JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Organotypic гиппокампа ломтик культур (страховой) представляют собой модель в пробирке , которая моделирует ситуацию в естественных условиях очень хорошо. Здесь мы описываем, основанных на vibratome улучшение нарезки протокол для получения фрагментов высокого качества для использования в оценке нейропротекторной потенциал новых веществ или биологическое поведение опухолевых клеток.

Аннотация

В культурах гиппокампа срез organotypic (ОАО) хорошо сохранились Морфологические и функциональные характеристики нейронов и глиальных клеток. Эта модель подходит для решения различных исследовательских вопросов, которые включают исследования по нейропротекции, электрофизиологические эксперименты на нейроны, нейронных сетей или прорастание опухоли. Гиппокампа архитектуры и активности нейронов в multisynaptic цепи хорошо сохраняется в страховой, хотя сама процедура нарезки первоначально поражений и приводит к формированию глиальный рубец. Формирование рубца изменяет предположительно механических свойств и диффузионного поведение малых молекул и др. Фрагменты позволяют контролировать время зависимых процессов после травм головного мозга без животных хирургия и исследования по вопросам взаимодействия между различными типами клеток мозга, полученных, а именно астроциты, Микроглия и нейронов под физиологических и патологических условий. Двойственные аспектом этой модели является отсутствие кровотока и иммунных клеток крови. При прогрессировании нейронных травмы перенос иммунные клетки из крови играют важную роль. Поскольку эти клетки отсутствуют в фрагменты, внутренние процессы в культуре может наблюдаться без внешнего вмешательства. Кроме того в страховой точно контролируется состав средне внешней среды. Еще одним преимуществом данного метода является меньшее количество жертвенных животных, по сравнению с стандартным препаратов. Несколько OHSC можно получить из одного животного, возможность одновременного исследования с несколько процедур в одном животном. По этим причинам страховой хорошо подходят для анализа воздействия новых защитных терапии после повреждения тканей или во время вторжения опухоли.

Протокол представил здесь описывается метод подготовки страховой, которая позволяет генерировать высокую воспроизводимость, хорошо сохранились фрагменты, которые могут быть использованы для целого ряда экспериментальных исследований, как нейропротекторного эффекта или опухоль вторжения исследования.

Введение

Страховой являются хорошо изученных в vitro модель для изучения физиологических и патологических свойства нейронов, астроциты и микроглии1. Это легко управлять средой внеклеточные и мониторинга сотовых и морфологические изменения после различные стимулы. Организация гиппокампа нейронов и их соединения хорошо сохранились после подготовки2,3. Из несколько преимуществ страховой позволяют контролировать вторжения травмы и опухоли головного мозга без животных хирургия. Шесть-восемь страховой можно получить от одного грызунов мозга. Страховой поэтому помочь существенно уменьшить количество животных и позволяют тестирования нескольких концентрации наркотиков, генетические манипуляции или различные поражения модели в то же самое животное. В основе ломтик анализов экспериментальных условиях может управляться точно. Кроме того время зависит от развития патологических состояний как вторичные убытки может легко контролироваться покадровой изображений.

В заданном протоколе, первоначально учрежденной Stoppini et al. 4подготовка шаги описываются и выделены морфологическая достопримечательности для отбора соответствующих фрагментов. Мы рекомендуем подготовку послеродовой 7-9 день крыс или мышей послеродовой день 4-5. В эти периоды страховой Показать надежный сопротивление механических травм и высокий потенциал для реорганизации нейронных цепей. В отличие от этого препараты от эмбриональных или взрослых крыс быстро изменить их структуру и теряют их морфология organotypic во время выращивания и поэтому меньше подходят для изучения долгосрочных процессов в фундаментальных исследований5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Другой критической точкой для выживаемости страховой является толщина среза, сам, как диффузии и, таким образом, питательных являются ограниченные12,,1314.

протокол

животных эксперименты были проведены в соответствии с политикой этики и политики в области использования животных в неврологии исследований, утвержденных на европейских сообществ Совета Директива 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского союза о защите животных, используемых для научных целей.

1. Подготовка документов и средства массовой информации культуры

  1. для приготовления страховой используют следующий набор документов: две маленькие ножницы, две изогнутые пинцет, один пинцет с тонкой кончиком, три лезвия (два размера 11, один из размера 15), три скальпель держатели, раунд фильтр документов (диаметр: 35 мм), агар, одно лезвие бритвы, один неизмененной пипетка Пастера, и одно изменение пипетка Пастера без наконечника. Простерилизуйте все материалы в автоклаве до использования ( рис. 1).
  2. Весят 5 g агар и растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуйте решение для 20 минут 121.7 ° C на 210,8 кПа в автоклаве. Распространять 3 мл раствора жидкого агар в чашках Петри 60-мм с помощью стерильной стеклянной пипетки, позволяют ему затвердеть в течение 5 ч, накрыть пластиковой парафин фильм, чтобы избежать загрязнения и хранить при 4 ° C до дальнейшего использования. Агар блоки необходимы для стабилизации мозги во время нарезки процедуры.
  3. СМИ
    1. сделать 200 мл подготовка среды (рН 7,35) состоящая из 198 мл минимальные основные среды (MEM) и 2 мл раствора L-глютамин (конечная концентрация 2 мм). Подготовить решение на день подготовки средств массовой информации и хранить при 4 ° C.
    2. Подготовить 100 мл питательной среды, состоящий из 49 мл MEM, 25 мл Хэнкс ' сбалансированный солевых растворов (HBSS), 25 мл (v/v) нормальный лошадь сыворотки (ГСЗ), 1 мл раствора L-глютамин (конечная концентрация 2 мм), 100 мкг инсулин, глюкоза 120 мг, 10 мг стрептомицина , 10 000 U пенициллин и 800 мкг витамин С, как сообщалось ранее. Теплый среднего (37 ° C), настроить значение рН рН 7,4 и стерильного фильтра (размер пор 0.2 мкм). Повторите процедуру (разогрев, корректировка уровня pH и т.д.) каждый второй день перед изменением среды. Используйте средство на наиболее для одной недели при температуре 4 ° с.
  4. Заполнить один из 35-мм Петри с подготовки среднего для хранения в мозг. Место две пустые чашки Петри для сбора ткани на пачке охлаждения в рабочей области.

2. Подготовка и резка с Vibratome

  1. использования мозги от 7-9 день старых крыс или 4-5 день старых мышей для подготовки страховой согласно Stoppini и др. 4 после обезглавливания животных, снять кожу от черепа с ножницами.
  2. Привнести затылочного лезвие тонкой ножниц и откройте черепа путем разрезания вдоль оси хвостового (бэк) ростральной (Фронт). Сделать два отрубы перпендикулярно к первому, так что ножницы указывают на левое и правое ухо, соответственно (" T-разрез ").
  3. Аккуратно откройте черепа с тонкой щипцами, обращая внимание, чтобы не травмировать мозга. Использовать скальпель (размер 11 лезвия) сократить наиболее ростральной часть полюса лобной и мозжечке.
  4. С помощью шпателя, удалить мозга и поместите его тщательно в Петри, заполнены с подготовки среднего ( рис. 2). Поместите мозг на держатель образца и исправить ее с медицинской Цианакрилатный клей. Используйте кусочки агар для обеспечения механической стабилизации.
  5. Вскрыть ткани горизонтально в 350 мкм толщиной страховой, с использованием скользящей vibratome.
  6. Оценить ломтиками, оптически с помощью бинокулярный микроскоп. Немедленно отменить страховой низкого качества. Важно принимать только те фрагменты с нетронутыми cytoarchitecture, изолированный от средней части гиппокампа (см. рисунки 3 и 4) между дорсальной и вентральной гиппокампа.
  7. Отдельные области гиппокампа и entorhinal коры, с помощью скальпеля (Круглый Клинок размер 15; Рисунок 3). Перфорантных пути и entorhinal коры должна быть сохранена.
  8. Шести до восьми страховой получаются из каждого мозга. Переводить 2-3 ломтика на одну ячейку культуры вставка (поры размер 0,4 мкм) и поместите его в одной скважиной 6-ну культуры блюдо, содержащие 1 мл питательной среды на колодец.
  9. Инкубировать 6-ну блюда на 35 ° C в атмосфере полностью увлажненный с 5% (v/v) CO 2 и изменить ячейку культуры среднего каждый второй день.
    Примечание: Проведение экспериментов на 6 день в пробирке (div). 6 день исчезают воспалительные реакции, связанные с процедурой нарезки. На данном этапе, снова показать разветвленная словотолкование клетки микроглии и созрели синаптических связей.

3. Оценка качества ткани

  1. фиксации, маркировки и визуализация вырождающихся нейронов в страховой
    1. после выполнения экспериментов, инкубировать страховой с 5 мкг/мл пропидий йодидом (PI) за 2 ч до фиксации, в порядок пятно ядер нейронов вырождающихся.
      Предупреждение: PI является подозреваемых канцерогенов, всегда надевайте средства индивидуальной защиты (СИЗ) такие перчатки.
    2. Мыть страховой с 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) и исправить их с 4% (v/v) раствором параформальдегида (PFA) за 24 ч.
      Предупреждение: PFA является канцерогеном токсичных и подозреваемых. Работа под зонт и носить СИЗ.
    3. Мыть страховой во вставках 1 мл PBS и использовать кисть монтера для разделения фрагментов от мембраны,.
    4. Этикетка страховой с IB 4 красителя в 24-ну пластины ( рис. 5).
  2. Проводимости опухоли вторжения экспериментов с использованием дневно помечены единичных клеток
    1. за 24 часа до начала эксперимента, ярлык опухолевых клеток с помощью флуоресцентного красителя Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl Эстер (CFDA SE).
    2. Отсоединение и количество опухолевых клеток с помощью камеры Нойбауэр.
    3. Ресуспензируйте клеток в среде, таким образом, что 10 мкл суспензии содержит номер нужной ячейки (обычно 50000 или 100000 клеток).
    4. Применять 10 мкл суспензии клеток на срез культуры и позволяют клеткам вторгнуться на 3 дня.
    5. В конце эксперимента, исправить фрагмент культур с помощью 4% (v/v) PFA за 24 ч и ярлык Сопредседатель культур с PI для еще 24 часа для визуализации cytoarchitecture.
      Предупреждение: PFA является канцерогеном токсичных и подозреваемых. Работа под зонт и носить СИЗ.
    6. Монтировать Сопредседатель культур на покрытие скольжения для дальнейшего анализа, с помощью средства монтажа.

4. Оценка экспериментов страховой

анализ страховой с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM). Для обнаружения PI помечены, вырождающихся нейронов или PI, помечены cytoarchitecture использовать монохроматического света длиной волны λ = 543 Нм и выбросов band фильтр для длин волн λ = 585-615 Нм. Для CFDA помечены опухолевых клеток или IB 4 микроглии, используйте возбуждения волны λ = 488 нм. Для обоих типов экспериментальных, записать z стек с 2 мкм толщиной оптического ломтиками и используется для оценки.

Результаты

Нейропротекции исследования: Чтобы определить повреждения нейронов, число Пи позитивные ядер и IB4 положительное, что было подсчитано микроглии в каждый третий раздел Оптический слоя клеток гранул (GCL) зубчатой извилины (ГД). Для опухоли вторжения экспер?...

Обсуждение

Настоящий Протокол описывает подготовку страховой. Эта модель позволяет тестирование встроенных возможностей и реакции ткани головного мозга после применения физиологических и патологических стимулов. Помимо анализа электрофизиологические параметры страховой может быть пораженн?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Christine Auste за ее поддержку с видео-записи и Гадбан Chalid за его прекрасную техническую помощь. Urszula Grabiec было поддержано FKZ программа ру 29/18.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6-WellFalcon35-3046
AgarFluka5040
AutoclavSystecDX-45
CFDA Thermo FisherV12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium Invitrogen32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin IVector LabsFL-1101
GlucoseMerk1083371000
GlutaminInvitrogen25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)Invitrogen14170-138
InsulinSigma AldrichI5500
L-ascorbic acidSigma AldrichA5960
L-GlutaminInvitrogen25030-024
LN229Cell-Lines-Service300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)B.Braun1050052
Millicell Culture InsertsMilliporePICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acidSigma AldrichM3262
Normal Horse SeumInvitrogen26050-088
Penicillin StreptomycinInvitrogen15140-122
Petri dishes (all sizes)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1toxic
Propidium iodid (PI)Sigma Aldrich81845-25MGtoxic
U138ATCCHTB-14
VibratomeLeicaLeica VT 1200

Ссылки

  1. Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
  2. Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
  3. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
  6. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
  7. Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  8. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
  9. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  10. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  11. Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
  12. Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
  13. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  14. Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
  15. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  16. Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. . New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , (2005).
  17. Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
  18. Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
  19. Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
  20. Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
  21. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  22. Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
  23. Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
  24. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
  25. Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
  26. Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
  27. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
  28. Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
  29. He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
  30. Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
  31. Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
  32. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
  33. Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
  34. Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
  35. Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
  36. Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
  37. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
  38. Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
  39. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
  40. Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
  41. Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

126organotypic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены