Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

Резюме

В настоящем документе представлен протокол обработки крио-ЭМ изображений с использованием программного комплекса SPHIRE. Настоящий протокол может быть применен практически для всех одномерных ЭМ-проектов, нацеленных на решение задач с атомным разрешением.

Аннотация

SPHIRE (SPARX для электронной микроскопии высокого разрешения) представляет собой новый программный пакет с открытым исходным кодом, удобный для полуавтоматической обработки данных одноэлектронной крио-микроскопии (крио-ЭМ). Представленный здесь протокол детально описывает, как получить близкую к атомному разрешению структуру, начиная с кинофильмов с крио-ЭМ-микроскопом, направляя пользователей на всех этапах контура определения структуры одной частицы. Этими шагами управляют из нового графического интерфейса пользователя SPHIRE и требуют минимального вмешательства пользователя. Используя этот протокол, структура 3.5 Tc TcdA1, комплекса Tc-токсина от Photorhabdus luminescens , была получена только из 9500 отдельных частиц. Этот оптимизированный подход поможет начинающим пользователям без обширного опыта обработки и априорной структурной информации получить бесшумные и беспристрастные атомные модели их очищенных макромолекулярных комплексов в их собственном состоянии.

Введение

После разработки технологии прямого детектора электронов замечательный прогресс в криоэлектронике с одиночной частицей в настоящее время перестраивает структурную биологию ¹ . По сравнению с рентгеновской кристаллографией этот метод требует лишь небольшого количества белкового материала без необходимости кристаллизации, одновременно создавая меньше ограничений по чистоте образца и все же позволяя определять структуры при близком атомном разрешении. Важно отметить, что различные составы или состояния теперь могут быть разделены вычислительно, и определение структуры различных конформаций может быть выполнено на беспрецедентном уровне детализации. В последнее время карты плотности сложных молекул могут быть получены при разрешениях, допускающих построение модели de novo и, следовательно, глубоком понимании их действия ^{2 , 3 , 4 , 5},

Широкое разнообразие программных пакетов для обработки изображений доступно в сообществе 3DEM (3D Electron Microscopy) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), и большинство из них находятся в непрерывном развитии. Достигнута почти атомная разрешающая способность для белков, обладающих различными молекулярными массами и симметриями, с несколькими различными программными пакетами, включая EMAN2 ⁶ , IMAGIC ⁷ , FREALIGN ⁸ , RELION ⁹ , SPIDER ¹⁰ и SPARX ¹¹ . Каждый пакет требует различного уровня знаний пользователей и обеспечивает другой уровень руководства пользователя, автоматизации и расширяемости. Более того, в то время как некоторые программы предоставляют полные среды для облегчения всех этапов анализа изображений, другие предназначены для оптимизации конкретных задач, таких как уточнение параметров выравнивания, начиная с известного rСтруктурная структура - мат. В последнее время было разработано несколько платформ, включая APPION ¹² и SCIPION ¹³ , которые обеспечивают единый конвейер обработки данных, который объединяет подходы и протоколы из различных пакетов программного обеспечения, перечисленных выше.

Чтобы внести свой вклад в текущую разработку крио-ЭМ, SPARX был переработан в новую самостоятельную и полную платформу для анализа одиночных частиц под названием SPHIRE (SPARX для электронной микроскопии высокого разрешения). Чтобы повысить доступность технологии для новых исследователей в этой области и справиться с большим объемом данных, получаемых с помощью современных полностью автоматизированных электронных микроскопов высокого класса, технологический конвейер был переработан и упрощен за счет введения простого в использовании Графический интерфейс пользователя (GUI) и автоматизация основных этапов рабочего процесса. Кроме того, были добавлены новые алгоритмы для быстрого, воспроизводимого и автоматического определения структуры от crYo-EM изображений. Кроме того, была введена валидация по воспроизводимости, чтобы избежать общих артефактов, возникающих в процессе уточнения и анализа неоднородности.

Несмотря на то, что программа была широко изменена, поддерживались ее основные функции: прямой код с открытым исходным кодом, современный объектно-ориентированный дизайн и интерфейсы Python для всех основных функций. Таким образом, он не был изменен на программу черного ящика, что позволяет пользователям изучать и легко модифицировать код Python, создавать дополнительные приложения или изменять общий рабочий процесс. Это особенно полезно для нестандартных проектов крио-ЭМ.

Здесь мы представляем протокол для получения карты плотности почти-атомного разрешения из крио-ЭМ изображений с использованием GUI SPHIRE. Он подробно описывает все этапы, необходимые для создания карты плотности из сырых крио-ЭМ фильмов прямого детектора и не ограничивается каким-либо конкретным типом макромолекул. Этот протокол в первую очередь предназначен для руководства newcOmers в поле через рабочий процесс и предоставить важную информацию об основных этапах обработки, а также некоторые из возможных ловушек и препятствий. Более подробные сведения и теоретические основы SPHIRE будут описаны в другом месте.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы следовать этому протоколу, необходимо правильно установить SPHIRE в системе с установкой MPI (в настоящее время это кластер Linux). Загрузите SPHIRE и набор данных TcdA1 с сайта http://www.sphire.mpg.de и следуйте инструкциям по установке: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Эта процедура также устанавливает EMAN2. SPHIRE в настоящее время использует e2boxer от EMAN2 для выбора частиц и e2display для отображения файлов изображений. Для доза-взвешенной коррекции движения исходных фильмов с микрофотографией SPHIRE использует размытие ¹⁴ . Загрузите программу и следуйте инструкциям по установке (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). Для интерактивной визуализации полученных структур протокол будет использовать программу молекулярной графики Chimera ¹⁵ (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). Хорошим учебным пособием для ознакомления с функциями, используемыми в этом протоколе, может быть fouИ здесь: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Инструкции по отправке параллельного задания в кластер из GUI SPHIRE можно найти здесь: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. Общая организация графического интерфейса SPHIRE и основные этапы рабочего процесса, выполняемые в этом протоколе, показаны на рисунке 1 .

1. ПРОЕКТ: задайте постоянные значения параметров для этого проекта.

1. Запустите приложение SPHIRE GUI, набрав « sphire &» и клавишу «ENTER» в окне терминала .
2. Настройте параметры всего проекта ( например, размер пикселя, радиус частицы и симметрию) в соответствующих полях ввода страницы настроек проекта, а затем зарегистрируйте эти значения для всех последующих этапов рабочего процесса.
   1. Нажмите на значок «ПРОЕКТ» в нижней правой части левой панели, чтобы открыть страницу настроек проекта.
   2. Измерьте самую длинную ось частицы, используя интерактивный инструмент отображения изображения e2display.py, затем введите половину размера частиц в «Радиус частицы белка». Если измерение находится в Å, имейте в виду, что для преобразования единицы в пиксели используйте размер пикселя ( например, если частица имеет длину 200 Å и размер пикселя составляет 1,2 Å / пиксель, тогда самая длинная ось частицы равна 200 / 1.2 = ~ 166 пикселей и радиус 166/2 = 83 пикселя).
   3. Установите «Размер ящика частиц» как минимум в 1,5 раза от размера частиц. Избегайте размеров окон, содержащих большое простое число. Кроме того, помните, что для 3D-алгоритма уточнения в настоящее время требуется четный размер окна.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Окно должно включать в себя поле для учета начальных ошибок центрирования, возникающих при выборе (необходимость сдвига частиц внутри окна) и достаточной области фона за пределами границы частицы для надлежащей коррекции CTF (особенно важно при больших значениях дефокусировки) ^16).
   4. Установите «Размер окна CTF» в «Размер ящика частиц». Для проектов с низкой контрастностью используйте большее окно, чтобы получить более плавные оценки спектров мощности.
   5. Установите «Точечная группа симметрии» комплекса ( например, «C5»). Если симметрия целевой структуры неизвестна, оставьте ее на «C1» (асимметричной). Однако, если позднее во время обработки идентифицировать определенную симметрию высокого порядка, измените эту настройку симметрии соответствующим образом и повторите шаги после двумерного выравнивания с ISAC.
   6. Установите «молекулярная масса белка» в кДа (приблизительное значение будет достаточным). Нажмите кнопку «Регистрация настроек».

2. ВИДЕО: выровняйте кадры каждой микрофотографии фильма, чтобы исправить общее движение образца

1. Для всех кинофотографий вычислите x / y-сдвиги для всех кадров и затем создайте их невзвешенную дозу и взвешенную дозу mo(См. Обсуждение). Обратите внимание, что первый необходим только для оценки CTF, потому что оценка не работает хорошо с средневзвешенными дозами, в то время как последняя используется для всех других этапов определения структуры.
   1. Нажмите на значок «MOVIE», а затем на кнопку «Micrograph Movie Alignment». Установите «Unblur executable path», выбрав исполняемый файл. Установите «Образец пути входной микрографии», выбрав необработанную микрофотографию для фильма и заменяя переменную часть имен файлов подстановочным знаком «*» ( например, TcdA1 _ *. Mrc). Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Установите «исполняемый файл Summovie», выбрав исполняемый файл.
   3. Установите «Количество кадров фильма» на количество кадров на каждой микрофотографии. Установите значения «Напряжение микроскопа» и «Радиус кадра» на значения, используемые при сборе данных. (Для примераLe, если общая доза 60 e ^- / Å ² при 20 кадрах, записанных без предварительной экспозиции, экспозиция для каждого кадра равна 60/20 = 3 e ^- / A ² ). Нажмите кнопку «Run Command» для выравнивания Кадры каждого фильма микрофотографии.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это автоматически создаст две выходные каталоги, содержащие дозо-невзвешенные и взвешенные по дозе средние микрофотографии с коррекцией движения, соответственно.

3. CTER: Оцените параметры расфокусировки и астигматизма CTF

1. Оцените параметры CTF (расфокусировка и астигматизм, остальные устанавливаются пользователем) для каждого невзвешенного по дозам микрофотографии.
   1. Нажмите на иконку «CTER» и затем кнопку «CTF Estimation». Чтобы установить «шаблон маршрута входной микрографии», выберите микрограмму с коррекцией движения с учетом невзвешенной дозы, затем замените переменную часть имен файлов на подстановочный знак"*". Также укажите путь к «Output directory».
   2. Установите «Amplitude contrast» («Амплитудный контраст») в значение, обычно используемое для данных (толщина льда является основным фактором) и напряжение микроскопа в лаборатории ( например, 10%). Типичные значения находятся в диапазоне 7-14% ¹⁷ .
   3. Установите «Сферическая аберрация микроскопа (Cs)» и «Напряжение микроскопа», используемое при сборе данных.
   4. Установите «Наименьшая частота» и «Наивысшая частота» диапазона поиска для подгонки модели CTF к 0.0285 и 0.285 Å ^-1 (40 - 4 Å) соответственно. Нажмите кнопку «Run command», чтобы оценить параметры CTF.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры CTF будут автоматически сохранены в файле partres.txt в указанном каталоге вывода. Оценка CTF 112 микроснимков была рассчитана на 96 ядрах и закончилась через ~ 3 минуты в кластере Linux, используемом для получения репрезентативных результатов.

4. ОКНО: Извлечь частицы из взвешенных по дозе средних микрофотографий

1. Выбирайте частицы вручную или автоматически с помощью микроснимков с помощью e2boxer ⁶ и создавайте координатные файлы, каждый из которых содержит список координат частиц xy на соответствующей микрофотографии.
   1. Нажмите на иконку «WINDOW», а затем на кнопку «Particle Picking». Нажмите кнопку «Запустить команду», чтобы запустить e2boxer ⁶ и выбрать частицы каждой микрофотографии вручную или автоматически ¹⁸ (см. Обсуждение ). Сохраните окончательные координаты частиц для каждого микроснимка в формате файла EMAN1 (.box). Также можно импортировать координатные файлы из других программ после преобразования их в формат EMAN1.
2. Создайте стеки частиц, извлекая изображения частиц с взвешенных по дозе микрофотографий (в SPHIRE стек частиц частоEn просто называется «стек»).
   1. Нажмите кнопку «Экстракция частиц». Укажите «Образец маршрута входной микрографии», выбрав взвешенную дозу микрофотограмму с корректировкой движения, а затем заменив переменную часть имен файлов на подстановочную букву «*» ( например, TcdA1 _ *. Mrc). Аналогично, установите «Образец пути входных координат», выбрав файл координат ( например, TcdA1 _ *. Box). Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Установите «Источник параметров CTF», выбрав файл параметров CTF (partres.txt, полученный на шаге 3.1). Нажмите кнопку «Выполнить команду».
3. Объедините извлеченные стеки изображений частиц в одну.
   1. Нажмите на кнопку «Particle Stack». Укажите путь к «Вывести стек виртуальных изображений», используя формат пути к файлу BDB ( например, «bdb: Particles / stack», где «Particles» указывает на thE, содержащий каталог базы данных BDB, имя которого всегда EMAN2DB, а «стек» относится к определенному стеку изображений в этой базе данных). Укажите «Образец стека изображения входного BDB», выбрав каталог, начинающийся с «mpi_proc», а затем заменив переменную часть имен каталога на «*» ( например, Particles / mpi_proc_000 на Particles / mpi_proc_ *). Нажмите кнопку «Выполнить команду».

5. ISAC: классификация изображений частиц в 2D

1. Вычислите средние значения 2D-класса, выровняв частицы и объединив их в соответствии с их двумерным внешним видом.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Полученные средние значения 2D имеют улучшенное отношение сигнал / шум (SNR) по сравнению с отдельными изображениями частиц и поэтому используются для визуальной оценки качества и неоднородности набора данных, а также для сортировки нежелательных изображений со стека ( Например, кристаллы льда, края углерода,Агрегаты, фрагменты и т . Д.). ¹⁹ . Более того, в дальнейшем они будут использоваться для определения исходной 3D-модели.
   1. Щелкните значок «ISAC», а затем кнопку «Кластер ISAC - 2D». Установите «Стек входного изображения», выбрав файл стека, содержащий извлеченные частицы. Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Используйте 200 - 1000 для «Изображений в классе». Выберите подходящее число, учитывая ожидаемое число классов 2D (общее количество частиц, деленное на количество изображений в классе). Отрегулируйте этот параметр в зависимости от SNR и размера набора данных. Увеличивайте количество участников в классе, если набор данных чрезмерно шумный. Уменьшите число, когда доступно небольшое количество частиц.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Из-за ограничений памяти, для довольно больших наборов данных (> 100 000 частиц), разбить полный набор данных на подмножества, выполнить ISAC для каждого подмножества независимо и объединитьРезультаты в конце. Подробные инструкции для этого сценария обработки приведены в http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
   3. Установите флажок «Фаза-флип». Сохраняйте значения по умолчанию для «Target radius radius» и «Target image size size», чтобы ускорить процесс, автоматически уменьшая все изображения частиц с этими настройками. Нажмите кнопку «Run command», чтобы вычислить средние классы 2D.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг требует вычислительной нагрузки и значительно увеличивает время работы с количеством частиц и классов, а также с радиусом цели и размером изображения. На кластере с 96 процессами 2D-классификация ~ 10000 частиц завершается примерно через 90 мин.
2. Выведите на экран и визуально проверьте полученные в результате средние значения ISAC 2D, чтобы убедиться, что их качество удовлетворительное (см. Обсуждение).
   1. Нажмите кнопку «Отобразить данные» в разделе «ЭЛЕКТРОСВЯЗИ». Задавать "«Входные файлы», выбрав файл, содержащий средние значения ISAC 2D (class_averages.hdf, полученные на шаге 5.1). Нажмите кнопку «Запустить команду», чтобы отобразить окончательные воспроизводимые и проверенные средние классы, предоставленные ISAC.
3. Создайте новый стек, включающий в себя только члены частиц из проверенных средних классов.
   1. Нажмите кнопку «Создать подмножество стеков». Установите «Стек входного изображения», выбрав тот же файл стека, что и в шаге 5.1.1. Установите «Средние значения ISAC», выбирая средние значения ISAC 2D (class_averages.hdf, полученные в шаге 5.1). Укажите путь для «Выходной каталог». Нажмите кнопку «Выполнить команду».

6. VIPER: рассчитать начальную 3D-модель

1. Выберите небольшой набор средних классов (≥100 изображений), удалив все плохие средние классы и идентичные виды частицы (см. Обсуждение) и используйте их для вычисления repС помощью VIPER. Помните, что выбор должен содержать не менее 60-80 высококачественных средних значений с ~ 200-500 участниками каждый.
   1. Нажмите значок «VIPER» и затем кнопку «Отобразить данные». Установите «Входные файлы», выбрав средние значения ISAC 2D (class_averages.hdf, полученные в шаге 5.1). Нажмите кнопку «Выполнить команду».
   2. Нажмите среднюю кнопку мыши где-нибудь в графическом окне e2display и активируйте кнопку «DEL» во всплывающем окне. Удалите все плохие средние классы и идентичные представления частицы (см. Обсуждение ). Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить оставшиеся средние классы 2D в новом файле.
2. Из выбранных средних значений ISAC создайте начальную ссылку для последующей 3D-обработки.
   1. Нажмите кнопку «Начальная 3D-модель - RVIPER». Установите «Стек входных изображений», выбрав экранированный классСредние значения (полученные на шаге 6.1). Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Убедитесь, что вы используете одно и то же значение для «Target radius radius» как ISAC шаг 5.1.3. Нажмите кнопку «Выполнить команду», чтобы создать воспроизводимую трехмерную модель ab initio .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг требует вычислительных затрат и время работы значительно увеличивается с числом средних и размером частиц. В кластере с 96 процессами это задание (~ 100 классов в среднем) закончилось через ~ 15 мин.
3. Проверьте, является ли полученная трехмерная модель разумной, принимая во внимание средние показатели класса и, кроме того, его структурную целостность ( т.е. отсутствие разъединенных частей и / или направленных артефактов). Чтобы отобразить карту, используйте программу Chimera ¹⁵ . В этот момент выполните первое сравнение с кристаллической структурой гомологичного белка или домена представляющего интерес белка, если он существует (пример показан в разделе RepreseРезультаты.
4. Для последующей 3D-обработки сгенерируйте начальную трехмерную ссылку и 3D-маску из ab initio 3D-модели, удалив окружающий шум и перемасштабировав его в соответствии с исходным размером пикселя.
   1. Нажмите кнопку «Создать 3D-ссылку». Установите «Громкость ввода», выбрав ab initio 3D модель (average_volume.hdf, полученную на шаге 6.2). Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Установите «Resample ratio source», выбрав файл коэффициента сжатия ISAC (README_shrink_ratio.txt, полученный в шаге 5.1). Нажмите кнопку «Выполнить команду».

7. MERIDIEN: Уточнение начального объемного тома

1. Уточните объем 3D, начиная с начальной 3D-модели.
   1. Нажмите на иконку «MERIDIEN», затем кнопку «3D Refinement». Установите «Стек входного изображения» и «Первоначальная трехмерная привязка» с помощью команды seleС использованием стека частиц и трехмерной модели ab initio (произведенной на шагах 5.3 и 6.4 соответственно). Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Установите «3D-маску», выбрав файл 3D-маски (полученный на шаге 6.4). Всегда используйте 3D-маску, но, особенно на ранней стадии анализа, используйте сферическую маску или мягкую красную маску, свободно прилегающую к эталонной, чтобы не вводить смещение неправильной маскировки.
   3. Установите флажок «Применить жесткую 2D-маску». Установите «Начальное разрешение» на значение граничной частоты между 20 - 25 Å. Имейте в виду, что фильтр нижних частот с этой частотой среза будет применен к исходной трехмерной структуре, чтобы уменьшить смещение исходной модели.
   4. Проверьте спецификации кластера, используемого для этого процесса, а затем установите «Память на узел» в доступную память в гигабайтах. Нажмите кнопку «Run command», чтобы полностью автоматизировать 3D-объем, начиная с исходной 3D-модели.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эта процедура разделит набор данных на две половины, независимо очистит две модели и выведет два необработанных тома, каждый из которых будет состоять только из половины частиц. Это требует вычислительных ресурсов, и время работы значительно возрастет с увеличением количества частиц. На этом кластере уточнение меридиана закончилось через ~ 2,5 часа, работая на 192 процессах (~ 8000 частиц, размер ящика 352).
2. Создайте 3D-маску с мягким краем из усовершенствованного тома для последующего шага заточки.
   1. Нажмите кнопку «Adaptive 3D Mask». Установите «Громкость ввода», выбрав один из полуфильмов без фильтра (произведенный на шаге 7.1). Укажите путь для «Маска вывода».
   2. Установите значение «Порог бинаризации». Используйте Chimera, чтобы убедиться, что при данном пороге шум явно выходит за пределы интересующего объема в области растворителя нефильтрованных половинных карт и все плотности белка все еще сСоединенных друг с другом. Нажмите кнопку «Выполнить команду», чтобы создать 3D-маску софт-края.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Основная часть полученной маски (состоящей из вокселов, значения которых> 0,5) должна плотно прилегать к структуре частиц, но при этом охватывать все интересующие плотности. Падение мягкого края должно быть не менее 8-10 пикселей в ширину.
3. Объедините два нефильтрованных полутома, полученные с помощью 3D-обработки. Затем заострите объединенный объем, настроив спектр мощности на основе функции передачи модуляции (MTF) детектора, оцененного коэффициента B и оценки коррекции Фурье-преобразования (FSC) разрешения.
   1. Выберите кнопку «Заточка». Установите «First unfiltered half-volume» и «Second unfiltered half-volume», выбрав соответствующие файлы (vol_0_unfil.hdf и vol_1_unfil.hdf, полученные на шаге 7.1). Всегда используйте «усиление B-фактора». Как правило, сохраняйте значение по умолчанию, чтобы eПодстройте значение коэффициента B из входного набора данных, используя диапазон между конечной разрешающей частотой и 10 Å. Также можно указать специальное значение ( например, -100).
   2. Сохраняйте значение по умолчанию для «Частота фильтра низких частот», чтобы применить фильтр на основе FSC.
   3. Задайте маску, заданную пользователем, выбрав 3D-маску (созданную на шаге 7.2). Помните, что сообщаемое разрешение будет определено с использованием FSC с этой маской. Нажмите кнопку «Выполнить команду», чтобы увеличить резкость 3D-тома.
4. Создайте трехмерную карту углового распределения из направлений проекции всех частиц, оцененных с помощью шага 3D-детализации выше.
   1. Нажмите кнопку «Угловое распределение». Установите «Файл параметров выравнивания», выбрав файл (final_params.txt, полученный на шаге 7.1), и нажмите кнопку «Run command».
5. Визуально осмотрите заточенную 3D-модель, используя ChiMera. Убедитесь, что структура представляется разумной с учетом достигнутого разрешения (см. Обсуждение ).
6. Визуально проверьте угловое распределение с помощью Chimera. Убедитесь, что распределение распространяется примерно равномерно по всему пространственному угловому пространству. Имейте в виду, что для симметричных структур распределение ограничено внутри уникального асимметричного треугольника.

8. SORT3D: Сортировка трехмерной неоднородности путем фокусирования на сильно варьируемых областях

1. Вычислите карту трехмерной изменчивости из стека частиц, используемого в 3D-обработке.
   1. Нажмите на иконку «SORT3D», а затем кнопку «3D Variability Estimation». Установите «Стек входного изображения», выбрав один и тот же экранированный стек частиц, указанный на этапе 3D-уточнения 7.1.1. Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Сохраняйте значение по умолчанию для «Число прогнозов».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Изображения от углового соседаКапот будет использоваться для оценки двумерной дисперсии при каждом трехмерном угле проекции. Чем больше число, тем менее шумно оценка, но тем ниже разрешение и вращательные артефакты более выражены.
   3. Установите флажок «Использовать CTF». Нажмите кнопку «Выполнить команду».
2. С помощью карты пространственной изменчивости создайте маску фокуса для шага 3D-кластеризации ниже.
   1. Выберите кнопку «Binary 3D Mask». Установите «Объем громкости», выбрав карту 3D-изменчивости (полученную на шаге 8.1). Укажите путь к файлу для «Маска вывода».
   2. Установите «порог бинаризации», используя вывод поля «Уровень» в «Volume Viewer» из «Химеры». Нажмите кнопку «Выполнить команду».
3. Отсортируйте изображения частиц в однородные структурные группы, сосредоточив внимание на структурно сильно переменных областях.
   1. Нажмите кнопку «3D-кластеризация - RSORT3D».Установите «Каталог уточнения входного 3D», выбрав каталог вывода 3D-обработки (произведенный на шаге 7.1). Укажите путь для «Выходной каталог».
   2. Установите «3D-маска», выбрав 3D-маску со сглаженными краями (полученную на шаге 7.2). Установите «Фокусную 3D-маску», выбрав бинаризованную карту 3D-изменчивости (полученную на шаге 8.2).
   3. Для больших наборов данных используйте не менее 5000-10000 для «Изображений на группу». Имейте в виду, что программа всегда сохраняет количество изображений в группе ниже этого значения. Отрегулируйте значение, учитывая ожидаемое количество 3D-групп (общее количество частиц, деленное на значение «Изображения на группу»), набор данных, SNR и степень неоднородности. Начните с ~ 5-10 исходных 3D-групп, если доступно достаточное количество частиц, если не ожидается большее число различных структурных состояний в наборе данных.
   4. Используйте как минимум 3000-5000 частиц для «Наименьшего размера группы».Обратите внимание, что программа будет игнорировать группы, содержащие меньшее количество изображений, чем установка «Наименьший размер группы». Нажмите кнопку «Выполнить команду», чтобы выполнить 3D-кластеризацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ. RSORT3D подразделяется на два этапа. Первый шаг «sort3d» сортирует трехмерную неоднородность. Затем он восстанавливает объемы каждой однородной структурной группы, используя параметры 3D-выравнивания, определенные с помощью шага 3D-детализации выше. Второй шаг «rsort3d» обнаруживает воспроизводимые элементы каждой группы, выполняя двухстороннее сравнение двух независимых прогонов сортировки. Затем он восстанавливает однородные структуры, используя только воспроизводимо назначенные частицы. На кластере с 96 ядрами это задание (~ 8000 частиц, размер ячейки 352) закончилось примерно через 3 часа.
4. По завершении программы используйте Chimera для выбора однородной 3D-группы. Выберите структуру с наивысшим кажущимся разрешением, как правило, связанное с наибольшим по. Убедитесь, что выбранная структура визуально обоснована, принимая во внимание средние значения 2D-класса и биологические аспекты интересующего белка (см. Обсуждение ). Если есть другие тома, имеющие почти идентичную структуру при одинаковом разрешении, считают их выходящими из одной однородной 3D-группы.
5. Выполните локальное уточнение по частицам самой однородной 3D-группы (с самым высоким разрешением).
   1. Нажмите кнопку «Локальное уточнение подмножества». Установите «Путь к текстовому файлу подмножества», выбрав текстовый файл, содержащий идентификаторы частиц выбранной группы ( например, Cluster0.txt , полученный на шаге 8.3). Установите «3D-каталог уточнения», выбрав каталог вывода предыдущей 3D-обработки (произведенной на шаге 7.1).
   2. Установите «Перезапуск итерации» на тот, где достигается самое высокое разрешение в предыдущей 3D-обработке. нажмитеКнопка «Выполнить команду» позволяет выполнить локальное уточнение выбранной совокупности частиц.
6. Подобно шагу 7.2, создайте 3D-маску с мягким краем из нефильтрованного конечного полуобъемчика, восстановленного с помощью уточнения локального подмножества.
7. Аналогично шагу 7.3 слияние двух нефильтрованных конечных полутомов, полученных с помощью уточнения локального подмножества, и затачивание объединенных томов. Однако на этот раз не отфильтруйте заостренный объем.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Если анализ неоднородности на этапе 8.4 указывает несколько различных состояний при сопоставимом разрешении, можно захотеть уточнить все разные состояния независимо.

9. LOCALRES: Оцените локальное разрешение финального 3D-тома

1. Оцените локальное разрешение 3D-объема, полученного из однородного множества частиц.
   1. Нажмите на иконку «LOCALRES», а затем на кнопку «Local Resolution». Установите «Первый полутор» и «Вторая половина»«Объем», выбрав нефильтрованные окончательные полутомы уточнения локального подмножества (произведенного на шаге 8.5). Установите «3D-маску», выбрав 3D-маску со сглаженными краями, созданную на шаге 8.6. Укажите путь к файлу для «Output volume» ,
   2. Сохраняйте значение по умолчанию 7 пикселей для «размера окна FSC». Помните, что этот параметр определяет размер окна, в котором вычисляется корреляция между локальным и реальным пространством; Большие размеры окна обеспечивают более плавные карты разрешения за счет локальной разрешимости.
   3. Сохраняйте значение по умолчанию 0.5 «Разрешающая способность разрешения» для критерия разрешения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для каждого воксела программа будет сообщать локальное разрешение как частоту, при которой локальный FSC опускается ниже выбранного порога разрешения. Пороговое значение ниже 0,5 не рекомендуется, поскольку более низкие значения корреляции имеют высокую статистическую неопределенность. Поэтому соответствующее локальное разрешение будет сильно изменяться между вокселами.
   4. Для "OveraLl resolution ", задайте абсолютное разрешение, оцененное при заточке после уточнения локального подмножества (шаг 8.7). Нажмите кнопку« Run command », чтобы вычислить локальное разрешение тома.
2. Примените трехмерный локальный фильтр к току, заточенному после уточнения локального подмножества, используя карту локального разрешения 3D.
   1. Нажмите кнопку «3D Local Filter». Установите «Громкость входа», выбрав заостренный, но нефильтрованный объем 3D (произведенный на шаге 8.7). Аналогичным образом установите «Local resolution file» и «3D mask» (созданный на шагах 9.1 и 8.6, соответственно). Помните, что 3D-маска определяет область, в которой будет применяться локальная фильтрация. Укажите путь к файлу для «Output volume». Нажмите кнопку «Run command», чтобы применить 3D-фильтр.
3. Используйте Chimera для визуальной проверки окончательной 3D-модели и карты локального разрешения 3D (произведенной на шагах 9,2 и 9,1, соответственноectively). Выберите «Цвет поверхности», чтобы покрасить объемный объем в соответствии с местным разрешением. Имейте в виду, что распределение локального разрешения должно быть плавным (см. Обсуждение ).

Результаты

Описанный выше протокол выполнялся, начиная с 112 прямых фильмов детектора компонента А комплекса Tchc1 ( Photonhabdus luminescens Tc) (TcdA1) ^{20 , 21 , 22} . Этот набор данных был записан на Cs-скорректированном электронном крио-микроскопе с высокояркой полевой эмиссионной пушкой (XFEG), работающей при ускоряющем напряжении 300 кВ. Изображения были получены автоматически с общей дозой 60 e ^- / Å ^-2 при размере пикселя 1,14 Å в масштабе образца. После выравнивания кадров кинофильма ( этап 2 протокола) полученные в результате движения скорректированные средние значения имели изотропные кольца Тона, простирающиеся до высокого разрешения ( рис. 2а ). Отдельные частицы были хорошо видны и хорошо разделены ( рис. 2b ). Частицы затем собирали с помощью инструмента swarm e2boxerLass = "xref"> 18 ( этап протокола 4.1 ). В этом случае соответствующий порог был установлен с использованием более селективного варианта ( рисунок 2c ). 112 цифровых микрофотографий дали 9 652 частицы. Большинство извлеченных изображений ( этап протокола 4.2 ) содержало четко определенные частицы, и размер их ящиков был ~ 1.5 раза больше, чем размер частиц, как рекомендовалось ( рисунок 2d ). Затем, используя ISAC, был выполнен 2D анализ неоднородности ( Протокол 5 ). Это дало средние 98 классов ( Рисунок 3a ). Используя эти средние классы 2D, модель ab initio была рассчитана с использованием VIPER ( протокол Step 6 ) при промежуточном разрешении ( рис. 3b ). Эта модель демонстрирует превосходное согласие с кристаллической структурой TcdA1, ранее решённой при 3.9 Å резолюции ²² ( рис. 3c ). Эта модель ab initio использовалась в качестве начальной температуры Пластины для 3D-уточнения (MERIDIEN), что дает 3.5 A (0,143 критерия) реконструкцию ( протокол Step 7 ) только из ~ 40 000 асимметричных единиц ( рисунок 4 ). Эта карта близкого к атомному разрешению была получена за 24 часа, используя до 96 процессоров для шагов рабочего процесса, которые выигрывают от нескольких ядер.

Для анализа трехмерной изменчивости (шаг протокола 8) на этапе 8.3.3 использовалось только 2000 изображений частиц в каждой группе ( т.е. процесс начинается с 5 исходных трехмерных групп) и 200 изображений для наименьшего размера группы на этапе 8.3.4 из-за Небольшое количество частиц (~ 10000). Анализ показал локализованную гибкость, главным образом, в N-концевой области комплекса, который содержит метку His, используемую для очистки ( фиг.5а ). Действительно, двенадцать N-концевых остатков и His-метка не были разрешены в ранее опубликованной кристаллической структуре TcdA1"> 22, и этот, по-видимому, беспорядочный район остался неразрешенным в существующей плотности крио-ЭМ, вероятно из-за его гибкости. Была обнаружена дополнительная изменчивость в рецептор-связывающих доменах и BC-связывающем домене ( рис. 5а ). Удовлетворительного разрешения структуры и относительно небольшого размера набора данных эта гетерогенность была признана приемлемой и, следовательно, не была выполнена сфокусированная 3D-классификация ^23. Наконец, было вычислено локальное разрешение окончательной карты плотности ( протокол 9.1, рисунок 5b ), и заточенная 3D-карта была локально отфильтрована ( протокол 9.2) . Объем этого качества может быть использован для создания новой модели с использованием Coot ²⁴ или любого другого инструмента уточнения ( рисунок 6 ).

Рисунок 1: Обработка изображений с использованием SPHIRE. ( A ) GUI программного пакета SPHIRE. Определенный этап рабочего процесса можно активировать, выбрав соответствующую пиктограмму в левой части графического интерфейса («шаг рабочего процесса»). Команды и утилиты, связанные с этим шагом рабочего процесса, будут отображаться в центральной области графического интерфейса. После выбора одной из команд соответствующие параметры отображаются в правой области графического интерфейса. Расширенные параметры обычно не требуют изменения предустановленных значений по умолчанию. ( B ) Этапы рабочего процесса обработки одиночных изображений с использованием графического интерфейса SPHIRE. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Коррекция движения и ParticИзвлечение. ( A , b ) Типичная цифровая микрофотография с высоким разрешением, с низкой дозой, с коррекцией дрейфа, записанная при расфокусировке 1,7 мкм. Обратите внимание на изотропные кольца Тона, простирающиеся до разрешения 2,7 Å в спектре мощности (a) и хорошо различимые частицы на двумерном изображении ( b ). ( C ) Выбор частиц с помощью e2boxer. Зеленые круги указывают выбранные частицы. ( D ) Типичные необработанные частицы, извлеченные из взвешенной дозы микрофотографии. Шкала шкалы = 20 нм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: 2D-кластеризация и создание исходной модели. ( A ) Галерея средних значений 2D-класса, большинство из которых представляют виды сбоку o Частица. Шкала шкалы = 20 нм. ( B ) Ab initio 3D-карта TcdA1, полученная с использованием RVIPER, от средних значений без ссылки. ( C ) Подгонка жесткой структуры кристаллической структуры TcdA1 (ленты) (pdb-id 1VW1) в начальную плотность крио-ЭМ (прозрачная серая). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Cryo-EM 3D-структура TcdA1. ( A , b ) Окончательная карта плотности 3,5 TcdA1, рассчитанная с использованием ~ 9500 изображений частиц: ( a ) сторона и ( b ) вид сверху. ( C ) Репрезентативные области плотности крио-ЭМ для α-спирали и β-листа.Arge.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Анализ изменчивости и локальное разрешение. ( A ) Поверхность заостренной крио-EM карты TcdA1 (серая) и карта изменчивости (зеленая). Для большей наглядности карта изменчивости была фильтром нижних частот до 30 Å. ( B ) Поверхностный рендеринг заостренной крио-EM карты TcdA1, окрашенной в соответствии с местным разрешением (Å). Обратите внимание на топологическое согласие между областями высокой изменчивости и низким локальным разрешением. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: 3D-моделированиеEl Здание TcdA1 с использованием Coot. Для α-спирали показаны репрезентативные области плотности крио-ЭМ и атомная модель. Атомная модель была построена de novo с использованием Coot. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В последние годы криоэлектрик с одиночной частицей показал быстрое развитие и поставил многочисленные структуры атомного разрешения высокомолекулярных комплексов с большим биологическим значением ²⁵ . Для поддержки большого числа начинающих пользователей, которые в настоящее время входят в поле, мы разработали платформу SPHIRE для анализа одиночных частиц и представили здесь сквозной протокол для всего рабочего процесса, включая выравнивание видео, подбор частиц, оценку CTF, исходную модель Расчет, 2D и 3D анализ неоднородности, 3D-анализ с высоким разрешением и локальное разрешение и фильтрацию.

Описанный здесь протокол предназначен для краткого руководства по определению трехмерной структуры с использованием крио-ЭМ микроснимков представляющего интерес белка и с помощью вычислительных средств, предоставляемых автономным графическим интерфейсом SPHIRE.

Главная особенность рабочего процесса состоит в том, что большинствоПроцедуры должны выполняться только один раз, поскольку они полагаются на концепцию валидации по воспроизводимости ¹⁹ и не требуют настройки параметров. Этот механизм автоматической проверки является основным преимуществом SPHIRE над другими программными пакетами, поскольку результаты, как правило, являются объективными, а также воспроизводимыми и, что наиболее важно, доступными при приемлемых вычислительных затратах. Кроме того, конвейер предоставляет обширную диагностическую информацию для опытных пользователей, чтобы провести независимую проверку и оценку собственными методами. Тем не менее, начинающий пользователь, обладающий, по крайней мере, элементарным теоретическим опытом в области структурной биологии и электронной микроскопии, должен иметь возможность получать структуры с почти атомарным разрешением, используя собственные данные и автоматизированные процедуры проверки.

Однако получение структуры с почти атомарным разрешением не всегда просто, и результат будет в большой степени зависеть от качества образца и входного сигнала datа. Для процедур, представленных здесь, предполагается, что имеется достаточное количество высококачественных невыровненных необработанных фильмов ЭМ, при этом их средние величины показывают четко различимые однородные и случайно ориентированные одиночные частицы. В общем, нет никаких ограничений в отношении симметрии, размера или общей формы молекулы, но лимитирующим фактором может быть низкая молекулярная масса, особенно когда белок имеет безликую глобулярную форму. Обычно анализ более крупных, хорошо упорядоченных частиц с высокой симметрией в точечной группе менее требователен. Поэтому настоятельно рекомендуется начинающим пользователям сначала запустить настоящий протокол с хорошо охарактеризованным набором крио-EM. Либо учебные материалы SPHIRE (http: /sphire.mpg.de), либо один из наборов данных EMPIAR (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) с сырыми фильмами - хорошая отправная точка ,

При обработке собственных данных весьма вероятно, что некоторые наборы данных или некоторые из изображений не будут удовлетворять определенным требованиямКритериях. В этом контексте в дополнение к автоматическим проверкам стабильности и воспроизводимости, выполняемым программой для основных этапов рабочего процесса, все же рекомендуется для пользователей визуально проверять результаты на определенных «контрольных точках» протокола, особенно если окончательная реконструкция Не является удовлетворительным.

Первый визуальный осмотр может быть выполнен на уровне микрофотографии после выравнивания видео ( протокол 2 ) и оценки CTF ( протокол 3 ). Полученные в результате скорректированные по движению средние значения должны демонстрировать четко различимые и хорошо разделенные отдельные частицы, и в их спектрах мощности должны быть четко различимы изотропные кольца Тона. Пространственная частота, на которую они видимы, в большинстве случаев определяет самое высокое разрешение, до которого в принципе может быть в конечном итоге определена структура. Примеры скорректированного с движением усреднения достаточного качества и его энергетического спектра показаны в разделе & #34. Представительские результаты ". Исчерпывающие изображения, которые могут оказать негативное влияние на конечный результат, могут быть удалены с помощью инструментов GUI для оценки Drift и CTF SPHIRE (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

Что касается скрининга частиц, решающим этапом в конвейере SPHIRE является 2D-классификация с использованием ISAC ( протокол этап 5.2) . Здесь пользователь должен контролировать, что воспроизводимые средние классы 2D, идентифицированные автоматически программой, принимают диапазон ориентации, достаточный для квазиравномерного покрытия углового пространства. Если качество средних классов не является удовлетворительным (шумные и / или размытые изображения) и / или число воспроизводимых средних значений очень невелико, рассмотрите возможность улучшения качества автоматического выбора, оптимизации создания набора данных или подготовки образца. В большинстве случаев невозможно вычислить надежную реконструкцию из набора данных, который не дает хорошие средние классы 2D. Примеры высококачественного пр-ва 2D-классаЯрости показаны в разделе «Представительские результаты».

Для получения надежной исходной 3D-модели с использованием RVIPER в автоматическом режиме ( протокол Protocol 6.1 ) требуется по меньшей мере 100 средних классов. Для этого шага пользователь должен выбрать средние значения с самым высоким качеством и включить как можно больше различных ориентаций частицы. Качество исходной модели имеет решающее значение для успеха последующей 3D-обработки с высоким разрешением.

В других пакетах программ иногда выполняется 3D-классификация для удаления «плохих» частиц ^{8 , 9} . Однако в SPHIRE большинство этих частиц автоматически устраняются уже при 2D классификации с использованием ISAC. Таким образом, рекомендуется выполнить интенсивный по вычислительной обработке шаг 3D-сортировки, только если реконструкция и анализ трехмерной изменчивости указывают на неоднородность набора данных.

Самое главное, пользователь должен всегда тщательно проверять полученные трехмерные объемы ( протокол 9.3 ) и подтверждать, что характеристики соответствующей плотности хорошо согласуются с номинальным разрешением. При разрешении <9 Å становятся видны стержнеобразные плотности, соответствующие α-спиралям. При разрешении <4,5 Å плотности, соответствующие нитям в β-листах, обычно хорошо разделяются и становятся видимыми громоздкие аминокислоты. Карта высокого разрешения (<3 Å) должна иметь четко различимые боковые цепи, что позволяет построить точную атомную модель.

Полученные на сегодняшний день результаты демонстрируют, что с помощью тестов автоматической воспроизводимости SPHIRE и минимальных визуальных осмотров настоящий протокол, как правило, применим к любому типу одноэлектронного крио-ЭМ-проекта. Показаны репрезентативные результаты каждого этапа обработки для реконструкции токсина TcdA1Photorhabdus luminescens ²¹ , который был решен до почти атомарного разрешения. Карты плотностей аналогичного качества могут быть использованы для построения надежных атомных моделей путем трассировки магистральной сети de novo , а также для взаимного или реального уточнения пространства и, таким образом, обеспечивают прочную структурную основу для понимания сложных молекулярных механизмов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ КОДЫ:

Координаты для ЭМ-структуры и необработанных фильмов были помещены в Банк данных электронной микроскопии и Архив экспериментальной электронной микроскопии под номерами EMD-3645 и EMPIAR-10089 соответственно.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SPHIRE	Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas		http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera	University of California, San Francisco		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur	Janelia Farm Research Campus, Ashburn		http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot	MRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridge		http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2	Baylor College of Medicine, Houston		http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 cores	Max Planck Institute of Molecular Physiology		Linux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope	FEI		300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detector	FEI
EPU (automated data acquisition software)	FEI		https://www.fei.com/software/epu/