JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод чувствительного измерения скорости передачи нуклеоцитоплазмы в моторных нейроподобных клетках NSC-34 путем количественного определения изменений в реальном времени в импорте белка NLS-NES-GFP в ядерной области.

Аннотация

Нуклеоцитоплазматический транспорт относится к импорту и экспорту крупных молекул из клеточного ядра. Недавно в ряде исследований была показана связь между амиотрофическим латеральным склерозом (ALS) и нарушениями в нуклеоцитоплазматическом пути. ALS - нейродегенеративное заболевание, поражающее двигательные нейроны и приводящее к параличу и, в конечном счете, смерти, в среднем в течение 2-5 лет. Большинство случаев БАС являются спорадическими, отсутствие каких-либо видимых генетических связей, но 10% наследуются доминирующим образом. Недавно были изучены экспансии гексануклеотида (HREs) в открытом раме считывающей рамки 72 (C9orf72) хромосомы 9 как генетическая причина БАС и лобно-височной деменции (FTD). Важно отметить, что различные группы недавно предположили, что эти мутанты влияют на нуклеоцитоплазматический транспорт. Эти исследования в основном показали конечный результат и проявления, вызванные HREs на нуклеоцитоплазматический транспорт, но они не демонстрируют дисфункцию ядерного транспорта вВ реальном времени. В результате может быть определен только тяжелый нуклеоцитоплазматический транспортный дефицит, главным образом из-за высокой избыточной экспрессии или экзогенного введения белка.

Этот протокол описывает новый и очень чувствительный анализ для оценки и количественной оценки дисфункции нуклеоцитоплазматического транспорта в реальном времени. Скорость импорта белка NLS-NES-GFP (челночного GFP) может быть определена количественно в реальном времени с использованием флуоресцентной микроскопии. Это осуществляется с помощью ингибитора exportin, что позволяет челночному GFP только проникать в ядро. Для подтверждения анализа использовали C9orf72 HRE переведённые дипептидные повторы, поли (GR) и поли (PR), которые, как было показано ранее, нарушают нуклеоцитоплазматический перенос. Используя описанный анализ, наблюдалось 50% -ное снижение скорости импорта ядер по сравнению с контролем. Используя эту систему, можно рассмотреть незначительные изменения в нуклеоцитоплазматическом транспорте и способность различных факторов спасти (даже частично) нуклеоцитоплазматическую trAnsport дефект может быть определен.

Введение

Комплекс ядерных пор (NPC) контролирует импорт и экспорт крупных молекул в и из клеточного ядра. В отличие от малых молекул, которые могут войти в ядро ​​без регуляции 1 , перенос больших молекул строго контролируется NPC. Эти крупные молекулы, такие как белки и РНК, ассоциируются с транспортными факторами, включая импортные и экспортные, которые должны быть импортированы и экспортированы из ядра 2 . Чтобы быть импортированным, белки должны содержать небольшой пептидный мотив, обычно называемый сигналом ядерной локализации (NLS), который связан с importins 2 . Эти последовательности аминокислот действуют как метка и разнообразны по составу 3 , 4 . Белки могут быть экспортированы из ядра в цитоплазму из-за их ассоциации с exportinS, которые связывают сигнальную последовательность, обычно называемую сигналом ядерного экспорта (NES) 2 . Оба importins и exportins способны перевозить их груз из-за регулирования маленького Ras родственного ядерного белка GTPase (Ran) 2 . Было показано, что Ran существует в разных конформационных состояниях в зависимости от того, связан ли он с GTP или ВВП. Когда привязан к GTP, Ran может связываться с importins или exportins. После привязки к RanGTP, importins освобождает свой груз, а exportins должны связывать RanGTP для формирования комплекса с их экспортным грузом. Доминирующее нуклеотидное связывающее состояние Ran зависит от его расположения в ядре (RanGTP) или цитоплазме (RanGDP).

Недавно в ряде исследований была показана связь между нарушениями в нуклеоцитоплазматическом пути и как боковой амиотрофический склероз (ALS), так и лобно-височная деменция (FTD) 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS - это прогрессирующая и фатальная нейродегенеративная болезнь, поражающая как верхние, так и нижние мотонейроны (MN) 13 и приводящая к параличу и, в конечном счете, смерти, в среднем в течение 2-5 лет. Большинство случаев БАС классифицируются как спорадические (SALS), у которых отсутствуют какие-либо видимые генетические связи, но 10% наследуются доминирующим образом (семейная ALS, FALS). В последнее время были выявлены экспрессии гексануклеотида (HREs) в открытом раме считывающей рамки хромосомы 72 (C9orf72) 14,15 как генетическая причина ALS и FTD. Эти мутанты составляют 30-40% случаев FALS 16 , и различные исследования подтверждаютЧто они вызывают токсичность, воздействуя на нуклеоцитоплазматический транспорт 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .

Эти исследования в основном показали конечные результаты и проявления HREs по нуклеоцитоплазматическому транспорту, но они не демонстрируют нарушения нуклеоцитоплазмы в реальном времени. В результате был оценен только тяжелый нуклеоцитоплазматический транспортный дефицит 11 , 17 , 18 .

Этот протокол описывает новое иЧувствительный анализ для оценки и количественной оценки дисфункции нуклеоцитоплазматического транспорта в реальном времени. Скорость импорта белка NLS-NES-GFP (челночного GFP) может быть определена количественно в реальном времени с использованием флуоресцентной микроскопии. Это делается с использованием ингибитора exportin, как описано ранее 18 , таким образом позволяя челноку-GFP только войти в ядро. Используя флуоресцентную микроскопию и программное обеспечение, способное количественно определять флуоресцентные изменения в реальном времени, можно количественно оценить постепенное изменение интенсивности флуоресценции челночного GFP, расположенного в ядре. В результате может быть сделана кривая насыщения по Михаэлису-Ментену оси флуоресценции-времени, представляющая количество ядерного челнока-GFP в любой момент времени. Используя начальную линейную скорость кривых, можно создать наклон, который представляет скорость входа в ядро ​​до насыщения флуоресценции.

Чтобы подтвердить анализ, перевестиD Дипептидные повторы C9orf72, поли (GR) и поли (PR), которые, как сообщалось ранее, нарушают нуклеоцитоплазматический перенос, были использованы 5 , 7 , 8 , 10 , 12 . Используя этот анализ, наблюдалось 50% -ное снижение уровня импорта ядер по сравнению с контролем. Используя эту систему, можно рассмотреть незначительные изменения в нуклеоцитоплазматическом транспорте. Кроме того, можно определить способность различных факторов спасти нуклеоцитоплазматический транспортный дефект.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка линии клеток

  1. Оттаивайте приблизительно 1 000 000 клеток спинного мозга нейробластомы мыши (клетки NSC-34), которые хранили в контейнере с жидким азотом. Используйте 37 ° C инкубатор для воды до полного размораживания клеток.
  2. Добавить свежую, теплую среду (среду DMEM, содержащую 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 1% L-глутамина и 1% антибиотиков перорального действия).
  3. Центрифуги размораживают клетки (SL16R) при 500 × g в течение 5 мин, образуя клеточный осадок. Откажитесь от среды и добавьте 1 мл новой среды для ресуспендирования клеток.
  4. Поместите ресуспендированные клетки в колбу на 15 мл и добавьте еще 5 мл среды. Инкубируйте клетки в течение ночи в стерильном инкубаторе с 5% CO 2 при 37 ° C.
  5. Параллельно поместите 8 покровных покрытий без покрытия (покровное стекло: 12 мм, толщина 0,13-0,17 мм) в 60-миллиметровый сосуд для культивирования и стерилизовать, используя 70% этанола, и воздействие 30-минутного ультрафиолетового света, пока он не высохнет. Добавьте среду к каждому блюду и удалите, чтобы смыть остаточный этанол.
  6. Добавить трипсиновый буфер (2,5 г трипсина и 0,2 г ЭДТА в 1 л сбалансированного солевого раствора Хэнкса) к клеткам после того, как они достигнут приблизительно 90% слияния (примерно 6 миллионов клеток на колбу), чтобы позволить адгезивным клеткам диссоциировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки NSC-34 чувствительны и требуют только 15 с инкубации буфера трипсина и еще 1 мин инкубации, свободной от трипсина, перед диссоциацией с использованием среды.
  7. Тарелка клеток на 60 мм культуры блюда уже содержащие покровные с 3 мл среды, около 350 000 на блюдо. Оставьте их в инкубаторе в течение 24 часов, чтобы обеспечить прикрепление клеток к покровным.

2. Трансфекция клеток

ПРИМЕЧАНИЕ. Спустя приблизительно 24 часа клетки NSC-34 достигнут 40% слияния (приблизительно 800 000 клеток) и будут готовы к трансфекции.

  1. Подготовьте чистую среду DMEM (300 мкл среды DMEM для каждой чашки для культивирования 60 мм) в стерильной микроцентрифужной ваннеэс.
  2. Добавьте 2 мкг каждой плазмиды, необходимой для трансфекции в каждую микроцентрифужную пробирку, содержащую DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Плазмида челночного GFP является обязательной во всех трансфекциях клеток.
  3. Добавьте трансфекционный реагент во все микроцентрифужные пробирки, содержащие их требуемые плазмиды. Здесь добавляют 4 мкл коммерческого реагента для трансфекции для каждого 2 мкг ДНК.
  4. Встряхивают микроцентрифужные пробирки, содержащие DMEM, плазмиды и трансфекционный реагент и инкубируют их при комнатной температуре в течение 25 мин.
  5. Добавить каждую микроцентрифужную пробирку в чашку для культивирования и осторожно взбалтывать чашку для образования гомогенного раствора. Поместите блюдо обратно в инкубатор на 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку челночная GFP должна экспрессироваться во всех клетках, эффективность трансфекции челночного GFP может быть частично исследована и предварительно проверена с помощью флуоресцентной микроскопии после ночной трансфекции. Полное исследование нефлуоресцентных экспрессируемых белков может быть проведено с использованием иммуноблот-анализаявляется.

3. Микроскопия

  1. Прикрепите покровные стекла, содержащие трансфицированные клетки NSC-34, к держателю покровного стекла и аккуратно промойте забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), чтобы удалить отмершие мертвые клетки.
  2. Определите подходящее клеточное пятно, используя зеленый флуоресцентный фильтр с инвертированным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подходящее клеточное пятно определяется как поле зрения микроскопа, показывающее большое количество клеток (20-30 клеток в поле) и в которых ядра четко определены в клетках. Ячейки клеток внутри патча клетки сначала идентифицируются глазом и вручную маркируются программным обеспечением для получения изображений.
  3. Добавьте 200 мкл буфера Leptomycin B (LMB), содержащего ингибитор exportin-1, содержащий 10 нг / мл LMB в PBS, на покровные стекла, капая буфер на покровные стекла под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот момент времени задается как интервал нуль.
  4. Количественное определение интенсивности флуоресценции отмеченных ядер с интервалами 3 с в течение примерно 400-500 с.
  5. Протестируйте между 3 и 5 покровными каплями для каждой группы трансфекции в каждом отдельном эксперименте.

4. Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку разные клетки экспрессируют разные уровни флуоресцентного челночного GFP, важно нормализовать интенсивность ядерной флуоресценции каждой клетки до ее собственной начальной интенсивности флуоресценции.

  1. Нормализовать интенсивность флуоресценции выделенных ядер путем деления 3-х флуоресцентного интервала каждого ядра со средним из шести начальных интервалов этого ядра.
  2. После нормализации каждого ядра, создайте кривую интенсивности флуоресценции, представляющую изменение флуоресценции ядер как функцию времени для каждого клеточного пластыря. Для этого вычислите среднее значение всех ячеек в каждой ячейке-заплате (состоящей приблизительно из 20-30 ячеек в каждом патче).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Кривая интенсивности флуоресценции ядер напоминает кривую насыщения Михаэлиса-Ментена, которая лучше наблюдается в увеличенном tiМеня периоды. Это связано с уменьшением цитозольных количеств челночного GFP со временем из-за переноса ядер. Это снижение статистически снижает вероятность перехода челнока-GFP в ядро, что приводит к насыщению в ядерной флуоресценции. Наклон, полученный из линейной начальной скорости кривой, дает скорость входа V max в ядро.
  3. Проанализируйте наклоны Vmax каждого патча ячейки, полученные из трех-пяти независимых экспериментов, используя графическое программное обеспечение для создания одного склона, представляющего каждую экспериментальную группу. Выполните количественную оценку с помощью одностороннего статистического анализа ANOVA.

5. Валидация экспрессии белка

  1. Поместите культуральные чашки объемом 60 мм, содержащие остаточные клетки (не используемые в вышеупомянутом эксперименте), из каждой экспериментальной группы на льду.
  2. Утилизовать среду и дважды промыть клетки PBS для разбавления и промывки оставшейся среды.
  3. Обработайте клетки 200-400Мкл буфера для лизиса, содержащего PBS, 0,5% тритона и коктейльную таблетку ингибитора протеазы (PI). Очистите скребок с помощью клеточного скребка.
  4. Собирают клетки в буфере для лизиса в микроцентрифужной пробирке и гомогенизируют гомогенизатором при 4000 об / мин в течение 1 мин под льдом.
  5. Центрифугируют гомогенизированные клетки при 2500 мкг в течение 10 мин. Собирают супернатант, количественно определяют концентрацию белка, используя анализ Брэдфорда, и хранят до использования при -20 ° C.
  6. Соберите от 30 до 70 мкг общего белка (в зависимости от белка) и загрузите его в SDS-PAGE гель для проверки экспрессии белка с помощью иммуноблоттинга.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

С использованием описанной здесь процедуры нейроноподобные клетки NSC-34 трансфицировали белком NLS-NES-GFP (челночный GFP). Этот белок, имеющий сигнальные последовательности NLS и NES ( рис. 1 ), может перемещаться между ядром и цитоплазмой. Общий GFP может проникать в ядро...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол демонстрирует очень чувствительный и количественный новый анализ для оценки минутных изменений в нуклеоцитоплазматическом транспорте. Используя эту систему, можно наблюдать и измерять нуклеоцитоплазматический транспорт и его дисфункцию в реальном времени, а не тольк?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим всех членов лаборатории ИИ за их полезные замечания и предложения. Мы хотели бы поблагодарить профессора Марка Хиппа (Институт биохимии им. Макса Планка) за предоставленный нам вектор челночного GFP. Эта работа была поддержана грантами израильского научного фонда (ISF # 124/14), Бинационального научного фонда (BSF # 2013325), гранта интеграции карьеры Мари-Кюри FP7 (CIG # 333794) и Национального института психобиологии в Израиле NIPI # b133-14 / 15).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)tebu-bioCLU140-A
DMEM 4.5 g/L L-glucoseBiological Industries01-055-1A
FBS European GradeBiological Industries04-007-1A
SL 16R CentrifugeThermo Scientific75004030
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 IncubatorThermo Scientific3111
Cover glass 12 mm dia., 0.13-0.17 mm thickBar Naor LTD
TurboFect Transfection ReagentThermo ScientificR0531
Axiovert 100 inverted microscopeZeiss
Imaging Workbench 2Axon Instruments
Leptomycin BSigmaL2913
PBSBiological Industries02-023-1A
Homogenizer motor/control/chuck/90 degree clampGlas-Col099C K5424CE
MicroCL 17R Centrifuge, RefrigeratedThermo Scientific75002455

Ссылки

  1. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
  2. Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
  3. Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
  4. la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
  5. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877(2016).
  6. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
  7. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
  8. Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
  9. Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
  10. Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  11. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
  12. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
  13. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
  14. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
  15. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
  16. Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
  17. Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
  18. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
  19. Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
  20. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

NeuroscienceGFPNSC 34C9orf72ALS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены