JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем новый подход к травмированию черепно-мозговой травмы головного мозга у Drosophila melanogaster . Наш метод имеет то преимущество, что он обеспечивает непосредственную доставку повторяющихся ударов с регулируемой прочностью только на голову. Дальнейшее исследование беспозвоночной системы поможет осветить патогенез хронической травматической энцефалопатии.

Аннотация

Хроническая травматическая энцефалопатия (CTE) представляет собой установленное нейродегенеративное заболевание, которое тесно связано с воздействием повторяющейся легкой травматической травмы головного мозга (mTBI). Механизмы, ответственные за его сложные патологические изменения, остаются в значительной степени неуловимыми, несмотря на недавний консенсус по определению невропатологических критериев. Здесь мы описываем новый метод разработки модели CTE у Drosophila melanogaster ( Drosophila ) в попытке идентифицировать ключевые гены и пути, которые приводят к характерному гиперфосфорилированному накоплению тау и гибели нейронов в головном мозге. Удары с регулируемой силой для нанесения мягкой закрытой травмы доставляются непосредственно на головку мухи, подвергая головку быстрое ускорение и замедление. Наш метод устраняет потенциальные проблемы, присущие другим моделям TROBI Drosophila ( например, смерть животных может быть вызвана повреждениемДругие части тела или внутренние органы). Менее трудоемкий и дорогостоящий уход за животными, короткая продолжительность жизни и обширные генетические инструменты делают плод идеальной для изучения патогенеза СТЭ и позволяют проводить крупномасштабные генетические и фармакологические экраны с геномом. Мы ожидаем, что текущая характеристика модели будет иметь важное механическое представление о профилактике заболеваний и терапевтических подходах.

Введение

Хроническая травматическая энцефалопатия (КТР) недавно была признана явным нейродегенеративным расстройством, отделенным от других тауопатий, таких как болезнь Альцгеймера 1 . В отличие от болезни Альцгеймера и других распространенных тауопатий, наиболее важными факторами риска которых являются возраст возраста и семейная история деменции, CTE, как указано по его названию, подразумевает тесную связь с историей травм мозга, скорее всего, у спортсменов-контактных спортсменов, Таких как боксеры и футболисты, а также военные ветераны 2 , 3 , 4 , 5 . Считается, что он инициируется повторными ударными и сухожильными ударами по голове. Пациенты могут проявлять симптомы и признаки, такие как когнитивный дефицит, изменения настроения и поведения и дисфункция движения, которые значительно перекрываются с болезнью Альцгеймера,Деменция, деменция тела Льюи и болезнь Паркинсона 6 . Напротив, посмертные исследования ткани головного мозга выявляют четкую картину гиперфосфорилированного накопления тау, окружающего небольшие кровеносные сосуды на глубинах корковых сосудов, патогномоническую особенность, не наблюдаемую в других дегенеративных условиях 7 . Однако до сих пор очень мало известно о патогенезе, ведущем к проявлению болезни. Это во многом связано с отсутствием верной модели на животных - только недавно были созданы модели грызунов 5 , 8 . У этих модельных организмов есть недостатки дорогостоящего ухода и относительно длительный срок службы, которые не подходят для исследований нейродегенеративных заболеваний.

По сравнению с аналогами млекопитающих беспозвоночные животные, такие как Drosophila, являются отличной альтернативой, с их экономически эффективным обслуживанием,Обширные инструменты для рассечения генетических детерминант и относительно короткий срок службы 9 . Примечательно, что муха и человеческий мозг разделяют эволюционно сохраняющиеся молекулярные и клеточные пути, а также анатомические сходства 10 , 11 , 12 . Ранее сообщалось о двух гениальных моделях Drosophila для изучения травматической черепно-мозговой травмы 13 , 14 . Первое устройство «High Impact Trauma» (HIT), разработанное Катценбергером и коллегами, содержало свободно движущиеся мухи в пластиковом флаконе, который был привязан к свободному концу металлической пружины 13 , 15 . Когда пластиковый флакон был повернут вертикально и выпущен, он попал на полиуретановую подушечку и передал муравьям, когда они отскочили к стене флакона и отскочили. Напротив, Барекат и его коллеги разработали другой способ доставки насНа платформе гомогенизатора Omni Bead Ruptor-24 14 . Мухи были выведены из строя с CO 2 и помещены в 2-миллилитровую отвертку, которая была прикреплена к гомогенизатору и подвергнута предварительно запрограммированным условиям встряхивания. Одним из преимуществ использования системы тканевого гомогенизатора является то, что экспериментатор может модулировать интенсивность травм, продолжительность травмы и количество травм. Тем не менее, оба режима имеют такой же недостаток: первичные травмы головы случайным образом определяются с точки зрения местоположения и силы удара. Кроме того, оба метода привели к значительной смертности, вызванной неизбежным побочным повреждением других частей тела и внутренних органов. Здесь мы описываем новый метод индуцирования mTBI у плодовых мух. Наш аппарат состоит из газового баллистического ударника. По сравнению с существующими моделями 14 , 15 Drosophila , наш метод имеет уникальное преимущество -С уловимым воздействием, направленным только на свободно движущуюся головку летательного аппарата, что позволяет точно контролировать различные факторы, такие как тяжесть удара, временной интервал между воздействиями и общее количество ударов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Сборка ударного устройства ( рисунок 1 )

  1. Удалите плунжер из 1 мл туберкулинового шприца. Отрежьте ствол с отметкой 1 мл.
  2. Удалите аэрозольный барьер (диаметр 3 мм х 4 мм) из наконечника пипетки 200 мкл и используйте его в качестве импактора. Поместите импактор внутрь ствола шприца. Аккуратно надавите на ствол, чтобы переместить ударный элемент на наконечник, при этом плоская сторона закрывает отверстие сопла.
  3. Прикрепите конец наконечника бочки к пластиковой трубке, которая подключена к регулятору потока двуокиси углерода (CO 2 ) станции анестезии Drosophila .
  4. Держите ствол вертикально и закрепите его до стандартной стойки держателя для фиксации, чтобы ударник находился на дне ствола.
  5. Измените наконечник пипетки 200 мкл, чтобы сделать держатель мух.
    1. Отрежьте 4 мм от наконечника, чтобы открыть отверстие диаметром 0,8 мм, позволяя открывать только головку мухи.
      ПРИМЕЧАНИЕ.Rax и все остальные части тела мухи останутся внутри наконечника пипетки.
  6. Измените наконечник пипетки объемом 1000 мкл и 1 мл колпачка иглы для шприца, чтобы сделать разъем.
    1. Отрежьте 44 мм от отверстия наконечника. Возьмите 6-миллиметровую длину 1 мл колпачка иглы шприца и плотно вставьте его в оставшийся участок наконечника пипетки 1000 мкл.

2. Эксплуатация ударного устройства

  1. Анестезируйте одну 2-дневную взрослую взрослую женщину, используя CO 2 на подушке.
  2. Аккуратно передайте его держателю мух тонкой кистью. Аккуратно коснитесь держателя так, чтобы головка мух была видна вне кончика. Если хобот мухи обнажен снаружи наконечника, аккуратно засуньте его обратно внутрь наконечника с затупленной иглой шприца 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Обязательно держите хоботок мухи внутри держателя. В противном случае, муха может умереть от сосания хобота.
  3. Затяните муху hoК шприцу с соединителем, чтобы головка мухи обращена вниз.
  4. Установите давление газа при 100 кПа. Отрегулируйте расход в соответствии с проектом эксперимента.
  5. Быстро включите и выключите переключатель тумблера регулятора расхода, чтобы ударный элемент ударил голову мухи один раз.
  6. Поднимите держатель мухи и переместите его над подушкой. Отрежьте держатель мух и аккуратно коснитесь стороны, чтобы вылететь. Оставьте муху в пустой флакон, чтобы восстановиться.

3. Отслеживание движения с помощью видео

  1. Заполните чашку Петри диаметром 6 см прозрачным силиконовым эластомером, чтобы сделать площадку для отслеживания. Оставьте 3-миллиметровое пространство между кремнием и крышкой чашки, чтобы позволить мухам свободно ходить, но не летать.
  2. Анестезируйте четырех мух из любой обманутой или обработанной группы каждый раз и поместите их на арену. Оставьте мухи при 22 ° C в течение 1 часа.
  3. Поместите камеру с зарядовой связью (CCD) над аренами и запишите в течение 5 минут.
  4. Проанализируйте записанные траектории движения с использованием программного обеспечения Ctrax (свободно доступно от Caltech) 16 . Экспортировать отслеживаемые данные на языке программирования (например, Matlab) и сопоставлять данные на основе пройденного расстояния на кадр 17 . Вычислите среднее расстояние ходьбы для каждой мухи и объедините его со всеми другими зарегистрированными мухами / группой, чтобы получить среднее кумулятивное расстояние, пройденное популяцией файлов в той же группе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Чтобы установить модель CTE с использованием взрослого дрозофилы , мы определили эффективность нашего устройства при нанесении одной травмы с закрытой головкой. Чтобы устранить вариации, связанные с генотипом, полом или возрастом, в эксперименте мы использовали 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Модели животных, которые добросовестно моделируют функции CTE, включая нейрофизиологические изменения, невропатологические признаки и нейробиологические дефициты, необходимы для выявления механизмов заболевания и для разработки диагностических и терапевтических целей. Понятно, что...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана фондом запуска факультета медицины Университета Джона Хопкинса в LC

Благодарности

Авторам нечего раскрывать.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aerosol BarrierUSA Scientific1120-8810Used as an impactor
200 μL Pipette TipUSA Scientific1111-0706Used as a fly head holder
1000 μL Pipette TipUSA Scientific1122-1830Used as a connector
1 mL Tuberculin SyringeBecton Dickinson309625
60 mm Petri DishesFisher ScientificFB0875713AUsed as a tracking arenas
Flow RegulatorGenesee Scientific59-122WC
Standard Clamp Holder/standEISCO ScientificCH0688
Fine BrushGenesee Scientific59-204
FlypadGenesee Scientific59-114
Sylgard Silicone ElastomerDow Corning4019862
CCD CameraMicrosoft HD-5000
Ctrax Walking Fly TrackerCaltechCtrax 0.2.11
MATLAB Image Processing ToolboxMATLABR2015b

Ссылки

  1. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
  2. Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
  3. Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
  4. Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
  5. Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
  6. Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).
  7. McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
  8. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
  9. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  10. Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
  11. Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
  12. Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
  13. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  14. Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252(2016).
  15. Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
  16. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  17. Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
  18. Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
  19. Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
  20. Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

NeuroscienceDrosophila

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены