В методах Vitro для сравнения цели связывания и CDC Индукционные Между терапевтических антител применения в анализе Biosimilarity

Резюме

Этот протокол описывает in vitro сравнение двух ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: связывание с мишенью и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Методы были использованы для сравнения между эталонным ритуксимабом и биоподобным ритуксимабом. Эти анализы можно использовать во время биоподобного развития или в качестве контроля качества в их производстве.

Аннотация

Терапевтические моноклональные антитела (mAbs) имеют отношение к лечению различных патологий, включая раковые образования. Разработка биоподобных mAb фармацевтическими компаниями - это рыночная возможность, но это также стратегия увеличения доступности лекарств и снижения затрат, связанных с терапией. Протоколы, подробно описанные здесь, описывают оценку связывания мишеней и индукцию CDC ритуксимабом в клетках Daudi. Эти две функции требуют различных структурных областей антитела и имеют отношение к клиническому эффекту, индуцированному ритуксимабом. Протоколы позволяют проводить параллельное сравнение эталонного ритуксимаба и биодоступного ритуксимаба. Оцененные продукты демонстрировали различия как в связывании с мишенью, так и в индукции CDC, предполагая, что существуют фундаментальные физико-химические различия и подчеркивается необходимость анализа влияния этих различий в клинических условиях. Описанные здесь методы являются простыми и недорогими in vitro </ Em> для оценки активности биосимиляров ритуксимаба. Таким образом, они могут быть полезны при биоподобном развитии, а также для контроля качества в биоподобном производстве. Кроме того, представленные методы могут быть экстраполированы на другие терапевтические mAb.

Введение

Терапевтические антитела представляют собой рекомбинантные моноклональные антитела (mAb), разработанные для лечения различных патологий, включая рак, аутоиммунные и хронические заболевания, неврологические расстройства и другие. ¹ . В настоящее время FDA одобрило более 40 терапевтических моноклональных антител, и ожидается, что в последующие годы ожидается их появление на рынке.

Ритуксимаб - это высокоаффинное химерное моноклональное антитело IgG1, одобренное для лечения лимфомы CD20 ⁺ В-клеток неходжкинской лимфомы (NHL), CD20 ⁺ фолликулярной NHL, хронического лимфолейкоза и ревматоидного артрита ^{2 , 3} . Признание CD20, который сверхэкспрессируется в В-клетках ритуксимабом, индуцирует апоптоз; Активация комплемента; И антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) ³ . Патенты на этот препарат истекли в Европе и в США в 2013 и 2016 годахСоответственно. Таким образом, фармацевтические компании по всему миру разрабатывают ритуксимаб биоподобий. Как и в любом другом препарате для потребления человека, биоаналоги требуют одобрений регулирующих органов. Международные руководящие принципы показывают , что для МКИ, biosimilarity должна быть продемонстрированы путем сравнения физико - химические характеристики, фармакокинетика, эффективности и безопасности новых и эталонных продуктов ^4.

Соответственно, методики, используемые в таких сравнениях должны оценить структурные и функциональные характеристики мАта, особенно с клинической значимостью. С этой целью, анализы в пробирке показывают несколько преимуществ по сравнению с экспериментами в естественных условиях (обзор в Chapman и др.) ^5: I) в пробирке исследование более чувствительны к различиям между предлагаемым биоподобием и эталонным продуктом; б) в естественных условиях исследования должны быть выполнен в соответствующих видах, которые в течение многого мАта являютсянечеловеческие приматы; и III) , так как механизм действия, доклинической токсикологии, а также клинических эффектов эталонного продукта, хорошо известны, в естественных условиях исследования с биоподобий не могут обеспечить дополнительную полезную информацию. Соответственно, Руководство Европейского Союза по биоподобиям позволяет кандидатам ввести клинические испытания , основанные на надежном в одних только ⁶ лабораторных данных.

Здесь мы представляем два быстрых, экономические и простые анализы , которые оценивают биологическую активность ритуксимаба с использованием CD20 ⁺ культивируемых клеток. Эти анализы могут быть включены как часть сопоставимости упражнения для ритуксимаба биоподобных кандидатов.

протокол

1. Оценка связывания мишени с помощью проточной цитометрии

1. Получение биологических материалов и реагентов
   1. Сделать 500 мл культуральной среды RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (H-IFBS).
   2. Лимфома (Даудите) клетка культуры Дауди Беркитта и Даудите GFP ⁺ клетки с использованием RPMI и 75-см ² колбы с культурой. Поддерживать культуру при 37 ° С в 5% СО ₂ увлажненной атмосфере , пока они не достигают 6 - 9 × 10 ⁵ клеток / мл.
   3. Сделать 50 мл окрашивающего буфера путем разбавления 1/100 H-IFBS в PBS; этот буфер стабилен при 2 - 8 ° C в течение по крайней мере, одного месяца.
   4. Подготовка тестовых решений для справки и биоподобных моноклональных. Сделать десять 1: 2 серийных разведений (500 мкл каждого) в буфере окрашивания, начиная с 5 мкг / мл.
   5. С помощью окрашивания буфера для разбавления человеческого IgG (контроль изотипа) до 5 мкг / мл и РЕ-Су5 мыши против человеческого IgG (вторичного антитела) к концентровка предложенный производителем.
   6. Подготовьте 4% параформальдегида в PBS (фиксация буфера).
2. Целевое связывание
   1. Сбор Дауди и суспензий Дауди GFP ⁺ клеток из колбы с культурой 75 см ² и передавать их в центрифужную пробирку 15 мл. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
   2. Промывают клетки путем добавления 5 мл PBS и центрифугирование клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин.
   3. Ресуспендируют клеток в PBS и выполнять подсчет клеток и анализ жизнеспособности с трипановым синим. Использование культур с уровнями жизнеспособности клеток ≥ 95% для анализа.
   4. Развести клеточную суспензию до 4 × 10 ⁶ клеток / мл с холодным буфером окрашивания.
   5. В микропробирок 1,5 мл, добавляют 50 мкл клеточной суспензии в 100 мкл различных концентраций испытании эталонного или биоподобных мАт. Включите повторы для каждого экспериментального условия.
   6. Подготовьте дополнительные трубки дляконтроль изотипа (IgG1 человека вместо ритуксимаба) и отрицательный контроль (вторичное антитело без первичного антитела).
   7. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 - 30 мин.
   8. Промывают клетки путем добавления 1 мл PBS и центрифугирование клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин при 10 ° С. Жидкость над осадком сливают.
   9. Суспендирования клеток в 100 мкл вторичного антитела и инкубируют в течение 20 - 30 мин при 4 ° С, в защищенном от света месте.
   10. Вымойте клетки дважды с PBS и подвесить их в 200 мкл буфера фиксации.
   11. Анализ клеток на цитометр потока.
       Примечание: Сигнал остается стабильным в течение нескольких дней, если образцы хранили при 4 ° С в защищенном от света.
3. Получение данных
   1. Открыто два дот-участки на листе потока цитометрии операционного программного обеспечения. Установите FSC-A в сравнении с FSC-H в первой и FSC-A в сравнении с SSA-А во втором. Открыть гистограмму для канала PE-Cy5.
   2. На графике FSC-A и FSC-H сделайте выбор (R1) для выбора синглетных событий ( рисунок 1A ).
   3. Задайте населенность R1 в точках FSC-A и SSA-A, а затем создайте новый затвор (R2), выбрав целевые ячейки ( рисунок 1B ). Задайте населенность R2 в гистограмме интенсивности PE-Cy5 для просмотра частотного распределения ячеек.
   4. Отрегулируйте нижнюю интенсивность флуоресценции (FI) для канала PE-Cy5, используя отрицательный и изотипический контроль ( рисунок 1C ).
   5. Приобретите 10,000 событий в R2 из образца с более высокой концентрацией эталонного продукта. FI этого образца должен быть самым ожидаемым ( рис. 1С ).
   6. Приобрести остальные образцы.
   7. Для каждого образца получить среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в канале PE-Cy5.
   8. Для образцов с эталонным или биоподобным mAb рассчитывают разницу между образцом MFI и контрольным образцом изотипа (ΔMFI).

2. Оценка CDC

1. Получение биологических материалов и реагентов
   1. Приготовьте среду для культивирования клеток и культур Дауди и Даудите GFP ⁺ клетки , как описано выше (этапы 1.1.1 - 1.1.2).
      Примечание: Кроме того, анализ CDC требует бессывороточной RPMI.
   2. Развести нормальный человеческий сывороточный комплемент (NHSC) 1: 2 с бессывороточной RPMI. Подготовьте 2,5 мл.
   3. Подготовить 1 мл инактивированной нагреванием (30 мин / 56 ° C) NHSC разводили 1: 2 RPMI.
   4. Подготовка наборов тестов решений для справки и биоподобного мАт в бессывороточной среде RPMI. Сделать десять разведений (200 мкл каждого) от 1 до 0,025 мкг / мл.
2. CDC анализ
   1. Сбор клеток Дауди и Даудите GFP ⁺ из культур и количественное определение жизнеспособности клеток (см шагов 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Приготовьте суспензию клеток с 4 × 10 ⁵ клеток / мл в бессывороточной среде RPMI.
   3. Добавить50 мкл клеточной суспензии до 50 мкл каждой контрольной или биоподобной концентрации mAb-теста в 96-луночных конических (V) -базовых микропланшетах. Включите повторы для каждого экспериментального условия.
   4. Приготовьте дополнительные лунки для отрицательного контроля ( т.е. без mAb), контроля основной гибели ( т.е. инактивированного нагреванием NHSC в присутствии mAb) и окрашивания положительным контролем ( т.е. клеток , подвергнутых воздействию 50 мкл 70% EtOH).
   5. Инкубируйте клетки в течение 20-30 мин при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО ₂ .
   6. Добавить 50 мкл NHSC (разбавленный 1: 2) в каждую лунку и инкубировать опсонизированные клетки в течение 2,5 ч при 37 ° С в 5% CO ₂ -увлажненной атмосфере. Используйте Инактивированную теплом NHSC в базальных скважинах контроля смертности.
   7. Центрифуга при 400 xg в течение 5 мин при 10 ° C. Отбросьте супернатант.
   8. Промойте клетки, добавив 150 мкл PBS и центрифугируя клеточную суспензию в течение 5 мин при 400 xg и 10 ° C. диSCard супернатант.
   9. Пятно образцы с 7-aminoactinomycin (7-AAD), как описано ранее , ^{7, 8.}
   10. Анализ клеток на цитометр потока в тот же день.
3. Получение данных
   1. Открыто два дот-участки на листе потока цитометрии операционного программного обеспечения. Установите эти участки как на этапах 1.3.1 - 1.3.3 (рис 2A-B). Создайте третий сюжет, который является точка-участок для GFP в сравнении с 7-AAD на население R2.
   2. Определить адекватные пределы FI с использованием клеток Дауди, Дауди GFP ⁺ клеток, и смерть положительный контроль (фиг.2С).
   3. Для каждого образца, измеряют процент 7-AAD ⁺ клеток - мишеней. Приобретение по меньшей мере, 5000 событий из R2.
   4. Рассчитать удельную мАт-индуцированную цитотоксичность путем вычитания процентного содержания 7-АСР ⁺ в базальном контроле смертности от процентного найденных в образцах с отличаютсяКонцентрации ЛОР мАт (фигура 2D).

3. Анализ Biosimilarity

1. Введите значение концентрации и реагирования в графическом программное обеспечение.
2. Генерация графики и вычислить нелинейные регрессии с учетом следующих соображений: я) использовать лог-преобразование концентрации МКА как «X»; б) использовать переменную крутизну математическую модель (Y = минимальный ответ + (максимальный ответ - минимальный ответ) / 1 + 10 ^ ((LogEc ₅₀ -X) * Хилл склон)); и III) ограничивают нижние значения к нулю, так как базальной ответ был вычитали.
   Примечание: Кривые с симметричной сигмовидной формой, как ожидается.
3. Сравните оба нелинейных припадки с глобальной посадкой с использованием F-тест (компьютерные программ многих графических включить эту функцию).
   Примечание: Такие испытания устанавливают в качестве нулевой гипотезы о том , что максимальный ответ, LogEc _50, а наклон Хилла являются одинаковыми для двух наборов данных, который соответствуетБиологический вопрос, который предполагается решить.

Результаты

Используя протоколы, описанные выше, сравнение с мишенью и индукцию CDC эталонного ритуксимаба сравнивали с таковыми для биоподобного ритуксимаба, полученного и коммерчески доступного в Азии.

В клетках Daudi оба mAb связывали CD20 зависимым...

Обсуждение

Патентная истечение терапевтического МАБ способствует развитию биоподобий. Таким образом, существует потребность в простых методов, которые могут выявить различия в клинически значимых деятельности этих продуктов. CD20 ⁺ культивируемые клетки были использованы для оценки два кл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.