клеток, представляющих интерес иформирования изображения проточной цитометрии.
  4. Получение тканей животных (например, лимфатические узлы и селезенка) в качестве источника Т - клеток и тканей аллогенных животных (например, селезенка и костного мозг) в качестве источника антигена-представляющих клеток или клеток - предшественников.
  5. Подготовка культуральной среды клеток (например, средний институт Memorial Roswell Park (RPMI) 1640 или Дульбекко Модифицированная Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% FBS), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, пенициллин, и стрептомицин и получить 24- и / или 96- луночные культуральные планшеты.

2. Приготовить антиген-представляющих клеток

Примечание: В теории, любая APC население можно было бы изучить с помощью этого метода. Незрелые костный мозг мыши дендритные клетки (ДК), как АРС были ответчик в данном случае. Существует множество протоколов для генерации этих клеток (например, ссылки 34 и 35). Вкратце, был использован следующий протокол.

  1. Промывка мозг от бедренных и большеберцовых костей во обороты в минутуЯ 1640 или DMEM.
  2. Пропускают суспендированные клетки через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы удалить небольшие кусочки кости и мусора.
  3. Гранулы клетки центрифугирования, а затем лизировать красные клетки с использованием буфера хлорида аммония в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Гранулы клетки центрифугирования (400 XG, 5 мин) и ресуспендирует осадок клеток.
  5. Промыть клетки в 5 - 10 мл промывочного буфера, гранул путем центрифугирования (400 XG, 5 мин) и повторно приостанавливать осадок клеток.
  6. Пополните гемопоэтических предшественников на колонке дл разделени клеток с помощью мечения клеток с биотинилированным анти-CD3 (5 мкг / мл), анти-В220 (5 мкг / мл), анти-МНС класса II (1 мкг / мл) и анти-CD11b (5 мкг / мл) антител.
  7. Гранул клеток путем центрифугирования (400 XG, 5 мин) и повторно приостанавливать осадок клеток.
  8. Инкубируйте клетки с анти-биотина магнитных микрогранул (см Таблицу материалов) при температуре 4 ° С в течение 10 мин.
  9. Мытье и осаждения клеток (400 мкг, 5 мин) и вновь suspenд их в 1 мл буфера MCS перед удалением меченых клеток с использованием большого положительного отбора (LS) магнитную колонку разделения клеток загрунтовать 3 мл буфера MCS и помещают в магнит. Промывают колонку 3 раза с 3 мл буфера MCS; проточный будет содержать нужные клетки.
  10. Культуры клеток, которые проходят через колонку в течение 6 дней в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 2 нг мл рекомбинантного гранулоцитарного мыши макрофагальный колониестимулирующий фактор / (GM-CSF) и 2 нг / мл рекомбинантного человеческого & beta; 1 трансформирующий фактор роста (TGF 1) , Заменить половину среды каждые 2 дня со свежей полной среде, содержащей 2 нг / мл GM-CSF и TGF 1.
    Примечание: Human TGF 1 обладает активностью в клетках мыши. Данные были получены с использованием этого незрелого ДК. Другие клетки (например, В - клетки и зрелые ДК) могут быть пригодны в качестве АРС , но не были протестированы в данном анализе.
  11. Криоконсервации РС в 90% сыворотки / 10% ДМСО и хранить в жидком азоте; восстановить надень использования. Перед использованием подсчета количества жизнеспособных ГЦ в гемоцитометра с использованием трипанового синего. Повторное приостановить осадок клеток в культуральной среде при соответствующей плотности (см шаг 4.1) перед использованием в разделе 4.

3. Подготовка Т-клеток

  1. Используйте отрицательные методы выбора, чтобы избежать непреднамеренных передач активирующих или ингибирующие сигналов к клеткам.
    Примечание: В этом примере, CD4 + Т - клетки получают для анализа.
    1. Для подготовки CD4 + Т - клеток из селезенки мыши, пюре селезенки через сито ячейки 70 мкм с использованием на поршень шприца. Промыть фильтр ячейки с буфером для промывки.
    2. Гранул суспендированные клетки центрифугирования (400 XG, 5 мин), а затем лизис эритроцитов путем повторной суспендировани осадки в буфере хлорида аммония в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Гранул клеток путем центрифугирования (400 XG, 5 мин) и повторно приостанавливать осадок.
    4. Вымойте клеткис в течение 5 - 10 мл промывочного буфера и гранул путем центрифугирования (400 мкг, 5 мин). Повторное приостановить осадок.
    5. Пятно клетки с биотинилированными антителами к CD8, главному комплексу гистосовместимости класса II (МНС II, 1 мкг / мл), и CD19 (5 мкг / мл). Инкубируют в течение 10 мин при 4 ° С.
    6. Промывают клетки в 10 мл буфера для промывки и гранул путем центрифугирования (400 XG, 5 мин). Повторное приостановить осадок.
    7. Инкубируйте клетки с анти-биотин магнитными микрогранули (см Таблицы материалов) в соответствии с инструкциями изготовителя.
    8. Промывают клетки в 10 мл буфера для промывки и гранул путем центрифугирования (400 XG, 5 мин); повторно приостанавливать осадок.
    9. Повторное приостановить клеток в 1 мл буфера MCS и обогатить CD4 + Т - клетки над магнитной разделительной колонны клеток загрунтованную 3 мл буфера MCS на магнит. Промывают колонку 3 раза с 3 мл буфера MCS. Колонка проточные будет содержать обогащенный Т-клетки.
  2. По стандартному cytome потокапопробовать, оценить чистоту Т-клеток с использованием аликвоты отрицательно отобранных клеток. Пятно клетки с использованием Флуорохромом-стрептавидином конъюгата (для выявления какой-либо меченный биотин клетки, которые должны были быть удалены на колонке) и антитело или антитела, чтобы идентифицировать популяцию Т-клетки, представляющий интереса (CD4 в данном случае); чистота ≥85% является приемлемым 23.
    1. Количество Т-клеток в гемоцитометра с помощью трипанового синего (≥90% жизнеспособность приемлемо).
      Примечание: MCS буфер содержит ЭДТА, которые должны быть удалены перед анализом. Для достижения этой цели, осаждение клеток центрифугирования (400 XG, 5 мин) и мыть в 1 мл промывочного буфера. снова Гранулы клетки (400 мкг, 5 мин) и повторно приостанавливать в культуральной среде при соответствующей плотности (см шага 4.1).

4. Со-инкубировать Т-клеток и РС

  1. Семенной Т-клетки и ДК в соотношении 2: 1 Т: Отношение постоянного тока в 24-луночный или 96-луночный планшет для культивирования. Гарантировать, что конечный объем культуры ≤500 мкл для 24-луночных планшетов или ≤50 мкл для 96-луночных планшетов.
    Примечание: Меньшие объемы стимулирование межклеточных взаимодействий и позволяют пространство для последующего буфера фиксации.
    1. Отрегулировать точные числа клеток эмпирически, но в качестве общего руководства, использовать 1 × 10 6 клеток Т и 0,5 × 10 6 РС на лунку (96-луночного планшета). Их следует рассматривать минимальные количества клеток, так как с использованием меньшего количества клеток делает перечисление иммунных синапсов трудно.
      1. Для увеличения числа клеток, создать дублирующие скважины и бассейн после стадии 5 (фиксации).
        Примечание: При настройке дублирующих скважин, то целесообразно , чтобы семя РС во всех лунках, а затем семена Т - клетках во всех лунках; это сводит к минимуму расхождения во время инкубации между скважинами.
  2. Инкубируйте планшет в течение 4 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2.
e_title "> 5. Зафиксируйте клетки в Тарелка

  1. Добавьте в 3 раза объем культуры 1,5% формальдегида в PBS в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин; тт важно зафиксировать клетки перед удалением их из пластины, чтобы минимизировать нарушение межклеточных взаимодействий.
  2. Передача клеток в пластине в пробирки для последующей промывки и окрашивания. На этом этапе, выделить дополнительные ячейки для контроля одного пятна. Помимо этих элементов управления, вся культура должна быть окрашивали коктейль антител (см шаг 4.1.1).

6. Клетки Stain

  1. Пятно клеток в 100 мкл промывочного буфера, содержащего коктейль из желаемых флуорохромом конъюгированный антителами в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    Примечание: коктейль включает в себя клеточно-специфические и АРС-специфические антитела Т. Флюорохромы должны быть выбраны таким образом, чтобы их можно отличить с помощью конфигурации изображений проточной цитометрии. В тон эксперименты, показанные здесь, синий флуорофор-конъюгированного CD11b (5 мкг / мл, см Таблицу материалов) и АРС-конъюгированного CD90.2 (5 мкг / мл), были использованы.
  2. Промыть клеток в 1 мл промывочного буфера и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г. Слейте супернатант. Повторное приостановить клетки в завивка-промывочного буфера, содержащего FITC фаллоидин в 0,05-0,5 мкг / мл и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
    Примечание: Концентрация фаллоидин FITC от приблизительно 0,1 мкг / мл работает хорошо для клеток мыши, но в соответствующей концентрацию , как ожидается, варьируется в зависимости от поставщика, типа клетка, и обработка изображений проточной цитометрии.
  3. Промывают клетки в 1 мл завивки / промывочного буфера и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г. Слейте супернатант. Повторное приостановить клетки в завивка / промывочного буфера , содержащие ядерный краситель в соответствующей концентрации (например, приблизительно 25 мкг / мл 7-AAD) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.
  4. Вымойте клеткис в 1 мл завивки / промывочного буфера и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г. Слейте супернатант. Промывают клетки один раз в буфере для промывки, гранул и повторно приостанавливать в 50 - 100 мкл промывочного буфера, перенос клеток к маленьким, блокированных микроцентрифужных пробирках.
  5. Переходим к приобретению данных сразу или хранить клетки при 4 ° С в защищенном от света в течение нескольких дней до приобретения на визуализации проточной цитометрии.
    Примечание: Клетки были успешно сохранены таким образом до 7 дней. Более длительное хранение, может быть возможно, но не было проверено.

7. Приобретение данных

  1. Инициализация и настройка потока изображений цитометра в соответствии с инструкциями изготовителя. Обеспечение стабильности ядра потока до сбора каких-либо данных.
  2. Резервные один канал для получения светлого изображения. Приобретение данных управления одним пятна канал выключен светлый.
    1. Нажмите на кнопку «Загрузить» и Inseк.т. пробирку, содержащую полностью окрашенный образец (образец, который был окрашивали со всеми необходимыми флюорохромами) в держатель.
    2. В окне «рабочего пространства», выбрать и создать новую диаграмму рассеяние с соотношением сторон по площади и ворота синглетов, где соотношение сторон близко к 1. Создать новую диаграмму рассеяния для каждого канала, используемого (интенсивности канала в горизонтальной оси) ,
    3. Для каждого флуорохрома, проверьте положительное население и, при необходимости, отрегулируйте лазерное напряжение в поле «Illumination».
    4. Выгрузка трубки и загрузить первый сингл-окрашивал трубку.
    5. В окне «Настройка Acquisition», введите имя образца и установить количество событий, которые должны быть собраны; если это один краситель (для контроля компенсации), 1000 - 2000 событий являются достаточными.
    6. В поле «Каналы», выбрать каналы, что каждый образец был окрашивали. Для контроля одного пятна, все каналы должны быть выбраны с помощью brightfIELD и боковое рассеивание прочь. Нажмите на кнопку «Запись» под окном «Приобретение»; когда число событий достигает заданное пороговое значение, приобретение автоматически прекращается.
    7. Нажмите кнопку «Return», чтобы разгрузить трубку. Повторите шаги 7.2.4 - 7.2.6 для каждого элемента управления одного пятна. В зависимости от цитометра и программного обеспечения, оно не может быть возможным , чтобы установить все из ворот , показанных на фиг.1 , во время сбора (точнее стробирования , выполняемых в процессе анализа, см раздел 8).
  3. Acquire образцы как для отдельных окрашенных образцов (в шаге 7.2), но в поле «Каналы», выбрать все каналы, которые необходимы, в том числе канала светлопольного.
    1. Перед записью данных, проверьте, чтобы подтвердить, что интенсивность канала подходит для определения желаемых клеточных популяций. Если нет, то настроить параметры лазерных и перезаписывать управление одним морилки, используя новые настройки, как описано в пункте 7.2.
    2. Для каждогообразец, получить несколько десятков тысяч событий.
      Примечание: В большинстве случаев, межклеточные контакты событие небольшого меньшинство от общего числа клеток (большинство из них отдельные клеток). В общем, желательно иметь по крайней мере 100 событий в окончательной мембраны контакта ворот.

8. Анализ данных

  1. Анализ данных, полученных в потоке изображений цитометрии с использованием аналитического программного обеспечения можно бесплатно загрузить с сайта производителя для (учетная запись пользователя должна быть создана, см таблицу материалов).

figure-protocol-14779
Рисунок 1. Gating стратегия , используемая для идентификации аллореактивных Иммунных синапсов. A. В фокусе события пропускаются от всех событий путем анализа изображений клеток на основе среднеквадратического квадрат скорости изменения профиля интенсивности изображения (Gradient RMS) с помощью чана светлого поляNel (канал 4, CH04), как описано в тексте. В. Среди в фокусе событий, дублеты отличается от одиночных клеток путем построения графика соотношения сторон в сравнении с областью для канала светлопольного. Отдельные клетки сгруппированы близко к соотношению сторон 1 и имеют меньшую площадь, в то время как дублеты близки к 0,5 и имеют большую площадь. C. Интенсивность флуоресценции АПК (в данном случае, дендритные клетки [DC] маркер, CD11c) затем нанесена против интенсивности флуоресценции Т-клеточных маркеров (в данном случае, CD90.2), и дважды положительные события закрытый типа. Границы ворот могут быть уточнены путем анализа изображения событий вблизи границ. Д. Т-APC дублеты затем уточнены таким образом , что они содержат только один APC, откладывая соотношение сторон по отношению к области маркеров APC (CD11c, CH02). Е. Эти одной APC дублеты затем уточнены таким образом , что они содержат только одну Т - клеток путем построения графика пропорции по отношению к площадиТ-клеточного маркера (CD90.2, CH06). F. Наконец, событие , содержащее только два ядра выбрано путем построения гистограммы подсчета пятна на канале окрашивающим ядра (7-AAD, CH05) и стробировании события , которые содержат только два 7-АСР-позитивные пятна (т.е. ядер). События в этих воротах анализируются для мембранного контакта и формирования синапсов, как описано на фиг.2. Данные были проанализированы слепым методом по отношению к проводимому лечению и от ранее опубликованного эксперимента 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Примечание: Эта стратегия стробирования описана в этом разделе , и изображена на рисунке 1. Анализ потока изображений цитометрии данных должен быть выполнен слепым способом по отношению к проводимому лечению. Хотя мы считаем, что иммунные синапсов и не-synaptiC контакты , как правило , легко отличить (смотрите ниже и на рисунках 2 и 3), ослепительного следует свести к минимуму смещение , возникающее из субъективности , присущей анализа изображений.

  1. Сформировать матрицу компенсации путем загрузки файлов данные управления одним морилки в мастер компенсации. После загрузки одиночных окрашенных файлов, выберите флуоресцентные каналы, используемые в эксперименте.
    Примечание: Программа автоматически генерирует матрицу компенсации, но это должно быть подтверждено вручную , чтобы гарантировать , что правильные положительные популяции были выбраны.
    1. Дважды щелкните значение в матрице и добавить график в области анализа. Создайте новые ворота, если это необходимо, чтобы исключить любые мертвые клетки / дублеты / ложные срабатывания; это новое утонченное положительное население может быть выбрано в поле матрицы в раскрывающемся меню для каждого канала.
    2. Повторите эту процедуру для каждого канала. Нажмите на кнопку «Готово», чтобы сохранить compensatioп матрица (.ctm файл).
  2. Получить анализ данных файл (.daf) из исходного файла (.rif) при загрузке файла .rif в программное обеспечение для анализа и применения матрицы компенсации.
  3. После того, как будут загружены данные, выполнить стробирование для идентификации Т-клеток-APC контактных событий.
    Примечание: Типичная стратегия стробирования включает в себя определение в фокусе событий, выбирая дублеты на основе критериев размера (площади по сравнению с соотношением сторон события), и выбор Т - клеток APC дублетов как события, которые дважды положительным результатом на Т-клетку и APC маркеры (рис 1A-C).
    Примечание: Соотношение сторон представляет собой отношение ширины события к его высоте, что позволяет дискриминацию отдельных клеток (соотношение близко к 1) от дублетов (отношение близко к 0,5).
  4. Определить в фокусе событий пути построения среднеквадратичного квадрат скорости изменения профиль интенсивности изображения (градиент RMS) в светлопольном канале (Фигура 1А). Нажмите на гое градиенты RMS гистограммы для отображения событий на ячейки в отдельных бункерах, а затем поместить ворота исключая вне фокуса события.
  5. Участок площади по сравнению с соотношением сторон канала светлопольного и рисовать затвор , который идентифицирует дублеты на основе формы и размера (Фиг.) событий. Обзор изображения событий только внутри и вне границ этих ворот может помочь аналитике уточнить размер ворота и положение. Затем построить график этих дублетных событий, в которых появляется интенсивность клеточных маркеров Т на одной оси, а с другой появляется интенсивность маркеров APC. Рисовать дублет ворота Т-APC, содержащий события положительные для обоих маркеров.
  6. Среди дублетных событий Т-клеток-APC, выберите события, которые содержат только одну Т-клетки и одну APC.
    1. Делайте это путем построения графика соотношения сторон в сравнении с областью для маркеров APC и стробирования на дублетах , содержащих один APC (рис 1D). Участок соотношения сторон в сравнении с зоной для знака Т-клетокэр и ворота на дублетах , содержащих один Т - клетки (рис 1E).
      Примечание: Дальнейшее уточнение может быть достигнуто путем построения гистограммы функции подсчета места применительно к ядерной флуоресценции пятен и стробированию на событиях только с двумя пятнами (рис 1F).
  7. В некоторых случаях эти две клетки внутри дублета не будет находиться в контакте; для идентификации клеток в контакте друг с другом, определяют объект маски для АРС и Т-клеток.
    1. Используйте опцию «Маски» в меню Analysis, чтобы открыть диспетчер Маски и определить новую маску. Введите имя, такие как «объект Т-клеточной маска». Нажмите кнопку «Функции», а затем в диалоговом окне выберите «Объект».
    2. Выберите канал , в котором обнаружен Т-клеточный маркер (например, CH06). Нажмите кнопку "OK".
      Примечание: "Объект (M06, CH06, Tight)" отображается в поле Function. Эта маска объекта по умолчанию, как правило, присткс, но может потребовать оптимизации.
    3. Повторите этот процесс для создания объекта маски APC в соответствующем канале.
  8. После идентификации APC и Т-клеточные масок, определяют мембранного контакт пути нанесения маркеров интенсивности флуоресценции Т-клетки в объектной маске APC против интенсивности флуоресценции APC в маске объекта Т-клетки. На этом участке, нарисовать затвор, который включает в себя только клетку в контакте друг с другом.
    Примечание: Как правило, существует довольно четкие дважды положительные и дважды отрицательные популяции (фиг.2А). Границу между двойным положительным и отрицательным двойным населением можно установить путем анализа Светлых изображений клеток в пограничной области для того, чтобы клетки в контакте находятся в воротах, и клетка не в контакте исключена.
  9. На данном этапе вручную просмотреть фаллоидин FITC изображения событий в этих воротах, чтобы различать зрелые иммунные синапсы от простого межклеточного контакта. Uзе функция «тег изображения», чтобы отметить эти изображения.
    Примечание: Процент меченых иммунные событий (синапсы) внутри этих ворот может быть использован в качестве показателя прямой аллореактивности в популяции Т-клетки изучается.

Результаты

Этот метод был использован для исследования CD4 + аллореактивности Т-клетки у мышей , оказываемая толерантен к аллоантигенам донора перед гетеротопической трансплантацией сердца аллотрансплантата. На мышь линии СВА (H-2 к) были даны протокол , состоящий из способствующего развития толерантности донора-специфического (B6, Н-2 б) переливания крови в сочетании с не истощает CD4 - антитело одного месяца до получения B6 сердечного трансплантата. Этот результат протокола на долговременном выживании аллотрансплантата , который зависит от FOXP3 + регуляторных Т - клеток 36, 37. Через семь дней после трансплантации, селезенки CD4 + Т - клетки были получены из толеризованных и нетолеризованных получатели B6 сердечных аллотрансплантатов и совместно инкубировали с В6 полученных из костного мозга ДК в соответствии с этим протоколом. Рисунок 2 показывает репрезентативные данные из этого эксперимента. Мембраны контакт затвора показана на рисунке 2А, с зелеными перекрестия размещены на синаптическое событии (левая панель, 1) и на не-синаптическое событии (правая панель). Фигура 2В показывают Светлые и флуоресценцию каналы для этого события. Для уменьшения смещения, данные были проанализированы с помощью наблюдателя слепом к назначению лечения 23. Как показано на нескольких примерах на фиг.3, как из нетолеризованных (Фигура 3А-В) и толеризованных (рис 3C-D) , получатели карбоксибензальдегида B6 сердца, синапсы легко отличить от не-синаптических контактов наличием плотного ФИТЦ-положительного хребта на границе Т-APC. Эти результаты показывают, что визуальное обнаружение иммунных синапсов, сделанных Т-клеток-реципиентов отслеживает со степенью аллореактивности у реципиента.

figure-results-2074
Рисунок 2. Идентификация Т-APC дублетов с мембранойКонтакт и Иммунная Synapse свита. События в окончательном дублета ворот (рис 1F) анализируются. А. Т-клеточный маркер флуоресценция в маске объекта APC представлена в зависимости от APC маркеров флуоресценции в маске объекта постоянного тока. Некоторые события дублетных имеют APC и Т-клетки без межклеточного контакта и появляются в нижнем левом углу участка (изображения не показаны). Мембрана контакт затвора, таким образом, может быть сделан вывод, что включает в себя только дублеты, в котором Т-клетки и АРС находятся в контакте. Изображения каждого события в этих воротах рассматриваются для доказательства актина цитоскелета перегруппировки в канале фаллоидина-FITC и могут быть помечены с помощью программного обеспечения для анализа. Левая панель показывает иммунное событие синапсов (с маркировкой 1 и обозначены зеленым перекрестием), в то время как правая панель указует на мембрану контакт событие без образования иммунного синапса (помеченные 2 и обозначены зеленым перекрестие). Определение формирования синапсов требует ручного обзора этихизображения, как показано в B. B. Верхняя строка показывает Светлое и флуоресценцию канал изображения для дублета с иммунным синапсом (соответствует событию 1 в А); нижняя строка показывает дублет с мембраной контакта, но не хватает формирования синапсов (соответствует событию 2 в А). Данные были проанализированы слепым методом по отношению к проводимому лечению и от ранее опубликованного эксперимента 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4184
Рисунок 3. Примеры Т-APC Synapse формации. На мышах линии СВА получили сердечные аллотрансплантаты от доноров B6 после того, как либо нет предварительной обработки (AB) или после индукции толерантности с B6 цельной кровью под прикрытием не-разрушающих антител против CD4 ( Ронг> CD). Через 7 дней, селезенки CD4 + Т - клетки были испытаны для образования синапса с B6 РС. А. Три примера , не синаптические дублетов с мембраной из контакта нетолеризованных животных. Б. Три примера иммунных синапсов из не-толеризованного животного. С. Три примера , не синаптические дублетов с мембраной контактом из толеризованного животного. D. Три примера иммунных синапсов из толеризованного животного. формирование синапса указывается присутствием яркого, ФИТЦ-положительного хребта на границе Т-APC (CH03). Данные были проанализированы слепым методом по отношению к проводимому лечению и от ранее опубликованного эксперимента 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

AYS "> Антитело / Dye флюорохром канал концентрация CD11c eF450 CH02 5 мкг / мл, титруют эмпирически CD90.2 APC CH06 5 мкг / мл, титруют эмпирически фаллоидин FITC CH03 0,05 - 0,5 мкг / мл 7-ААР - CH05 25 мкг / мл

Таблица 1. Антитела и красители , используемые в данном исследовании. Флуорохром-конъюгированные антитела, красители, поставщики, и рекомендуемые концентрации представлены в таблице. Поток изображений цитометра канала, который был использован для обнаружения каждого флуорохрома также показан в таблице.

Обсуждение

Изображений проточной цитометрии был использован , чтобы продемонстрировать формирование иммунного синапса между моноклональными Т - клеток и АРС или в присутствии суперантигенов 24, 25, 26, 27, 28. Этот метод использует тот факт , что после продуктивного Т-клеток APC контакта, Т - клетка перестраивает свой актиновый цитоскелет, поляризационный его к месту контакта 21. Эта перестановка не происходит без сигнализации TCR, и поэтому она является ранним коррелятом активации Т-клеток 19, 20, 21. Метод, представленный здесь адаптируется этот подход к измерению аллореактивных частот Т-клетки в популяции Т-клетки поликлональной. Как таковой, он может в будущем служить в качестве основы для разработки тестов для доноров reactivi ти в клинической трансплантации.

Хотя прямые сравнения еще не было сделано, обнаружение аллореактивными иммунных синапсов, как представляется, имеют высокую предсказательную силу, чем обычные СКЛ. Например, предыдущая работа показала , что в протокол было описано выше , способствующие развитию толерантности, результаты в MLR не достоверно коррелирует с исходом трансплантата 2.

Целый ряд анализов были разработаны для операционно толерантного состояния у человека 9, 10, 11, хотя они не измеряют эффекторной функции клеток в ответ на аллоантиген. В противоположность этому , IFN- , ELISPOT анализах функции 8 мера эффекторных Т-клеток , но не может охватить весь спектр секреции цитокинов , которые могут иметь отношение к острым и хроническим отторжение аллотрансплантата, такие как IL-17 38,> 39. Предельного разбавления для анализа 4, который является трудоемким, а анализ транс-виво 6, который требует мышей, имеют существенные практические ограничения , которые препятствуют их применение в клинической практике . Недавние усовершенствования по анализу пролиферирующих клеток с использованием анализа последовательности TCR Т - клетки , реагирующих в СКЛЕ могут иметь значение, но , как анализ , представленный здесь, требуют дальнейшей проверки в клинических исследованиях 18, 40.

Дальнейшее развитие анализа на обнаружение иммунного синапса потребует ряд важных вопросов без ответа. Во-первых, анализ, разработанные только меры прямого аллореактивности. Прямой путь включает презентацию аллогенных MHC / пептидные комплексы на донорном полученное АРС. Последнее, как правило, устраняются быстро после трансплантации, и далее аллоантиген презентация Карриред путем АРС-получателей, представляющее нетронутые доноры MHC (пол-прямого путем) или обработанных антигенами-доноров на себя MHC (непрямой путь). Непрямой путь является важным фактором хронического отторжения аллотрансплантата 33, 41.

В принципе, это должно быть возможно обнаружить косвенные иммунные синапсы с помощью этого анализа, но косвенно аллореактивный Т - клетка имеет значительно более низкую частоту , чем прямые из них 42, 43, а это означает , что потребуется анализ большего числа событий. Второе соображение состоит в том , что мы проверили только с помощью этого анализа CD4 + Т - клеток, тогда как CD8 + Т - клетки также являются важным компонентом ответа анти-донора. Опять же , это должно быть возможно обнаружить CD8 + Т - клеток-APC синапсы с использованием этого метода. Другим ограничением является то, что этот метод требует ручной обзор и анализ изображений клеток в конечном MembRane контакт ворота, и мы сейчас работаем над автоматизацией этого шага.

Наконец, метод требует тестирования и развития в людях, и предварительные исследования с человеческими образцами в настоящее время выполняются. Далее фенотипический анализ Т-клетки подмножества (т.е. эффектор, память, нормативный и т.д.) в сочетании с обнаружением иммунных синапсов в реципиентах будет представлять собой мощный подход для характеристики аллореактивного Т-клеточного репертуара и будет важным направлением для будущая работа.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

SCJ была поддержана Международным обществом сердца и легких Трансплантация Research Fellowship и Королевского колледжа врачей и хирургов Канады Detweiler путешествую Fellowship.SM была частично поддержана Международным обществом сердца и легких Трансплантация премии развития карьеры (к) ВСП. СС при поддержке Национального института исследований в области здравоохранения Oxford Biomedical Research Centre.JH является получателем почки Research UK Старший Неклинические Fellowship. Эта работа финансировалась следующими гранты AB и KW: в Wellcome Trust грантовой программе (082519Z07Z), в British Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504) и Рамочной программы ЕС 7 (в одном исследовании; BioDRIM). Авторы хотели бы поблагодарить Майкл Парсонса и проточная цитометрия основного комплекса в научно-исследовательском институте Lunenfeld-Таненбаум, систему здравоохранения Синая, Торонто для обеспечения доступа и поддержки с инструментом ImageStream Mark X.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate-buffered salineVariousVaries
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificAM9260G
Triton X-100 nonionic detergentSigma-AldrichX100
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD8418
FormaldehydeSigma-AldrichF1635Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore sizeFisher Scientific08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanateSigma-AldrichP5282
7-aminoactinomycin DThermo Fisher ScientificA1310Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2eBioscience17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11beBioscience48-0112Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3eBioscience13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class IIeBioscience13-5321
Biotinylated anti-mouse B220eBioscience13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8eBioscience13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19eBioscience13-0193
Anti-biotin microbeadsMiltenyi Biotec130-090-485
LS columnsMiltenyi Biotec130-042-401
MidiMACS magnetic cell separatorMIltenyi Biotec130-042-302
recombinant mouse GM-CSFPeprotech315-03
recombinant human TGFβ1Peprotech100-21Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark IIAmnis/EMD MilliporeN/AImaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS SoftwareAmnis/EMD MilliporeN/AFree download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium VariousVaries
Fetal bovine serumVariousVaries
Cell culture platesVariousVaries

Ссылки

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153(2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210(2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943(2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены