JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Первичная ресничка принципиально важным в нервной пролиферации клеток-предшественников, дифференцировки нейронов и взрослых функции нейронов. Здесь мы опишем метод для изучения цилиогенеза и торговлей сигнальных белков ресничек в нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцированных нейронов с использованием первичных культур нейросфера.

Аннотация

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Введение

Первичная ресничка является микротрубочек на основе динамического субклеточная отсек , который функционирует в качестве сенсорной антенны в координации клеточных сигнальных путей, в том числе Звуковой еж (Тсс) пути во время эмбрионального развития нейронов 1, 2, и на секции субклеточном сигнализации во взрослой нейрональной функции 3, 4 , Сигнальные компоненты этих путей, такие как рецептор Shh исправленного 5; Путь активатора Smoothened (SMO) 6; и Gpr161 7, сирота G-белком рецептор (GPCR) , которые негативно регулирует путь Shh, чтобы локализовать ресничек в динамической моде. Несколько GPCRs сообщалось, локализуется в реснички в нейронах в головном мозге 7, 8, 9, 10 SUP>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Дефекты ресничек и реснички генерируемых сигнальных путей влияют множественные ткани и все вместе известны как цилиопатии 17, 18, 19. Спектр болезни цилиопатии часто включает в себя психомоторный дефекты, такие как черепно - лицевые аномалии 20, 21, 22. Кроме того, первичные реснички в гипоталамических нейронах регулируют центральные пути сытости, и дефекты приводят к центральному ожирению 23, отражая ожирения у синдромальных цилиопатий , такие как синдром Барды Biedel 24. Кроме того, нейропептид рецепторы сигнализации в ресничках регулируют Centrаль сытость дорожки 11, 14. Цилиарная локализация аденилатциклазы III (ACIII) и GPCR , такие как рецептор соматостатина 3 в нейронах гиппокампа приводит к новым дефектам распознавания объекта и нарушению памяти 25, 26 и параллельна отсутствие целостности цилиарных 27. Аспекты развития ресничек генерируемых сигналов тесно связаны с гомеостазом ткани; в частности, реснички играют важную роль в прогрессировании Тсс-подтипа медуллобластомы , вытекающих из клеток - предшественников гранул в мозжечке 28, 29. Таким образом, первичные реснички играют важную роль в процессе эмбрионального, послеродовом и взрослых нейронов развития и функции.

Нейрональные стволовые клетки (NSC,) находятся в субвентрикулярной зоне (SVZ) бокового желудочек, то субгранулярная зона зубчатой ​​извилины гиппокампа, ажелудочковая зона третьего желудочка в гипоталамусе у млекопитающих 30, 31, 32. NSCs мультипотентны, обладают способностью к самообновлению, и имеют важное значение для развития мозга и регенеративной медицины 30. Большинство NSCs в СВЗЕ находится в состоянии покоя и обладает уединенной первичной ресничкой , что во многих случаях проходит к боковому желудочку 33. Первичные сигналы реснички через локализацию различных рецепторов, индуцирующую вниз по течению клеточных реакций, в частности , по отношению к Shh, TGF - beta, и пути киназы рецептора тирозина 2, 34, 35, 36. Так как первичные реснички проходят в боковой желудочек, она выдвинута гипотеза , что первичные реснички обнаружить цитокины в спинномозговой жидкости (CSF) , чтобы активировать NSCs 37 . Недавние исследования показали, что сигнальный путь Тсс и первичные реснички являются критическими для активации стволовых клеток в ремонте и регенерации нескольких тканей, в том числе обонятельного эпителия, легких, почек и 38, 39, 40, 41. Однако механизмы, с помощью которых CSF взаимодействует с NSC, и является ли первичными ресничками участвуют не известны. Прикрепленные NSCs в культуре реснитчатые; локализовать компоненты путей метаболизма SHH, такие как Smo и Gpr161 в ресничках; и Тсс отзывчивым 42. Таким образом, NSC, может служить в качестве важной модельной системы для изучения пути Shh, мерцательной торговли и нейронных путей дифференцировки. Кроме того, нейроны, дифференцированные из NSC, также могут быть использованы для анализов торговли людьми цилиарного.

Нейросферы состоят из кластеров свободно плавающих клеток, возникающих из пролиферации neuraл стволовых / клетки - предшественники , которые растут в присутствии специфических факторов роста и неадгезивных поверхностей 43, 44. Нейросферы служат важными в пробирке моделей культуры для изучения нейронных стволовых клеток / клеток - предшественников в нормальном развитии и болезнях 31, 45, 46, 47. Здесь мы описываем анализ нейросфера основе для культивирования нервных стволовых клеток / клеток-предшественников и дифференцировки в нейроны / глии. В частности , мы подчеркиваем торговлю сигнализации компоненты ресничек нервных стволовых / клеток - предшественников и дифференцированных нейронов (рисунок 1). В отличие от культивирования первичных нейронов, первичных нейросферы относительно легко культуры, поддаются множественных пассажей и заморозить-оттаивания циклов, и может проходить дифференциацию в нейроны / глии. Важно отметить, что мы определили, что нейросфера полученных нейронныестволовые клетки / клеток-предшественников и дифференцированные нейроны в культуре мерцательные и локализовать сигнальные молекулы, имеющие отношение к функции цилиарной в этих отсеках. культуральные методы нейросферы основы могут служить в качестве идеальной модели системы для изучения цилиогенезом и цилиарные торговель NSCs и дифференцированных нейронов.

протокол

1. Выделение Нейросферы из мозга мышей для взрослых

  1. Эвтаназии взрослой мыши (около 2 месяцев) от передозировки изофлурана. Дважды проверьте, что мышь перестала дышать и рассекает сразу же после смерти.
  2. Используя ножницы, сделать срединный разрез, чтобы открыть череп. Удалить мозг.
  3. Поместите мозг в холодном PBS в 10 см чашку на льду. Выполните все-Mount метод рассечение , чтобы получить SVZ от бокового желудочка 48.
  4. Поместите боковой желудочек в 1,5 мл пробирку, добавляют 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в PBS, и инкубировать трубку в течение 15 мин при 37 ° С в водяной бане.
  5. Через 15 мин добавляют 500 мкл тормозящей среды и осторожно пипеткой 20 - 30 раз с 1 мл наконечником. Избегайте образование воздушных пузырьков во время пипетки.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для выживания клеток.
  6. Спин вниз клетки при 500 мкг в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают, добавляют 1 мл PBS и ресуспендируют тон клетки осторожно пипеткой 5x с 1 мл наконечником.
  7. Спин вниз при 500 х г в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл наконечник и добавить 1 мл базальной среды.
  8. (Необязательно) Если наблюдаются клеточные остатки, проходят клетки через 70 мкм-фильтр клеток.
  9. Подсчитайте число клеток с помощью гемоцитометра; в общем, около 30 000 - 60 000 клеток / SVZ получены.
  10. Пластина клетки от одного SVZ в 10 см чашку с 10 мл среды и культуры НСК при 37 ° C с 5% CO 2.
  11. (Необязательно) Чтобы избежать слияния между сферами 49, поместили 1000 клеток в одной скважине ультра-низкого связывания 6-луночный планшет , который предварительно заполненном 1,5 мл среды и культуры НСК при 37 ° С с 5% CO 2.
    Примечание: Через 5-7 дней, нейросфера может наблюдаться (фиг.2А). Период культивирования может отличаться в зависимости от возраста мыши или генетического фона.
  12. Добавляют 2 мл NSC среды каждые 3-4 дня, чтобы поддерживать культуру(Не удалить существующую среду).

2. Анализ дифференциации пропускной способностью нейросферы и цилиогенез испытаний

  1. Для анализа возможностей дифференциации, анализ нейросферы под прилипшими условиями дифференциации среды.
  2. Стерилизовать 12 мм круглые покровные автоклавированием или с помощью УФ-облучения до использования. Для культуры прикрепленных клеток, поставить стерилизовать 12 мм круглые покровного стекла в лунку 24-луночного планшета в асептических условиях.
  3. Шерсть покровного стекла в течение 10 с с 500 мкл 0,002% поли-L-лизин (PLL). Аспирируйте раствор и высушить его в течение 10-15 мин.
  4. Добавьте 500 мкл раствора ламинин (5 мкг / мкл). Инкубируйте покровного стекла в течение 1 ч при 37 ° С.
  5. Аспирируйте ламинин и добавьте 500 мкл среды или дифференциации среды НСК (недифференцированная контроль).
  6. Для анализа дифференциации, подобрать 100 - 200 мкм сферу с наконечником 200 мкл под микроскопом. Добавить5-10 нейросферы в каждую лунку планшета 24-луночного и культур в течение 7-10 дней в среде для дифференцировки.
  7. Для анализа недифференцированных нейросфер, добавьте 5-10 нейросфер в каждую лунку планшета 24-луночного и культуры в течение 1-2 дней в среде НСКА. Приложенные нейросферы распространяться и расти в виде монослоя (фигура 2В).
  8. После тщательного удаления среды, фиксации клеток с 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем промывают PBS в два раза в течение 5 мин при комнатной температуре. Пластина может храниться при температуре 4 ° С в течение 1-2 месяцев.
    Примечание: Для визуализации нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников в NSC среде и дифференцированных клеток в дифференциации среды, выполняют иммунное окрашивание против нестин (нейронные стволовые клетки / клеток-предшественников маркер), β-тубулина III (TUJ1 моноклональное, нейронный маркер), GFAP (глиального фибриллярного кислого белка , астроцитов маркер), и О4 (олигодендроцитов маркер) (фигура 2В-Е). Для анализа реснички, выполнять иммуноокрашивание против Arl13b (первичный CIЛия Маркер) и Gpr161 (цилиарный ХВГФ) (фигура 3).
  9. Установить крышку стекло с монтажным раствором на предметное стекло. Наклон слайд стекла для удаления избытка раствора.

3. Анализ цилиогенеза в нейросферах

  1. Для анализа клеток в интактных нейросферах иммунного окрашивания, передача 1 мл культуральной среды, содержащие несколько нейросфер в 1,5 мл пробирки и спин вниз со скоростью 500 мкг в течение 8 мин. Закрепить сферы с 4% (PFA), после удалени среды в течение 15 мин и промывают PBS. Спин вниз сферы при 500 х г в течение 8 мин, удаления надосадочной жидкости, и инкубировать сферы O / N с 30% сахарозы при 4 ° С.
  2. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл кончик и добавляют 500 мкл раствора OCT с использованием разреза 1 мл кончик. Обрежьте край наконечника, чтобы расширить отверстие, в октябре является вязким.
  3. Переносят раствор, содержащий OCT нейросферы в одноразовый плесени пластиковые замораживания (10 мм х 10 мм х 5 мм).
  4. Замораживание мстарый на сухом льду в течение не менее 15 мин.
  5. (Необязательно) Остановить эксперимент и сохранить форму в морозильной камере C -80 ° до 1 года.
  6. Нарезать участки с криостатом; толщина секций должна быть 15-30 мкм.
  7. Для визуализации первичной реснички в нейросфера, выполняют иммунное окрашивание против Arl13b (рисунок 4).

4. Культура и прохождение Нейросферы и прилипшие NSCs

  1. Прохождение нейросфера в то время как размер шара между 100-200 мкм; когда нейросферы слишком велики (300 мкм или выше), они не являются идеальными для экспериментов.
  2. Передача нейросферы в трубку 50 мл с использованием 1 мл наконечника и спин вниз со скоростью 500 мкг в течение 8 мин.
  3. Жидкость над осадком сливают с помощью аспиратора, добавляют 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в PBS, и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С. Количество трипсина варьирует в зависимости от количества сфер.
  4. Добавьте 500 мкл сыворотки среды и мягко трубыт в 20 раз с 1 мл наконечником.
  5. Спин вниз при 500 х г в течение 8 мин. Жидкость над осадком сливают с использованием 1 мл наконечник и добавить 1 мл базальной среды.
  6. (Необязательно) Если клеточный дебрис или недиссоциированные нейросферы видны, проходят клетки через клетку-сито 70 мкм.
  7. Прохождение клеток в 10 см чашки при плотности 10000 клеток / см 2 в NSC среде; клетки будут готовы к следующему прохождению через неделю.
  8. (Необязательно) Чтобы заморозить клетки, добавить замораживание среды для генерации 500000 до 1000000 клеток / мл суспензии. Замораживание клеток с использованием крио-замораживание контейнеров; недиссоциированные нейросферы также могут быть заморожены.
  9. Для культуры прикрепленной, dillute клетки до 50000 клеток / см 2 на PLL- и ламинин покрытие покровных с НСК средой и культур в течение 1-2 дней.

5. Голодание и анализ ресничек

  1. Подготовьте голодание среды (таблица 1).
  2. 1-2 дней после первоначального плюноши и девушки адгезивных клеток после диссоциации, изменений в НСКЕ среду в одну лунке (контроль) и голодной среду в других скважинах (эксперимент).
  3. Культура прилипших клеток в течение 24 часов.
  4. Закрепить клетки с 4% PFA в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре и дважды промывают PBS в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
  5. (Необязательно) Остановка эксперимента и хранить 24-луночные планшеты с покровными в PBS при 4 ° С в течение 1-2 месяцев.
  6. Выполнение протокола иммунофлюоресценции для окрашивания 7, 50.
  7. Установите покровные с помощью монтажного раствора. Сушат предметное стекло O / N при комнатной температуре в темноте.
  8. Получение изображений на соединение микроскопа при необходимом увеличении. С помощью микроскопа, камеры и целей (40X / 1.3 масла и 63X / 1.4 масла), управляемый с помощью прилагаемого программного обеспечения. Возьмем достаточное количество Z-секции с интервалом 0,5-0,8 мкм (рисунок 5).
  9. Для количественного анализа локализации цилиарной вприлипшие клетки приобретают стеки изображений из 3-8 последовательных полей с сливающимися клетками, глядя в канал DAPI. Количественно число первичных ресничек с использованием ImageJ / Фиджи. Как правило, использует «Счетчик клеток» инструмент в ImageJ плагин> диалоговое окно для подсчета клеток с ХВГФ-положительной ресничек Анализа; максимальные проекции из стопок изображений также могут быть экспортированы из ImageJ / Fiji.Use аналогичной интенсивности изображения и параметров контраста для всех изображений из того же эксперимента для подсчета и целей экспорта.

6. Трансфекция нейросфер

  1. Придерживаться диссоциированными клетки к покровным в течение 24 ч. Использование плотности клеток, как правило, между 75000 и 150000 клеток в 500 мкл среды NSC в одном лунку 24-луночного планшета.
  2. Смешайте 25 мкл восстановленного сыворотки среды и 1,5 мкл реагента для трансфекции в 0,5 мл микропробирки встряхиванием в течение 5 сек.
  3. Добавить 2,5 мкг эндотоксина свободной ДНК плазмиды в отдельных 0,5 мл microtubе, содержащие 25 мкл восстановленной сыворотки сред и перемешать встряхивание в течение 5 с.
  4. Добавить 1 мкл реагента для трансфекции ко второму микропробирок, содержащий ДНК и перемешать встряхиванием в течение 5 с.
  5. Добавьте смесь из ДНК-содержащей трубки к первому микропробирок и перемешать с помощью пипетки.
  6. Выдержите смесь в течение 10-15 мин при комнатной температуре. После инкубации, осторожно добавляют по каплям к трансфекции смеси в лунки на верхней части среды НБК (500 мкл / лунку).
  7. Изменение среды 24 ч после трансфекции среду для контроля (NSC среднего) или голодание среду (500 мкл / лунку).
  8. Закрепить клетки путем изменения среды до 4% PFA через 24 ч и выполняют иммунное окрашивание; как правило, до эффективности трансфекции 10% получают с использованием этого протокола.

Результаты

После посева клеток из SVZ в NSC среде в течение недели, плавающие нейросферы наблюдались (фиг.2А). Размеры сфер варьировались от 50 до 200 мкм. Чтобы исследовать, если шарики были получены из нервных стволовых клеток / клеток-предшественников, то нейросферы высевали...

Обсуждение

Здесь мы опишем метод для создания и поддержания нейросферы культуры от взрослого СВЗА мыши. Несколько соответствующие моменты, касающиеся культуры заключаются в следующем. Во-первых, размеры сфер, как правило, в пределах от 50 - 200 мкм. По нашему опыту, когда нейросфера получает больше, ч...

Раскрытие информации

The authors declare no competing financial interests.

Благодарности

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

Ссылки

  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .. ,. ,. T. .. ,. &. a. m. p. ;. K. a. t. s. a. n. i. s. ,. N. .., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122GGpr161

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены