JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол фракционирования мозговых мембран, который представляет собой надежную процедуру для выделения белков, принадлежащих к различным синаптическим компартментам.

Аннотация

Оценка состава и функции синаптического белка представляет собой важную проблему в неврологии. Однако оценить нейропередачу, которая происходит в синапсах, непросто, поскольку она сильно регулируется динамическими белок-белковыми взаимодействиями и событиями фосфорилирования. Соответственно, когда какой-либо метод используется для исследования синаптической передачи, основная цель заключается в сохранении этих переходных физиологических изменений. Здесь мы представляем протокол фракционирования мозговых мембран, который представляет собой надежную процедуру для выделения белков, принадлежащих к различным синаптическим компартментам. Другими словами, протокол описывает биохимическую методологию для осуществления обогащения белков из пресинаптических, постсинаптических и экстрасинаптических компартментов. Во-первых, синаптосомы или синаптические терминалы получают из нейронов, которые содержат все синаптические компартменты с помощью прерывистого градиента сахарозы. Следует отметить, что качество этого исходного препарата синаптической мембраны critical. Впоследствии выделение различных субсинаптических компартментов достигается при легкой солюбилизации с использованием слабых детергентов при дифференциальных условиях рН. Это позволяет разделять градиент и изопикнические центрифуги. Наконец, обогащение белка в различных субсинаптических компартментах ( т. Е. До-, пост- и экстрасинаптические фракции мембран) проверяется с помощью иммуноблот-анализа с использованием хорошо охарактеризованных синаптических маркеров белка ( т.е. SNAP-25, PSD-95 и синаптофизина, Соответственно), что дает возможность прямой оценки синаптического распределения любого конкретного нейронального белка.

Введение

Синаптическая передача основывается на физической целостности синапса, концепции, которая была предусмотрена еще в 1897 году Фостером и Шеррингтоном 1 . Таким образом, понимание распределения ключевых компонентов нейротрансмиссии ( например, ионных каналов, рецепторов и т . Д.) Необходимо для выяснения синаптической функции как в нормальных, так и в патологических состояниях. Электронная микроскопия (ЭМ) внесла огромный вклад в современное ультраструктурное представление синапсов прототипической центральной нервной системы (ЦНС). Таким образом, ЭМ точно установила разницу между до- и постсинаптической плотностью, разделенными расщелиной на довольно равномерном расстоянии (~ 25 нм) 2 . Интересно, что постсинаптический аппарат имеет относительно непрерывное, электронно-плотное утолщение под его плазматической мембраной, так называемую постсинаптическую плотность, или PSD 2 . Напротив, в пресинаптическом аппарате заметнаE разрывная цитоматричная сеть расположена непосредственно под плазматической мембраной, которая необходима для выравнивания и стыковки синаптических везикул с активной зоной плазматической мембраны 3 . Следовательно, ЭМ представляет собой золотой экспериментальный подход к исследованию распределения белков в структурно сохраненных синапсах CNS. Однако информация, предоставленная электронными микрофотографиями, является статичной. Действительно, накапливающиеся свидетельства показывают, что синапсы in vivo чрезвычайно динамичны, и поэтому испытывают серьезные структурные изменения при длительной синаптической передаче. Кроме того, морфология и состав синапсов могут изменяться в разных областях ЦНС, а также при развитии, созревании, старении и развитии невропатологических состояний. В целом протокол, посвященный изоляции белков, принадлежащих к разным синаптическим компартментам в физиологических условиях, представляет собой ценный инструмент для более полного исследования синаптического функционирования.

Здесь мы описываем этот тип дополнительного экспериментального подхода, который позволяет получить препаративное биохимическое обогащение различных отделений синаптических мембран, а именно, экстра-, пре- и постсинаптические мембранные домены. Этот способ мембранного фракционирования, впервые описанный Philips и др . (2001) 4 , основан на сдвиге рН, который ослабляет адгезивные взаимодействия, происходящие в пред- и постсинаптической аппаратуре. Во-первых, используя мягкие моющие средства при рН 6,0, можно обнаружить адгезионный переход, который удерживает пред- и постсинаптический аппарат, и который поддерживается из области экстрасинаптической мембраны, которая солюбилизирована и, таким образом, может быть извлечена из синаптических контактов. Впоследствии повышение рН от 6,0 до 8,0 в присутствии слабых детергентов ослабляет прочность адгезивного соединения, которое удерживает пресинаптически активную зону плотно связанной с постсинаптической плотностью. Следовательно, пресинаптическое отделение настолькоЛибилизируется и может быть отделена от постсинаптической плотности, которая в основном сохраняется, поскольку концентрация используемого детергента не способствует его солюбилизации 4 . Интересно, что эффективность фракционирования, в конечном итоге выше 90%, может быть подтверждена различными субсинаптическими маркерами: i ) синаптосомальный белок 25 (SNAP-25) из пресинаптической активной зоны; Ii) синаптофизин из экстрасинаптической фракции ( т.е. вне активной зоны и включая микросомы); И iii ) постсинаптический белок плотности 95 (PSD-95), из постсинаптической плотности. Примечательно, что этот метод фракционирования головного мозга успешно использовался. Соответственно, было возможно точно определить субсинаптическую локализацию различных рецепторов, таких как рецепторы альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) 5 , рецептор аденозина A 1 (A 1 R) 6 ,Аденозиновый рецептор А 2А (A 2 A R) 7 , рецепторы Р2 аденозинтрифосфата (АТФ) 8 , субъединицы 9 никотинового ацетилхолина и рецептор, ассоциированный с болезнью Паркинсона GPR37 10 . Однако ряд ограничений может помешать правильной оценке синаптического распределения конкретного нейронального белка. Таким образом, в этой процедуре мы не только полностью описываем весь протокол, но также выделяем некоторые критические моменты, которые необходимо учитывать, например, достаточно большое количество ткани, низкий выход белка и обязательное требование проверки эффективности Каждое разделение перед выполнением определенного эксперимента.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по использованию и уходу за животными в Барселоне (CEEA) Университета Барселоны в соответствии с руководящими принципами, описанными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных 11 и в соответствии с Европейским сообществом, законом 86/609 / CCE, FELASA и ARRIVE. Таким образом, мышей размещают в стандартных клетках с неограниченным доступом к пище и воде и выдерживают в контролируемых стандартных условиях (12 ч темный / светлый цикл, начинающийся в 7:30, температура 22 ° C и влажность 66%).

1. Получение синаптосом мышиного мозга с использованием прерывистого градиента сахарозы.

Примечание: ранее этот метод был описан 10 .

  1. Подготовьте свежий изолирующий буфер (IB), pH 7,4; 2 М сахарозы; 1 М сахароза / 0,1 мМ CaCl 2 ; И 0,1 мМ CaCl 2 (см. Таблицу 1 ). Охладите растворы на льду.
  2. SaВырезать пять мышей с помощью шейного вывиха. Обезглавить и быстро удалить мозг каждого животного. Рассеките интересующую область мозга (то есть гиппокамп, 0,25-0,35 г свежей ткани) и поместите его в стеклянную пробирку Potter-Elvehjem объемом 5 мл на льду с 1 мл IB.
  3. Гомогенизируют ткань, используя гомогенизационную мешалку (10 ходов при 700-900 оборотов в минуту), предпочтительно на ледяной бане, чтобы исключить нагревание образца.
  4. Поместите гомогенизированную ткань (1 мл) в 15 мл пробирку, содержащую 6 мл 2 М сахарозы и 2,5 мл 0,1 мМ CaCl 2 при 4 ° С. Медленно перемешайте, переворачивая пробирку.
    Примечание: добавление кальция необходимо для поддержания адгезивных взаимодействий между органеллами и, таким образом, для сохранения структуры различных «плотностей».
  5. Поместите раствор в 12 мл центрифужную пробирку и медленно добавьте 2,5 мл 1 М сахарозы / 0,1 мМ CaCl 2 на вершину каждой пробирки, чтобы получить градиент сахарозы.
    Примечание: отметьте позицию oF - интерфейс градиента на трубке центрифуги с использованием постоянного маркера.
  6. Взвешивают и уравновешивают пробирки для центрифуги с раствором IB в их соответствующих стальных опорах и с их закрывающими крышками.
  7. Центрифуга пробирки в течение 3 часов при 100000 х г и 4 ° С с помощью вращающейся центробежной роторной центрифуги. Полностью заполните ротор всеми стальными опорами (даже пустыми, если это необходимо).
  8. Удалите верхний слой, содержащий миелин. С помощью пипетки Пастера соберите белое кольцо между межфазной средой сахарозы 1,25-М и 1-М, соответствующей фракции синаптосом.
  9. Разбавьте синаптосомы с их объемом 9Х, используя IB в пробирке для центрифугирования.
  10. Взвешивают и уравновешивают пробирки для центрифуги с раствором IB в их соответствующих стальных опорах и с их закрывающими крышками.
  11. Центрифугируют пробирки в течение 30 мин при 15000 х g и 4 ° С с помощью вращающейся центробежной роторной роторной роторной центрифуги.
  12. Отбрасывают супернатант и ресуспендируютE осадок с 1,1 мл раствора IB. Соберите 100 мкл этого синаптосомального раствора и центрифугируйте в течение 5 мин при 11000 х g и 4 ºC.
  13. Ресуспендируют синаптосомальный осадок в 5% додецилсульфате натрия (SDS) и хранят этот образец при -20 ºC.
    Примечание. Этот образец будет соответствовать общей фракции синаптосом для дальнейшего анализа вестерн-блоттинга. Оставшуюся синаптосомную фракцию (~ 1 мл) можно либо замораживать при -20 ºC до использования, либо обрабатывать для последующего досинаптического фракционирования. Синаптосомы или очищенные синапсы составляют от 1 до 2% от общего объема 12 гиппокампа.

2. Пре-, пост- и экстрасинаптическая изоляция

  1. Приготовьте 2 × свежий буфер солюбилизации, pH 6,0; 1x солюбилизирующий буфер, pH 6,0; Буфер солюбилизации, pH 8,0; И 0,1 мМ CaCl 2 (см. Таблицу 1 ). Охладите растворы на льду.
    Примечание: pH этих растворов должен быть точнымY, чтобы достичь хорошего субсинаптического фракционирования.
  2. Медленно разбавляют ресуспендированную синаптосомную фракцию в 1 мл (см. Этап 1.12) с 5 мл 0,1 мМ CaCl 2 .
  3. Добавляют тот же объем (5 мл) охлажденного льдом 2х буфера солюбилизации, рН 6,0, и инкубируют в течение 50 мин на льду при высоком перемешивании в стакане на льду.
    Примечание: в то время как 1% Triton X-100 при рН 6.0 солюбилизирует все белки плазматической мембраны, он сохраняет белки внутри синаптических контактов или соединений ( то есть пред- и постсинаптические структуры) 4 .
  4. Поместите раствор в центрифужную пробирку. Взвешивают и уравновешивают пробирки эквивалентными объемами 0,1 мМ раствора CaCl 2 и 2 × солюбилизирующего буферного раствора, pH 6,0, в пределах их соответствующих стальных опор и с их закрывающими крышками.
  5. Центрифуга пробирки в течение 30 мин при 40000 х g и 4 ° С с помощью вращающейся центробежной роторной роторной центрифуги. Полученный супернатант представляет собой экстрасинаптическую фракцию,И гранулы соответствуют синаптическим соединениям ( то есть пред- и постсинаптические фракции).
  6. Сконцентрируйте надосадочную жидкость, содержащую экстрасинаптическую фракцию, до конечного объема 200 мкл, используя 15-миллилитровую фильтровальную трубку 10 К, центрифугированную при 4000 xg и 4ºC.
  7. Осадок образовавшейся концентрированной экстрасинаптической фракции (200 мкл) с 5 объемами (1 мл) предварительно охлажденного (-20 ° С) ацетона в течение ночи при -20 ° С.
  8. На следующий день центрифугируют экстрасинаптическую фракцию в течение 30 мин при 18000 х g и -15 ° С. После центрифугирования отбросьте супернатант ацетона и высушите осадок, чтобы удалить следы ацетона.
  9. Наконец, ресуспендируют осадок, содержащий экстрасинаптические белки, с 200 мкл 5% SDS. Озоните гранулу, если это необходимо.
  10. Не нарушая его, тщательно вымойте гранулы, содержащие пред- и постсинаптические фракции, с 2 мл 1х солюбилизирующего буфера, рН 6,0. Отбросить буфер.
  11. РесуспендируютОсадок с 10 мл 1х солюбилизирующего буфера, рН 8,0, с использованием стеклянной пипетки Пастера.
    Примечание: в то время как 1% Triton X-100 при рН 8,0 солюбилизирует пресинаптическую специализацию, он сохраняет нерастворимую постсинаптическую плотность 4 .
  12. Инкубируйте суспензию в течение 50 мин на льду при интенсивном перемешивании в стакане на льду.
  13. Поместите раствор в центрифужную пробирку. Взвешивают и уравновешивают пробирки буфером солюбилизации 1х, pH 8,0, в пределах их соответствующих стальных опор и с их закрывающими крышками.
  14. Центрифугируют пробирки в течение 30 мин при 40000 х g и 4 ° С с использованием центробежной роторной центрифуги с вращающимся ковшом; Полученному супернатанту соответствует пресинаптическая фракция и осадок на постсинаптическую фракцию.
  15. Обработайте супернатант, содержащий пресинаптическую фракцию, как описано в шагах 2.6-2.9.
  16. Ресуспендируют осадок, содержащий постсинаптическую фракцию, с 200 мкл 5% SDS. Озоните гранулу, яF.

3. Проанализируйте образцы с помощью иммуноблота, чтобы проверить мембранное фракционирование

  1. Определите количество белка в каждой фракции ( то есть общую, экстра-, пре- и постсинаптическую фракции), используя анализ белка бицинхониновой кислоты.
  2. С каждой фракции берут 20 мкг белка и разбавляют его до конечного объема 50 мкл в SDS-полиакриламидном геле для электрофореза в геле (SDS-PAGE). Кипятите в течение 5 мин при 100 ° С.
  3. Отделяют белки электрофорезом в SDS-PAGE 10%, с 4% концентрирующим гелем в условиях восстановления. Электрофорез при постоянном напряжении 80 В до тех пор, пока краситель не войдет в нижний гель, а затем увеличит напряжение до 120 В.
  4. Перенесите белки на мембрану PVDF и блокируйте раствором IB-блокатора в течение 45 мин при комнатной температуре при непрерывном встряхивании.
  5. Инкубируйте мембрану в течение ночи при 4 ° С с указанным первичным антителом ( то есть анти-SNAP-25,Анти-PSD-95, антисинаптофизин или анти-GPR37), разведенные в IB-блокирующем растворе при непрерывном встряхивании.
  6. Промойте мембрану три раза (по 10 минут каждый) раствором для промывания IB, чтобы устранить несвязанные первичные антитела.
  7. Инкубируйте с указанным вторичным антителом в течение 90 мин в темных условиях при комнатной температуре при непрерывном встряхивании.
  8. Промойте мембрану три раза (по 10 минут каждый) раствором для промывания IB, чтобы устранить несвязанные вторичные антитела.
  9. Инкубируйте мембрану с хемилюминесцентным субстратом (подготовьте смесь в темных условиях и следуя пропорции 1: 1 раствора А и В, предоставленного изготовителем).
  10. Проанализируйте мембрану в хемилюминесцентном детекторе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Описанная методика в основном использовалась для субсинаптического анализа нейрональных белков в целом и для выделения и биохимической характеристики синаптических рецепторов 5 , 6 , 7 , 8 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e.,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Министерством экономики и конкурентоспособности / Институтом Салуда Карлоса III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 и PIE14 / 00034), Институтом Каталонии Рекурсии и Эстудис Avançats (ICREA Academia-2010 ), И Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie (SBO-140028) для FC. Кроме того, X. M, VF-D. И FC принадлежат к аккредитованной исследовательской группе «Нейрофармакология и боль» (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) , Работа была также поддержана «Программой Pesquisador Visitante Especial-Ciência sem Fronteiras» от CAPES (Бразилия) до ФК

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
SucrosePancreac Química SL, Barcelona, Spain1,316,211,211
CaCl2Pancreac Química SL, Barcelona, Spain2,112,211,210
MgCl2·6H2OPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,313,961,210
Protease inhibitor cocktail Set IIIMillipore, Darmstadt, Germany535140
Trizma BaseSigma, St. Louis, MO, USAT1503
Tris-HClPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,236,541,209
Triton X-100Sigma, St. Louis, MO, USAX100
SDSSigma, St. Louis, MO, USAL3771
GlycerolSigma, St. Louis, MO, USAG5516
Bromophenol BluePancreac Química SL, Barcelona, Spain1,311,651,604
DithiothreitolSigma, St. Louis, MO, USAD0632
Tween 20Sigma, St. Louis, MO, USAP2287
Non fat dry milk
NaClPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,216,591,211
KClPancreac Química SL, Barcelona, Spain1,314,941,210
KH2PO4Merck4873
Na2HPO4Pancreac Química SL, Barcelona, Spain1,316,781,211
Basic 20 pHCrison, Alella, Spain
Polytron VDI 12 Adaptable HomogenizerVWR, Radnor, PA, USA.
Ultra-Clear Tubes (14x89mm)Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona344059Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.
Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10KMerck Millipore, Darmstadt, GermanyUFC901008
Centrifuge 5430REppendorf, Hamburgo, Germany
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona
Sonifier 250Branson, Danbury, Connecticut
Amersham Imager 600GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain
Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mmVWR, Radnor, PA, USA612-1702
Compact Balance EK-610A&D, Tokyo, Japan
Pierce™ BCA Protein Assay KitPierce Biotechnology, Rockford, IL, USA
SuperSignal west pico chemiluminescent substrateThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA
GR 200 Precision BalanceA&D, Tokyo, Japan
Anti-GPR37Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 μg/mL
Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysinAbcam, Cambridge, United KingdomPrimary antibodies diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-mouse IgGThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.Secondary antibody diluted 1:10,000
HRP-conjugated goat anti-rabbit IgGThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.Secondary antibody diluted 1:30,000

Ссылки

  1. Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
  2. Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
  3. Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
  4. Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
  5. Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
  6. Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
  7. Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
  8. Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
  9. Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
  10. Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
  11. Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
  12. Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
  13. Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
  14. Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
  15. Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
  16. Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
  17. Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
  18. Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9(2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены