JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ, которая дает высокой чистоты бета-амилоида (42) и А 42 бета-40 (Aβ40) пептиды амилоида, способными к образованию олигомеров. Амилоида бета является весьма агрегация склонными, гидрофобный пептид участвует в болезни Альцгеймера. Амилоидогенный природа пептида делает его очищение вызов.

Аннотация

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Введение

Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным расстройством, что эффекты, более 35 миллионов человек во всем мире. 1 сильно замешан в возникновении и развитии заболевания, является высоко агрегация склонными, гидрофобный пептид бета - амилоид (A & beta ; ). 2 A & beta ; в диапазоне от 36 до 43 аминокислот в длину, однако, полагают , что вариант 42-аминокислоты, бета - амилоида 42 ( А 42), является наиболее токсичным формой белка. 3 Это связано в основном со способностью к легко А 42 образовывать диффундирующие олигомерные видов, которые считаются особенно нейротоксические лица. 4 Для того , чтобы углубить наше понимание пептида Ар, важно регулярно получать высокую чистоту материала. Наличие следов примесей было показано, резко изменить свойства агрегации Склонность пептида. 5

Traditionally, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) разделение гидрофобных пептидов , таких как A & beta ; было сделано за счет использования комбинации C 4 или C 8 на основе диоксида кремния и стационарные фазы кислой подвижной фазы. 6 Тем не менее, такие условия могут представлять проблему для очистки пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида A (ИЭТ приблизительно 5,5) 7 означает , что в кислых условиях, агрегации пептидов увеличивается , и в результате широкие, без разрешенных пиков ВЭЖХ, которые часто трудно выделить производятся (фиг.2А). Кроме того, такие широкие пики часто содержат примеси, которые могут повлиять на профиль агрегации пептида, и обычно требует последующего раундов очистки, которые могут существенно повлиять на количество пептида, полученного.

Поли (стирол / дивинилбензол) стационарная фаза, PLRP-S, представляет собой альтернативное средство Purifлнение гидрофобные пептиды. Неподвижная фаза была использована при очистке ряда различных белков и мессенджеров рибонуклеиновых кислот (мРНК). 8, 9 Неподвижная фаза PLRP-S не требует дополнительного алкильный лиганд для обратного разделения фаз, и что более важно , является химически стабильным при высоких рН , что приводит к дезагрегации пептида. 7 Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ , которая дает высокой чистоты бета - амилоида (42) и А 42 бета - 40 (Aβ40) пептиды амилоида.

протокол

1. Препаративная ВЭЖХ Очистка Aβ40 или пептидом А 42

  1. Подготовьте следующие буферы для очистки ВЭЖХ.
    1. Готовят буфера А (20 мМ NH 4 OH), добавляя 1,3 мл NH 4 OH (28% раствор) до 1000 мл сверхчистой воды.
    2. Подготовка буфера В (80% ацетонитрила с 20 мМ NH 4 OH), добавляя 1,3 мл NH 4 OH (28% раствора) к раствору 800 мл ВЭЖХ класса ацетонитрила и 200 мл сверхчистой воды.
    3. Подготовка образца для растворения буфера (0,1% NH 4 OH) путем добавления 100 мкл NH 4 OH (28% раствор) до 100 мл сверхчистой воды.
  2. Установка прибора ВЭЖХ , как показано на рисунке 1.
    1. Установить бутылки с растворителем, которые содержат буфер А и буфер В на входы ВЭЖХ насоса с использованием полимерных труб. Прикрепите полимерную трубку к HPLC насос с цельным Подгонка. Убедитесь в том, что полимерные трубы изКаждый буфер установлен на правильный входной клапан прибора. Установить ВЭЖХ насоса с дегазатор.
    2. Пара ВЭЖХ насос с впускным отверстием 300 ангстрем мкм 25 препаративной колонке 300 мм 8 мм х (Фигура 1В, далеко левый столбец, см список материалов) с использованием полимерной трубки.
      1. Прикрепите полимерную трубку к препаративной колонке с цельным пальца плотно облегающей. Убедитесь, что колонна полимер ориентирован правильным образом.
        Примечание: Стационарная фаза препаративной колонке состоит из поли (стирол-дивинилбензола) частиц. Правильную ориентацию колонны полимера отмечено на внешнем корпусе с одной стрелкой.
    3. Подключите выход колонки к двойственной детектора длины волны с использованием полимерной трубки и установить детектор длины волны до 214 нм и 280 нм.
      1. Alter длину волны путем изменения параметров длины волны детектирования в методе настройки прибора выборувстроенное программное обеспечение высокоэффективной жидкостной хроматографии.
    4. Приложить полимерную трубку к впускному отверстию детектора длины волны с цельным пальца плотно облегающей. Приложить полимерной трубки к выходному клапану детектора длины волны. Прикрепите полимерную трубку к выходному отверстию клапана детектора ВЭЖХ с цельным пальца плотно облегающей. Это будет сбор образцов труб.
      Примечание: Отсутствие сильного хромофора на пептиде Ар диктует, что 214 нм можно использовать в качестве основного ультрафиолетовое (УФ) длины волны для пика сбора.

figure-protocol-2575
Рисунок 1: Экспериментальная установка прибора ВЭЖХ , используемого для очистки амилоидного бета пептидов. (A) четвертичной ВЭЖХ насос оснащен дегазатор и детектора с переменной длиной волны , установленной на 214 нм и 280 нм; (В) для ВЭЖХ колонки использовали для очистки амилоидного бета пептидов, изслева направо, 25 х 300 мм 2 колонка большого , 7,5 х 300 мм 2 полу колонка большого и 4,6 х 250 мм 2 аналитическую колонку; (C) Ручной инжектор с 20 мкл петли из нержавеющей стали , используемой для инжекционного аналитической ВЭЖХ; (D) Ручной инжектор с 10 мл из нержавеющей стали петли впрыска , используемого для препаративной и полуприцепа препаративной очистки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Программирование программного обеспечения ВЭЖХ для запуска способа очистки , как это показано в таблице 1. Ввод способа очистки путем изменения растворителя параметр расписание (в опции способ установки прибора , встроенного в программное обеспечение для ВЭЖХ). Включите HPLC насос, нажав на кнопку "ON" на программное обеспечение высокоэффективной жидкостной хроматографии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Насос начнет подачу исходного соотношения буфера А и буфер B через препarative колонки и ВЭЖХ инструмент.
    1. Оставьте систему в течение 30 мин до полного уравновешивания.
Время / мин % Буфера A A % Буфера B B Расход d / мл мин -1
0 80 20 6
45 75,5 24.5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 5 95 гр 6

<сильный> Таблица 1: График очистки пептидов и Aβ40 А 42 с использованием полимерной колонки мм в 25 × 300. буферным А - Н 2 O 20 мМ NH 4 OH; б 80% MeCN / 20% H 2 O 20 мМ NH 4 OH; с Ран в течение 15 мин , чтобы вымыть колонку до начала следующей инъекции образца; d Для запуска скорости потока 6 мл / мин на ВЭЖХ - измерительных приборов, предельное давление должно быть снижено до 200 бар.

  1. В результате очистки пептида образец Ар
    Примечание: Сырой пептид был получен с помощью автоматизированного синтеза пептидов в твердой фазе. 10
    1. Растворите 3 мг неочищенного пептида в Ар 4 мл буфера для образца растворения. Разрушать ультразвуком образца в течение 30-60 с при комнатной температуре и при частоте 40 кГц, чтобы способствовать растворению.
    2. Вводят весь образец на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью пластикового шприца 5 мл, снабженную 16 мм,стальная игла из нержавеющей стали. Выполнить метод очистки, как описано в подэтапа 1.3.
      Примечание: Система позволяет образец впрыска быть сделано с помощью ручного инжектора , установленного в камере из нержавеющей стали , впрыск топлива 10 мл (рис 1D). Нужный A & beta ; пептид будет элюции между 72 и 74 мин в виде острого пика разрешенного (фиг.2с).
    3. Собирают пробу в коническую центрифужную пробирку на 50 мл. Подтверждение идентичности пика Ар путем прямого впрыска масс-спектрометрии собранного элюента. 11 Магазин Очищенную на срок до 12 часов при -20 ° С.
      Примечание: Хранение раствора на срок более 12 ч не рекомендуется из-за возможного окисления пептида.
    4. Изолируйте очищенного пептида с помощью флэш-замораживание собранной аликвоты / аликвоты пептида Ар в жидком азоте и лиофилизуют. Выполните лиофилизации с помощью сушки вымораживанием образца при температуре от -60 ° С и вруверен в 20 мТорр в течение 24 часов.
    5. Выполните аналитический протокол ВЭЖХ, как указано ниже для определения чистоты пептида Ар. пептиды Хранить в их лиофилизированном виде при -20 ° С в течение периода до 6 месяцев.

2. Аналитический ВЭЖХ-анализ белка Очищенный Ар

  1. Подготовка ВЭЖХ буферов, как описано в подразделе 1.1. указанного выше протокола.
  2. Настройка аналитической ВЭЖХ в соответствии с шагом 1.2.1 и , как показано на рисунке 1 с аналитической колонке 4,6 × 250 мм (рис 1В, далеко правый столбец) и ручной инжектор с 20 мкл петли из нержавеющей стали впрыска (Рисунок 1C) , приспособленный к инструмент.
  3. Программирование программное обеспечение высокоэффективной жидкостной хроматографии , чтобы запустить аналитический метод , как показано в таблице 2 , в соответствии с инструкциями , аналогичные тем , на этапе 1.3.
Время /мин % Буфера A A % Буфера B B Расходная / мл мин -1
0 95 5 1
30 50 50 1

Таблица 2: График для анализа чистоты ВЭЖХ пептида Ар. буферным А - Н 2 O 20 мМ NH 4 OH; б 80% MeCN / 20% H 2 O 20 мМ NH 4 OH.

  1. Чистоту анализ пептида Ар
    1. Приготовьте 1 мг / мл раствора очищенного пептида путем растворения пептида в растворе образца буфера.
      Примечание: Рецепт буфер можно найти в подразделе 1.1. Концентрацию белка определяют путем измерения поглощения белка при 280 нм (А 280 нм). 12 м коэффициент Olar экстинкции (ε) используется для определения концентрации ε = 1490 дм 3 моль -1 см -1. 13
    2. Вводят 20 мкл раствора 1 мг / мл (222 мкМ) на колонку для ВЭЖХ и запустить аналитический метод, который был установки на шаге 2.3.
      Примечание: Оставшийся раствор не используется для анализа могут быть заморожены в жидком азоте и лиофилизуют для восстановления пептида А. Детали лиофилизации можно найти в подразделе 1.4.4. Пептида A & beta ; будет вымывается из аналитической колонки между 16 и 18 мин (рис 2D). С помощью встроенного программного обеспечения для анализа интеграции, сопровождающий прибор ВЭЖХ для определения чистоты пептида Ар. Чистота определяется путем интегрирования каждого из отдельных пиков на спектре и вычисление пептид-пик процентах площади. Как правило, очистка> 95% должно быть установлено.

figure-protocol-10212"Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
Рисунок 2: Представитель ВЭЖХ следы А 42. Очистка (А) Традиционный С 4 кремнезем, условия: буфер А: H 2 O с 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ), буфер Б: MeCN (ацетонитрил) , с 0,1% TFA, градиент: от 20 до 27% буфера В в течение 40 мин с последующим изократическим 27% буфера В; (Б) Препаративная очистка с использованием 25 х 300 мм 2 полимерную колонку с, условия: буфер А: H 2 O , 20 мМ NH 4 OH, буфер Б: 80% MeCN / 20% H 2 O 20 мМ NH 4 OH, градиент : от 20 до 27% буфера в в течение 70 мин с последующим изократическим 27% буфера в; (С) Оптимизированное препаративного очистки с использованием 2 мм полимерной колонки на 25 х 300, условия описаны в таблице 1 , расположенной в подразделе 1.3 протокола описания текста; (D) Аналитическая ВЭЖХ с использованием 4,6 х 250 мм 2 полимера колонки, кондitions: Буфер A: H 2 O с 20 мМ NH 4 OH, буфер Б: 80% MeCN / 20% H 2 O с 20 мМ NH 4 OH, градиент от 5 до 50% буфера В в течение 30 мин. Для частей А, В и С пик, соответствующий отмечен А 42 звездочкой. Сбор отмеченной пика частично А 42 С показывает чистоту> 95%, как показано в части D. Масс-спектрометрия была использована для определения идентичности пика А 42. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Очистку пептида А 42 с использованием комбинации стационарной фазы PLRP-S и высокое значение рН результаты мобильной фазы в формировании острого, разрешенного пика для пептида Ар при времени удерживания от 72 до 74 мин (фиг.2с). Подтверждение идентичности пика осущ...

Обсуждение

Очистку ЖХВД пептида Ар сильно зависит от выбора как стационарной фазы, используемой для очистки и подвижной фазы, выбранного для элюирования пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида и высокой склонностью к агрегации оказывают традиционные хроматографические условия для раз?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить за их компании Agilent технической помощи. Кейт Маркхэм и Рафаэль Паломино начисляются за их первоначальной помощи в области синтеза и очистки пептида Ар и д-р Hsiau-Вэй Ли выразил благодарность за помощь в подготовке Рисунок 1 рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pumpAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detectorAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loopAgilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loopAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting BracketAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptideSynthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution)Fisher ScientificA669-500
AcetonitrileFisher ScientificA998-4
HPLC grade waterFisher ScientificW5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tubeFisher Scientific14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 eaSigma-AldrichZ227250
Normject 5 cc sterile syringeFisher Scientific1481729
16 Gauge SS NeedleRheodyne3725-086

Ссылки

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

121PICUP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены