Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Клеточного ионного транспорта часто может оцениваться путем мониторинга внутриклеточного рН (рН,я). Генетически Encoded рН индикаторы (GEpHIs) обеспечивают оптических количественная оценка внутриклеточного рН в клетках нетронутыми. Этот протокол подробности количественная оценка внутриклеточного рН через сотовый ex vivo жить изображений Malpighian трубочки Drosophila melanogaster с pHerry, псевдо ratiometric генетически закодированный рН показатель.
Эпителиальных ионный транспорт имеет жизненно важное значение для системного ионного гомеостаза, а также поддержание основных клеточных электрохимических градиентов. Внутриклеточный pH (pHя) находится под влиянием многих ионных транспортеров и таким образом мониторинг pH,я является полезным инструментом для оценки деятельности перевозчика. Современные генетически закодированный рН индикаторы (GEpHIs) обеспечивают оптических количественного определения рНя нетронутым клеток на клеточном и субклеточном уровне. Этот протокол описывает в реальном времени количественная оценка клеточного рНя регулирования в Malpighian трубочки (МТС) Drosophila melanogaster через ex vivo жить изображения pHerry, псевдо ratiometric GEpHI с pK хорошо подходит для отслеживания изменения рН в цитозоль. Извлеченный взрослых летать МТС состоят из морфологически и функционально различных разделов одноклеточного слоя эпителия и может служить в качестве доступной и генетически шансов справиться с возникающими модель для исследования эпителиальных транспорта. GEpHIs предлагают ряд преимуществ перед обычными рН чувствительных флуоресцентных красителей и ионоселективные электроды. GEpHIs можно пометить различных клеточных популяций, предоставлены соответствующие промоутер элементы доступны. Эта маркировка особенно полезен в ex vivo, в естественных условияхи на месте препараты, которые по своей сути неоднородных. GEpHIs также количественной рНi в неповрежденной ткани с течением времени без необходимости повторного окрашивания лечения или ткани экстернализации. Основной недостаток текущей GEpHIs является тенденция агрегирования в цитозольной включений в ответ на повреждение тканей и построить гиперэкспрессия. Эти недостатки, их решения и преимущества GEpHIs продемонстрировал в этом протоколе путем оценки базолатеральной Протон (H+) транспорта в функционально различных главных и севрюга клеток извлеченных покупать МТС. Методы и анализ описанных легко адаптируется к широкий выбор препаратов, позвоночных и беспозвоночных, и изысканность Пробирной может масштабироваться от преподавания labs сложные определения ионного потока через конкретные перевозчиков.
Цель настоящего Протокола заключается в описания квантификации внутриклеточный pH (pHi) с использованием генетически закодированный pH индикатор (GEpHI) и продемонстрировать, как этот метод может использоваться для оценки базолатеральной H+ транспорта в модели насекомых (D. melanogaster) почечной структура, Malpighian трубочку (MT). МТС служат выделительной органов плодовой мухи и функционально похожи на млекопитающих нефрон в нескольких ключевых отношениях1. МТС аранжированы как 2 пары трубочки (передняя и задняя) в грудной клетки и живота летать. Одноклеточных эпителиальных трубка каждого MT состоит из метаболически активные главных клеток с собственный верхушечный (люминал) и базолатеральной (гемоцель) полярности, а также вставными севрюга клетки. Передняя МТС состоят из 3 морфологически, функционально, и развивающих разных сегментов, особенно первоначальных расширены сегмента, переходного этапа и секреторную основной сегмент, который присоединяется к Мочеточник2. На клеточном уровне транс эпителиальных ионного транспорта в Люмене осуществляется путем апикальной плазматической мембраны V-АТФазы3 и теплообменник щелочно металл/Ч+ , а также базолатеральной Na+-K+-АТФазы4, внутрь выпрямительные K+ каналы5, Na+-Cl−/HCO3− теплообменника (NDAE1)6, и++Na -K-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, в то время как клетки Ито посредником Cl– и водный транспорт в8,9. Этот сложный, но доступным Физиологическая система обеспечивает отличные возможности для расследования эндогенного Ион транспортных механизмов в сочетании с различных генетических и поведенческих toolsets дрозофилы.
Обоснование для этого протокола был для описания генетически ковкого системы для изучения эпителиальных ионного транспорта с потенциалом для интеграции от ячейки поведение и экспорта средств в другие модели системы. Выражение pHerry10, GEpHI, производного от сочетание зеленого супер-эклиптики рН чувствительных pHluorin11,12 (SEpH) и красный рН регистра mCherry13, в МТС позволяет количественная оценка транспорта H+ отдельные ячейки MT через высокий K+/nigericin калибровки технику14. Как много ионных транспортеров двигаются H+ эквивалентов, количественная оценка внутриклеточного рН,я служит функционального представительства движения ионов через различные транспортеры. Система модель дрозофилы MT также предлагает мощные инструменты для генетических ткани конкретных трансген15 и РНК интерференции (RNAi)16 выражение, которое может сочетаться с сотовой изображений и анализы состава органа17 , 18 , 19 трубочку функции для создания надежных инструментов с вертикальной интеграции от молекул поведение. Это стоит в отличие от многих других протоколов для оценки эпителиальных биологии, как исторически такие измерения полагались на сложной и сложной микро рассечение, сложные ионоселективные электроды20,21, и дорогой рН чувствительных красители22 с ограничительной загрузки требования и бедных сотовой специфичность в разнородных тканей. GEpHIs были использованы обширно измерения рНя в различные типы клеток23. Ранние работы эксплуатируется присущие рН чувствительность от Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) для мониторинга рНя культивировали эпителиальные клетки24 , но в последние два десятилетия видели GEpHIs, используемые в нейроны25,26глии, грибов27 , и завод клетки28. Сочетание потенциал для сотовых ориентации генетической конструкции через GAL4/Уан выражение системы15 и физиологического доступности дрозофилы MT делают это идеальная подготовка для исследования рНя регулирование и транспорт ионов эпителия.
pHя регулирования была изучена на протяжении десятилетий и имеет жизненно важное значение для жизни. Подготовка MT предлагает надежную модель учить физиологии рНя регулирования, но также выполнять сложные расследования рНi регулирование ex vivo и в естественных условиях. Этот протокол описывает количественная оценка H+ движения через мембрану базолатеральной эпителиальных клеток дрозофилы MT с помощью NH4Cl пульс кислоты Погрузка техники21, но как рН показатель является генетически закодированы, эти методы и их теоретические основы могут применяться к любой подготовки поддаются трансгенез и жить изображений.
Все шаги в этом протоколе соответствует руководящим принципам использования животных клиники Майо (Рочестер, MN).
1. летать животноводства
2. Подготовка поли L-лизин слайды.
3. Подготовка рассекает блюдо и стеклянные стержни
Рисунок 1: Изготовления стекла стержней для обработки Malpighian трубочки.
A - E. Процесс нагрева и потянув Стеклодрот производить конусность и угол подходит для обработки MTs. стрелки обозначают направление и величина силы должен применяться. Ф. фотография инструмента надлежащим образом сфабрикованные стекла. Шкалы бар = 10 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
4. Подготовка перфузии системы и решения
Примечание: Перфузии системы отличаются от производителя. Этот протокол основан вокруг самотечных 8-канальный открытый резервуар с регулятором скорость входного потока и вакуум driven отток, но метод монтажа, что МТС как описано здесь могут быть адаптированы для работы с любой системой перфузии.
Рисунок 2: Перфузии системы и конфигурации изображений.
Компоненты, необходимые для физиологических оценки MT базолатеральной функции транспорта путем одновременного живут флуоресценции изображений и быстрого решения обмена. Газ линии показано являются необязательными и разрешить расширение экспериментов для оценки переноса HCO3– . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Схема потока перфузии аппарата для NH4Cl импульса экспериментов.
Стрелки показывают пути потока и клапан переключения точек. Решение перемещает от водохранилища образца, самотечный поток и обращается из образца камеры отходов колбы вакуумного всасывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
5. рассечение взрослых дрозофилы передней Malpighian трубочки.
6. Проверка изображений протокол и здоровья трубочка
Примечание: Этот протокол выполняется на Перевернутый-поля epifluorescent микроскопом с GFP (SEpH) и наборы фильтров ППП (mCherry) (470/40 Нм возбуждения (ex), 515 нм longpass выбросов (ЭМ), 500 Нм дихроичных и 546/10 Нм ex, 590 нм longpass Эм, 565 Нм дихроичных), 10 X / 0,45 воздушные цели, монохромные камеры для захвата жить изображений и изображений программное обеспечение. Протокол может быть адаптирована для любого вертикально или инвертированный микроскоп с автоматизированной фильтра переключение между GFP и ППП Оптика и изображения приобретения программного обеспечения, хотя раз оптимальной экспозиции, интенсивности света и биннинга параметры будут меняться. В анализ всех интенсивности флуоресценции должны быть проанализированы как интенсивность средняя пиксель в регионе интереса (ROI), после того, как вычитание фона в каждом канале, используя РУА с содержит не флуоресценции, прилегающих к сигналу ROI.
7. Полная калибровка pHerry в Malpighian трубочки Ex Vivo.
8. Количественная оценка базолатеральной кислоты экструзии от Ex Vivo трубочку Malpighian эпителия.
Здоровые ткани и надлежащей идентификации передней МТС жизненно важное значение для успеха этого протокола. Во время вскрытия следует позаботиться не непосредственно ощупь МТС и только ручка их мочеточника как захвата МТС непосредственно приведет к поломке (
Успех количественного определения рН,я в МТС дрозофилы полностью зависит от здоровья извлеченные МТС и качество монтажа и вскрытие (Рисунок – C). Таким образом тщательной обработке ткани как описано абсолютно необходимо. Слайды, свежезаваренным ?...
Авторы не имеют ничего сообщать.
Эта работа была поддержана низ DK092408 и DK100227 для производителя Айр был поддержан T32-DK007013. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Джулиан а.т. Доу за CapaR-GAL4 и c724-GAL4 дрозофила запасов. Мы также благодарим Джейкоб Андерсон для помощи в поддержании экспериментальный полет кресты.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Poly-L-Lysine (PLL) Solution | Sigma-Aldrich | P4832 | Store at 4 °C, can be reused. |
Nigericin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | N7143 | CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C. |
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Available from multiple vendors. |
Helping Hands Soldering Stands | Harbor Freight Tools | 60501 | Available from multiple vendors. |
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors | Bioscience Tools | PS-8S | Any comparable perfusion system can be used. |
Flow Regulator | Warner Instruments | 64-0221 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Schneider's Medium | Fisher Scientific | 21720024 | Store at 4 °C in sterile aliquots. |
#5 Inox Steel Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Can be substituted based on experimenter comfort. |
35 x 10 mm polystyrene Petri dish | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | Exact brand and size are unimportant. |
75 x 25 mm Microscope Slides | Corning Life Sciences | 2949-75X25 | Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible. |
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells. |
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" | Fisher Scientific | 14-171-129 | Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system. |
Vacuum Silicone Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Available from multiple vendors. |
Plastic Flow Control Clamp | Fisher Scientific | 05-869 | Available from multiple vendors, sterility not required |
Glass rods, 5 mm diameter | delphiglass.com | 9198 | Exact size is personal preference, multiple vendors available |
PAP Hydrophobic Pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Available from multiple vendors. |
Sealing Film | Sigma-Aldrich | P7668 | Available from multiple vendors. |
15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | Available from multiple vendors. |
50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | Available from multiple vendors. |
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | H3375 | Available from multiple vendors. |
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 69892 | Available from multiple vendors. |
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | T5130 | Available from multiple vendors. |
10X/0.45 Air Objective | Zeiss | 000000-1063-139 | Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging. |
Dissecting Stereoscope | Zeiss | Discovery.V8 | Any dissecting stereoscope can be used. |
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 10 | |
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 32 | |
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 2 | |
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera | Zeiss | Axiocam 506 mono | Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging. |
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic | Chroma | CZ909 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic | Chroma | CZ915 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
Inverted Epifluoescent Microscope | Zeiss | Axio Observer Z.1 | Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives. |
Statistical Analysis Software | Microcal | Origin 6.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Analysis Software | National Institutes of Health | ImageJ 1.50i | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Acquisition Software | Zeiss | Zen 1.1.2.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Single-edged Carbon Steel Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 71960 | Available from multiple vendors. |
Microscopy Slide Folder | Fisher Scientific | 16-04 | Available from multiple vendors. |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Available from multiple vendors. |
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Comparable items can be substituted. |
2.5 L Laboratory Ice Bucket | Fisher Scientific | 07-210-129 | Available from multiple vendors. |
NMDG; N-Methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | Available from multiple vendors. |
200 uL barrier pipette tips | MidSci | AV200 | Available from multiple vendors. |
200 μL variable volume pipette | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Available from multiple vendors. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены