Способ получения рекомбинантного белка mCD1d в клетках насекомых.

Резюме

Метод подготовить клеток насекомых и заразить их бакуловирус для целей производства рекомбинантных proteinand mCD1d генерации mCD1d тетрамеров.

Аннотация

CD1 белки составляют третий класс антиген-представляющих молекул. Они поверхности клетки гликопротеинов, выраженное в примерно 50-кДа гликозилированного тяжелые цепи, которые нековалентно связанных с бета2-микроглобулина. Они связывают липиды, а не пептиды. Хотя их структура подтверждает сходство CD1 белков MHC класса I и класса II антиген представляющих молекул, mCD1d канавки относительно узких, глубоких, и высоко гидрофобными и имеет два обязательных карманы вместо нескольких мелких карманах описано для классической MHC- закодированный антиген-представляющих молекул. На основании их аминокислотных последовательностей, таких hydrobphobic канавка обеспечивает идеальную среду для связывания липидных антигенов.

Естественных киллеров Т (НКТ) клетки используют их TCR признать гликолипиды обязаны или представленных CD1d. Т-клетки реагируют на липиды представленных CD1 были вовлечены в защиту от аутоиммунных и инфекционных заболеваний и в опухолевой отказа. Таким образом, способность идентифицировать, очистить и отслеживать реакцию CD1-реактивного ячейки NKT имеет большое значение. Поколение тетрамеров альфа галактозил церамида (-Galcer) с CD1d имеет значительно углубить понимание биологии клетки NKT. Тетрамеров построены из других CD1 молекул также был сформирован, и эти новые реагенты значительно расширили знания о функции липидов реактивных Т-клеток, с потенциалом использования в целях мониторинга ответ на основе липидов вакцин и диагностики аутоиммунных заболеваний и других лечения.

протокол

И. Оттепель Клетки

Возьмите замороженный флакон Tn5 клеток, а оттепель его в 37 ° С водяной бане. Добавьте 5 мл среднего насекомого Express (Invitrogen, каталожный номер-10486) в 25 см ² TC колбу. Обратите внимание, что экспресс пять поставляется без глютамина, нужно добавить 10 мл 100X глютамин стрептококк ручки или глютамин только до 1 л средства массовой информации. Добавить Tn5 клетки в нее и инкубировать 30 минут в 27 ° C инкубатора. Затем, аспирация среде с ДМСО мягко, не нарушая клетки прикреплены к нижней части колбы. Добавьте 5 мл свежей среды.

II. Растет и расширяется Клетки

Монитор клетки с каждым днем. Когда колбы составляет почти 70% сливающийся, довести клеток в суспензии, ударяя колбу с обеих сторон и передача клетки 175см ² колбу, добавляя 21 мл насекомых среду выражать и 5 мл клеточной культуры. Каждый T175 колбе должна иметь около 25-30мл среды в конечном объеме. Сплит сливной колбы (около 1 млн / мл конц.) 1 / 4 или 1 / 5 по мере необходимости. Не позволяйте клетки разрастаются. Подсчитайте количество отрывков, которые вы разделили клетки. Не расти на протяжении прохождения номер 30, поскольку это может вызвать старение клеток в результате лизиса клеток. Когда вы достигнете желаемого объема при концентрации 1 млн / мл, инфицировать клетки.

Я обычно вырастают до 2 до 2,5 л, который обычно составляет до семидесяти 175см ² колбы и ок. От 25 до 30 мл / флакон, или пять 1 литр колб Эрленмейера и ок. 400 мл до 500 мл в каждой колбе

Примечание: Вы либо может вырасти клеток в Т-175 разъем колбу печать или Corning колбу Эрленмейера. Рост клеток в колб Эрленмейера быстрее и проще.

III. Titering вирусов к концу метода разведения точка

1. Пластина 3000-5000 клеток на лунку в плоское дно 96 ячейках в 200ul Экспресс пять УЛ среды. Пусть клетки оседают на 27 ° С в течение не менее 30 минут.
2. Сделать серийные разведения бакуловирус акций. Надо сделать 1 / 10 разбавления в одной строке 96 ячейках нижней U, используя 250ul на лунку. Разведения делаются в Экспресс Пять УЛ среды.
3. Использование многоканальной пипетки, передача фиксированную сумму (обычно 20 мкл) разных разведений к клеткам.
4. Культуры при 27 ° С в течение 7 дней. Чтобы избежать испарения с краю строки, заверните края пластины с парафильмом.
5. Через 7 дней, проверьте пластину и определить, какой титр вируса дает 50%-инфекции - половина скважин на этой концентрации вируса заражены). Затем с помощью формулы для расчета титра, который выражается в БОЕ / мл (БОЕ-бляшкообразующих единиц). Формула содержится в большинстве руководств бакуловирус.

IV. Заражение клетки

Это очень важно знать точные титр вируса. Добавить необходимое количество вируса. Для вирусных подготовки массы клетки должны быть инфицирован при множественности заражения (МВД) не более 1 (1pfu к 1High Пять ячейки) Высшее МВД приводит к производству вирусных мутаций. Для белка, обычная сумма MO1 5-10.

Пример:

Титр mCD1d бакуловирус = 1X108 БОЕ / мл

Добавить МВД = 1 (для усиления вирус) = 20x10 ^ 6 кл / колбу / 1x10 ^ 8 БОЕ / мл = 200 мкл / флакон

МВД = 5 до 10 (для белка) = 1 мл на 2 мл Для 20x10 ^ 6 кл / колбу

На 4-й день после заражения, посмотрите на инфицированные клетки. Они должны быть отделены, плавающие, опухание и формирования колбас.

В. Восстановление Супернатанты

Возьмите среду от инфицированных фляги, и трансфер в 250 мл синяя шапка Сокол прядильной бутылок. Они могут быть автоклавного и использовать повторно. Заполните бутылки равномерно и центрифуги клеток в Sorvall GSA ротора при 200rpm, 20 минут, 4 ° C. Сбор супернатант и приступить к дальнейшей очистки.

VI. Очистка рекомбинантного mCD1d

1. Диализ и концентрации в 150 мМ буфера фосфата натрия (рН 7,4)
2. По Ni-NTA агарозы хроматографии, элюции белка mCD1d + В2т с 150 мМ фосфат натрия +200 мм Immidazole
3. Выполнить Обессоливание колонки, используя 20 мМ Трис-HCl буфера PH8, чтобы избавиться от Immidazole
4. Выполнить хроматографии анионообменной использованием MonoQ колонки для устранения оставшихся загрязнений.
5. Концентрат для 1mg/ml использованием YM 30 концентратор (Millipore)
   
6. Бира ферментативных biotynlation из mCD1d согласно протоколу производителя (алчность)
   
7. Свободный биотин устраняется S200 колонке (Chromatograpy гель) с использованием фосфатным буферным раствором (PBS), pH7.4. Среднем от 2 до 3 мг в biotynlated белок может быть получен из 2 литра супернатант
8. Производство-Galcer CD1d тетрамер.

Для того, чтобы загрузить CD1d молекулы с-Galcer, растворимые biotynlated CD1d-b2м инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в три раза молярный избыток-Galcer, растворенного в 0,5% твина -20 в PBS, O.9% хлорида натрия. Тетрамеров образуются путем смешивания-Galcer загружены CD1d мономеров с 4-кратным молярным избытком PE - конъюгированная стрептавидином и инкубации в течение 4 часов при комнатной температуре. Хранить при температуре 48 ° C.

Обсуждение

В этой процедуре показано, как инициировать, растут, инфицировать клетки насекомых и как титр бакуловирус с помощью этих клеток. Наиболее важные аспекты этой процедуры не требуют технического обслуживания клеток и знать точное титр бакуловирус. После того как вы сформировали CD1 тетрамеров, они мо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Express Five SFM	Serum Free Medium	Invitrogen	10486025
High Five TM	Insect Cells	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	Antibiotics	Invitrogen	10378-016
25cm2 TC Flask	Plastic	Fisher Scientific	10-126-28
175 cm2 TC Flask	Plug seal flask	Fisher Scientific	10-126-8
Erlenmeyer Flask	Cell Culture Flask	Fisher Scientific	07 200 672
YM 30 Concenterator	30,000 MWCO	EMD Millipore	UFC 903096
FPLC equipment		GE Healthcare
BrA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Ni-NTA Agarose Column	His Tag Protein Purification Column	GE Healthcare
Desalting column	To get Rod of Salt from Protein	GE Healthcare
MonoQ Column	Anion Exchange Chromatgraphy	GE Healthcare
S200 Column	Size Exclusion Chromatography	GE Healthcare
alpha-Galcer	Glycolipid
PE- Streptavidin	For conjugating Protein	Molecular Probes, Life Technologies	S-866