JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для выделения эндосимбионтов из белокрылки Bemisia tabaci посредством вскрытия и фильтрации. После амплификации образцы ДНК пригодны для последующего секвенирования и изучения взаимности между эндосимбионтами и белокрылой.

Аннотация

Бактериальные симбионты формируют близкие отношения со своими хозяевами и придают преимуществам хозяевам в большинстве случаев. Геномная информация имеет решающее значение для изучения функций и эволюции бактериальных симбионтов у их хозяина. Поскольку большинство симбионтов нельзя культивировать in vitro , очень важны методы выделения достаточного количества бактерий для секвенирования генома. У белокрылки Bemisia tabaci был идентифицирован ряд эндосимбионтов и, как ожидается, будет иметь важное значение для развития и размножения вредителей с помощью множества подходов. Однако механизм, лежащий в основе ассоциаций, остается в значительной степени неизвестным. Препятствие частично связано с тем, что эндосимбионты в белокрылке, в основном сдерживаемые в бактериоцитах, трудно отделить от клеток-хозяев. Здесь мы сообщаем пошаговый протокол для идентификации, экстракции и очистки эндосимбионтов от белокрылки B. tabaci, главным образом, с помощью dissectiИ фильтрации. Образцы эндосимбионтов, полученные этим методом, хотя и представляют собой смесь разных видов эндосимбионтов, пригодны для последующего секвенирования генома и анализа возможных ролей эндосимбионтов в B. tabaci . Этот метод также может быть использован для выделения эндосимбионтов у других насекомых.

Введение

Бактерии, формирующие интимную симбиотическую связь с относительными хозяевами, широко распространены у членистоногих 1 . Показано, что эндосимбионты влияют на аспекты хозяев, такие как метаболизм пищи, размножение, реакции на экологические стрессы 2 , 3 , 4 и т . Д. Практически на каждом этапе развития 5 . Однако механизм, лежащий в основе ассоциаций, по-прежнему остается в значительной степени неизвестным. Геномика имеет приоритет и значение при изучении потенциальных функций и ролей бактерий. Некоторая фундаментальная информация, то есть таксономический статус, функциональные гены, пути метаболизма, системы секреции, может быть выведена из последовательностей геномов, которая проливает свет на потенциальную роль симбионтов в симбиозе. С развитием высокопроизводительного секвенирования было выделено огромное количество бактериальных геномов wС различными функциями.

Эндосимбионты имеют жизненно важное значение в гемиптеранах, таких как тли 7 , клопы 8 , псиллиды 9 , коричневые кузнечики 10 и цикады 11 . Например, Buchnera в тлях , как обязательный симбионт, было продемонстрировано, что он участвует в биосинтезе незаменимых аминокислот наряду с генами из генома тли 12 . Кроме того, обнаружена транскрипционная регуляция Бухнера 13 . В psyllids Carsonella секвенируется и занимает наименьший бактериальный геном, когда-либо найденный 14 . Все эти признаки эндосимбионтов основаны и выведены из последовательностей геномов. Поскольку эти эндосимбионты нельзя культивировать in vitro , было применено несколько подходов для выделения адекватных бактерий для sequencing. В тлях эндосимбионты экстрагируют путем центрифугирования и фильтрации и подвергают дальнейшему геномному и транскриптомическому анализу 5 . В коричневых кузнечиках эндосимбионты секвенированы вместе с целым геномом 10 насекомых.

Whitefly B. tabaci - это видный комплекс, содержащий более 35 морфологически неразличимых видов (загадочные виды), среди которых два инвазивных вида вторглись во всем мире и нанесли огромный вред сельскохозяйственному производству 15 . Следует отметить, что эндосимбионты в видах B. tabaci показали важность в развитии вредителей 16 . На сегодняшний день в белокрылке идентифицированы восемь эндосимбионтов, в том числе облигатный симбионт, Candidatus Portiera aleyrodidarum и семь вторичных симбионтов Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , Wolbachia, Fritschea и Hemipteriphilus определены 17 , 18 .

В отличие от гемиптеранов, описанных ранее, белокрылка B. tabaci является чрезвычайно крошечным насекомым длиной всего 1 мм. Большинство эндосимбионтов ограничены бактериоцитами 19 (специализированные клетки, содержащие симбионты, которые далее образуют бактериому в B. tabaci ). Кроме того, эти эндосимбионты нельзя культивировать in vitro . Единственный способ получить эндосимбионты от B. tabaci - это вырезать бактериому. Тем не менее, есть трудности при вскрытии. Во-первых, хрупкая бактериома всегда связывается с другими тканями белокрылки, которую трудно разделить. Во-вторых, крошечный размер белокрылки ограничивает выделение достаточного количества бактерий. В-третьих, эндосимбионты группируются в бактериоме, что делает его чрезвычайно сложным для получения одного вида бактерий.

Здесь мы сообщаем простой и недорогой протокол, чтобы изолировать эндосимбионты белых птиц для последующего секвенирования метагеном. Через вскрытие, очистку и амплификацию может быть получена адекватная эндосимбионтная ДНК и могут быть подтверждены виды бактерий. Описанный протокол можно использовать аналогично у других членистоногих.

протокол

1. Идентификация Белоснежной и Загадочной Видов

  1. Поддержание белых видов на хлопке Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) в клетках при стандартных условиях 27 ± 1 ° C, влажности 70 ± 10% и 14-часовом свете: темном режиме 10 часов.
  2. Соберите отдельную взрослую белокуру и гомогенизируйте в 30 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис, рН 8,4, 50 мМ KCl, 0,45% [мас. / Об.] Твин-20, 0,2% [мас. / Об.] Желатина, 0,45% [об. Vol] Nonidet P 40, 60 г / мл протеиназы K).
  3. Инкубируйте гомогенат при 65 ° C в течение 1 часа, а затем 100 ° C в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости можно увеличить время инкубации при 65 ° C. Время инкубации при 100 ° C необходимо критически контролировать для достаточной инактивации протеиназы K и предотвращения повреждения ДНК.
  4. Проведите полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием ДНК белого цвета (полученную в разделе 1.3) на основе митохондриальных цитохромоксидазы I праймеров.
    COI-F: 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
    COI-R: 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '
    1. Выполните ПЦР-реакции в конечном объеме 25 мкл, содержащем 1 U ДНК-полимеразы Taq , 2,5 мкл 10x буфера, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мМ каждого праймера и 2 мкл ДНК белого цвета.
    2. Используйте следующие условия процедуры ПЦР: начальная денатурация 95 ° С в течение 3 мин с последующим 35 циклами 95 ° С в течение 45 с (денатурация), 50 ° С в течение 45 с (отжиг) и 72 ° С в течение 1 мин (удлинение) и Еще 10 мин при 72 ° С для дальнейшего расширения.
  5. Очистите ПЦР-амплифицированный продукт с помощью набора для извлечения ДНК-геля с рекомендованным протоколом.
  6. Последовательность очищенных образцов ДНК с помощью системы последовательного анализа ДНК после инструкции изготовителя.
  7. Проанализируйте последовательности, используя базовый инструмент поиска локального выравнивания (BLAST), чтобы идентифицировать загадочные виды белых бабочек и избежать заражения других специфическихэс.

2. Идентификация и локализация эндосимбионта

  1. Выполните ПЦР на ДНК белокрылки (полученную на этапе 1.3) для амплификации специфических генов каждого эндосимбионта внутри белокрылки (рецепт ПЦР описан в разделе 1.4, а процедуры ПЦР и праймеры перечислены в таблице 1 ).
  2. Предметом амплифицированного образца к агарозному гель-электрофорезу в соответствии с ранее опубликованным протоколом 20 (1% агарозного геля, трис-ацетат-ЭДТА в качестве бегущего буфера, напряжение 5 В / см) для идентификации конкретного гена каждой бактерии.
  3. Восстанавливайте и упорядочивайте каждую полосу для определения видов бактерий в пределах белокрылки (см. Разделы 1.5-1.7).
  4. Выполните флуоресценцию in situ гибридизации (FISH) на белых бабочках для определения местоположения эндосимбионтов в соответствии с ранее опубликованным протоколом 19 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости увеличьте концентрацию флуоресцентных зондов.

    5. 3. Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА)

    1. Погрузите и закрепите белокрылки в фосфатном буфере (0,1 M, pH 7,0), содержащем 2,5% [объем / объем] глутаральдегида в течение 4 часов.
    2. Промывают образцы в фосфатном буфере (0,1 М, pH 7,0) три раза, каждый раз 15 мин.
    3. Погрузите и закрепите образцы снова в фосфатном буфере (0,1 M, pH 7,0), содержащем 1% [мас. / Об.] OsO 4 в течение 2 часов.
    4. Дегидратируйте образцы с помощью градуированной серии этанола (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% и 100%), по 15 минут каждый раз.
    5. Перенесите и погрузите образцы в 100% ацетон в течение 20 мин.
    6. Поместите образцы в смесь 100% ацетона и 100% смолы Spurr (1: 1) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    7. Перенесите образцы в смесь 100% ацетона и 100% смолы Spurr (1: 3) в течение 3 часов при комнатной температуре.
    8. Перенесите и погрузите образцы в 100% смолу Spurr (инкубированную при 70 ° C) в течение более 9 часов.
    9. Разделите образцы белых, используя микромне.
    10. Окрашивают ультратонкие пленки (приобретаемые в разделе 3.9) путем погружения в абсолютный уранилацетат в течение 5-10 мин с последующим погружением в 50% щелочного свинцового цитрата еще на 5-10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Объемы реагентов, используемые в разделе 3.1-3.10, зависят от образцов. Убедитесь, что образцы погружены в реагенты.
    11. Наблюдайте образцы в просвечивающей электронной микроскопии (15 000X) для определения локализации, формы и размера бактерий для дальнейшего использования (см. Раздел 4.6).

    4. Рассеяние и очистка бактерий Белокожий

    1. Добавьте 100 мкл 1x раствора PBS на слайд микроскопа. Возьмите 3-4 личинок из листьев хлопка и погрузите их в раствор PBS.
    2. Используйте тонкие энтомологические иглы под стереомикроскопом и вытащите бактерии из тела белокрылки.
      1. Осторожно вырежьте отверстие на одной стороне нимфы и слегка нажмите другойЧтобы выпустить бактерии.
    3. Установите микропогрузчик объемом 20 мкл (с передним концевым разрезом, чтобы соответствовать размеру бактериомы) на пипетке 0,5-10 мкл. Извлеките отдельную бактериому из раствора PBS в микронагрузчик.
    4. Вымойте бактериому, чтобы устранить загрязнение других тканей белокрылки путем пипетирования бактериомы в раствор PBS и извлечения бактериомы. Повторите три раза.
    5. Немедленно пипетируйте промытую бактериому в пробирку с центрифугой, содержащую 60 мкл 1x раствора PBS.
    6. Шприцы фильтруют собранную бактериому через мембранную мембрану размером 5 мкм (определяемую по размерам бактерий и ядро ​​бактериоцитов в белокрылом). Повторите несколько раз, чтобы тщательно перемешать смешанную жидкость через мембрану фильтра.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для достижения лучшего результата амплификации и секвенирования собирайте более 100 бактерий. Сначала смочите фильтрующую мембрану, используя 1x раствор PBS для уменьшения потери бактерийСвязывание с мембраной.

    5. Усиление геномов эндосимбионта

    1. Усильте фильтрат (в основном содержащий эндосимбионты белокрылки), используя набор амплификации ДНК по рекомендованному протоколу с некоторой модификацией.
      1. Выберите рекомендуемый протокол амплификации геномной ДНК из крови или клеток и подготовьте буфер D2 для последующего эксперимента.
      2. Непосредственно добавить 1,5 мкл фильтрата (см. Раздел 4.6) в центрифужную пробирку, затем 1,5 мкл буфера D2 и хорошо перемешать.
      3. Инкубируйте на льду в течение 10 минут и добавьте 1,5 мкл стоп-раствора.
      4. Добавьте 15 мкл реакционного буфера и 1 мкл ДНК-полимеразы и осторожно перемешайте.
      5. Инкубируйте смесь при 30 ° C в течение 16 часов, затем 3 мин при 65 ° C.
    2. Выполните ПЦР непосредственно на амплифицированном фильтрате (при необходимости разбавите амплифицированные образцы), используя специальные праймеры, предназначенные для bacTeria для подтверждения видов бактерий (см. Раздел 2.1).
    3. Проведите ПЦР для подтверждения того, существует ли загрязнение генома хозяина с использованием праймеров бета-актина бла-Actin и EF1 белой бабочки в соответствии с ранее опубликованным методом 21 (рецепт ПЦР описан в разделе 1.4).

    6. Эндосимбионтная секвенирование метагеном

    1. Предметом амплифицированного фильтрата на спектрофотометр и флюорометр (в соответствии с инструкциями производителя) перед секвенированием для проверки качества образцов и соответствия образцов критериям для секвенирования.
    2. Предметом амплификации является секвенсор генома в соответствии с инструкциями производителя.

Результаты

В качестве примера здесь были использованы виды Ближнего Востока Малой Азии (MEAM1) комплекса B. tabaci . Хлопок для выращивания белокрылок и несколько этапов развития белых бабочек показан на рисунке 1, включая хлопковое растение, взрослой белокуру и 1

Обсуждение

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Финансовая поддержка этого исследования была предоставлена ​​Национальной ключевой программой исследований и разработок (2016YFC1200601) и Национальным научным фондом Китая (31390421).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Taq DNA polymeraseTakaraR001Aincluding rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kitQiagen28704
DNA sample sequencing systemABIABI-3730XL
MicrotomeLeicaEM UC7
Transmission electron microscopyHitachiH-7650 TEM
Stereo microscopeZeissStemi 2000-C
20 μL microloaderEppendorfF2771951
Filter holderMilliporeSX0001300
Filter membrane filterMilliporeSMWP0013005.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini KitQiagen150033DNA amlification kit
NanoDropThermo ScientificNanoDrop 2000
Qubit FluorometerThermo Fisher ScientificQ33216
Genome SequencerIlluminaHiseq 2000

Ссылки

  1. Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
  2. Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
  3. Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
  4. Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
  5. Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
  6. Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
  7. Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
  8. Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
  9. Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
  10. Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
  11. Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
  12. Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
  13. Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
  14. Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
  15. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
  16. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  17. Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
  18. Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
  19. Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
  20. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
  21. Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
  22. Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
  23. Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
  24. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
  25. Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
  26. Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
  27. Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
  28. Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
  29. Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
  30. O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
  31. Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
  32. Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124Bemisia tabaci

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены