В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes

Резюме

Ранние endosome функции зависят от F-актина полимеризации. Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются биохимических и генетических манипуляции.

Аннотация

Многие ранние endosome функции, особенно грузовых белка сортировки и мембраны деформации, зависит патчи короткие F-миозина нитей, тому на мембраны от англ. Мы создали на основе микроскопии в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются генетических и биохимических манипуляции. Размещения в сахарозы градиенты из клеток, выражая раннего от англ белка GFP-RAB5 готовятся дроби от англ. Цитозольной фракции готовятся из отдельных партий клеток. От англ и цитозольной фракции могут храниться в жидком азоте, при необходимости. В assay от англ и цитозольной фракции являются смешанными, и смесь инкубировали при 37 ° C при соответствующих условиях (например, ионной силы, сокращение среды). В нужное время реакционную смесь является фиксированным, и F-актина раскрывается с Фаллоидин. Актин нуклеации и полимеризации затем анализируются микроскопии флуоресцирования. Здесь мы сообщаем, что этот assay может использоваться для изучения роли факторов, которые участвуют в актина нуклеации на мембрану, или последующих удлинение, ветвление или сшивки F-миозина нитей.

Введение

В высших эукариотических клеток белков и липидов интернализации в начале endosomes, где происходит сортировка. Некоторые белки и липиды, которые суждено быть переработке, включены в трубчатых регионов раннего endosomes и затем транспортируется к плазматической мембраны или транс Гольджи сеть (TGN)^1,2. Напротив другие белки и липиды выборочно упаковываются в регионах раннего endosomes, которые экспонат multivesicular внешний вид. Эти регионы расширить и на отрыв от ранних мембран от англ, в конечном итоге Зрелые в свободной от англ перевозчик везикулы или multivesicular органов (ECV/MVBs), которые отвечают за грузового транспорта на конце endosomes^{1, 2}.

Актина играет решающую роль в процессе реконструкции мембраны, связанные с endosome биогенеза сортировки потенциала от англ. Сортировка по утилизации пути к плазматической мембраны или TGN белка зависит от связанных белков и retromer комплекс. Этот механизм сортировки, как представляется, быть связан к формированию рециркуляции трубочки через взаимодействия retromer комплекс, с WASP и шрам гомолог (ВСГ) сложной и разветвленной актина^3,4,5 . В отличие от молекул предназначенных для деградации, особенно активации сигнализации рецепторов, в внутрипросветная везикулы (ILVs), сортируются от англ, сортировка комплексы для транспорта (ESCRT)^{2,6, 7}. Хотя возможная роль актина в процессе сортировки зависит от ESCRT не известно, F-актина играет важную роль в биогенеза ECV/MVBs и транспорта за ранней endosomes. В частности мы обнаружили, что annexin A2 связывает холестерин обогащенный регионов ранних endosome и вместе с spire1, зарождается F-актина полимеризации. Формирование сети разветвленной актина, наблюдается на endosomes требует ветвления деятельность связанных с актина белка (ARP) 2/3 комплекс, а также moesin белка ERM и актин связывания белка cortactin^8,9.

Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках. Ранее был использован этот assay расследовать роль annexin A2 в F-актина нуклеации и moesin и cortactin в формировании от англ актина сети^8,9. Этот протокол в пробирке серии сложных реакций, которые происходят на endosomes в процессе полимеризации актина стать поддаются биохимических и молекулярных анализ последовательных шагов этого процесса, включая актина нуклеации, линейный полимеризация, ветвления и сшивки.

протокол

1. решения и препараты

Примечание: все буферы и решения должны быть подготовлены в двойной дистиллированной (dd) H ₂ O. Потому что меняется состояние гидратации сахарозы, конечная концентрация всех решений сахароза должна определяться с помощью рефрактометра.

1. Подготовить фосфат амортизированное saline без двухвалентной катионов (PBS-): 137 мм NaCI, 2,7 мм KCl, 1,5 мм х ₂ PO ₄ и 6,5 мм Na ₂ HPO ₄. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Стерилизация автоклавированием (1 цикл при температуре 121 ° C 15 мин) и хранить при комнатной температуре.
2. Подготовить Стоковый раствор 300 мм имидазола: 0,204 g имидазола в 10 мл ddH ₂ O.Adjust рН 7,4 на 4 ° C, с использованием HCl. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и хранить при 4 ° C.
3. Подготовка гомогенизации буфера (HB; подготовки приблизительно 100 мл): 250 мм сахарозы в 3 мм имидазола. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 на 4 ° C, с помощью рН метр. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C. дополнение HB непосредственно перед использованием с коктейлем ингибиторов протеазы в окончательный концентрациях, соответствующий 10 мм leupeptin, А pepstatin 1 мм и 10 нг/мл Апротинин.
4. Для размещения градиентов шаг, подготовить 62%, 39% и 35%-ая сахароза решения в 3 мм имидазола, рН 7,4, как описано ниже. Точно определить окончательный концентрации всех решений сахарозы с помощью рефрактометра.
   1. Подготовить 100 мл раствора сахарозы 62% в 3 мм имидазола, рН 7,4. Растворяют путем перемешивания 80.4 г сахарозы в ddH ₂ O предварительно разогретую до 35 ° C. Добавить 1 мл 300 мм имидазола Стоковый раствор и заполнить до 100 мл с ddH ₂ O. Adjust рН 7,4 на 4 ° C. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и магазин при 4 ° C.
   2. Подготовить 100 мл раствора сахарозы 35% в 3 мм имидазола, рН 7,4. Растворяют путем перемешивания 40.6 г сахарозы в ddH ₂ O. Добавить 1 мл 300 мм имидазола Стоковый раствор и заполнить до 100 мл с ddH ₂ O. Регулировка рН 7,4 на 4 ° C. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и хранить при 4 ° C.
   3. Подготовка 50 мл 39% сахарозы в 3 мм имидазола, рН 7,4. Разбавьте раствор сахарозы 62% 35% раствором сахарозы. Хранить при 4 ° C.
5. Растворить 3 g параформальдегида (PFA) путем перемешивания в 100 мл PBS-предварительное warmed до 60 ° C при добавлении 1 M NaOH каплям; настроить окончательный рН 7,4, с использованием NaOH. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при -20 ° с.
   Предупреждение: 3% PFA является токсичных реагентов.
6. Раствор готовят 1 M KCl. Распустить 3.73 г KCl при перемешивании в 50 мл ddH ₂ O. фильтр-стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.
7. Подготовка 50 X сосредоточены акций раствор, содержащий 0,625 М Hepes pH 7.0 и 75 мм MgOAc ₂ ddH ₂ O. Алиготе и хранить в -20 ° с.
8. Подготовка монтажа среднего. Смесь, помешивая 2.4 g poly(vinyl alcohol) M _w ~ 31000 (ПВА) с 6 г глицерина. Добавить 6 мл ddH ₂ O и оставить по крайней мере 2 ч при комнатной температуре. Добавить 12 мл 0,2 М трис-Cl (рН 8,5) и тепла к ° C приблизительно 53 с иногда помешивая, пока не растворится ПВА.
9. Уточнить решения центрифугированием в 5000 x g 20 мин при комнатной температуре. Собирать супернатант и добавить 2,5% (w/v) 1,4 - diazabicyclo-[2.2.2] октана (DABCO) для предотвращения Фотообесцвечивание во время флуоресценции обнаружения. Вортекс для около 30 s распустить. Аликвота в 1,5 мл пластиковых трубок и хранить при -20 ° с.

2. Клеточные культуры

1. культуры НеЬа клетки в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего дополнена плода теленка 10% сыворотки, 10% несущественные аминокислот, 10% L-глютамином и 1% пенициллин стрептомицином. Поддерживать их при 37 ° C в 5% CO ₂ инкубатора.
2. Transfect клетки 24 h перед эксперимент с GFP-RAB5 ¹⁰, используя коммерческие трансфекции реагента по заявлению производителя ' s инструкции.
3. При необходимости, подготовить дроби от англ и цитозоле от клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих форму wildtype или мутанта протеина интереса.

3. Подготовка дроби от англ

Примечание: этот протокол описывает простой подготовке субцеллюлярные фракций, содержащих endosomes и другие легкие мембраны. При необходимости, очищенный endosome фракции также может быть использоваться ¹¹. Готовить 2 чашки Петри (наружный диаметр 10 см; 57 см ²) вырожденная клеток, выражая GFP-RAB5 как исходный материал. Общее количество вырожденная клеток HeLa в 2 чашки Петри примерно соответствует 2,5 x 10 ⁷ клеток. Когда необходимо, endosomes также может быть получен из клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих форму wildtype или мутанта протеина интереса, всегда выражая GFP-RAB5.

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: все шаги фракционирование протокола должна быть выполнена на льду

1. Петри на влажной металлической пластиной в плоский ведро льда и немедленно вымыть клетки дважды с 5 мл ледяной PBS-.
2. Удаления всех PBS - из последнего мыть и добавить 3 мл ледяной PBS-за блюдо. Клетки не должна сохнуть при обработке: в случае необходимости, место ведро льда на качающейся платформе адекватно охватывать клетки с жидкостью.
3. Механически удалить ячейки в PBS из Петри, используя гибкий резиновый полицейский (т.е., домашний мобильный волокуши). Скрип клетки от блюда сначала в быстро, круговые движения вокруг вне блюдо, следуют нисходящего движения в середине блюдо. Скрип осторожно, чтобы получить " листы " прилагаемый клеток. Аккуратно перенести ячейки, используя пластиковые пипетки Пастера с широким отверстием 15 мл конические полипропиленовые трубы на ice.
4. Центрифуги для 5 минут при 175 x g и 4 ° C.
5. Осторожно удалить супернатант (СН) и добавить 1-3 мл HB в гранулы. С помощью Пластиковая пипетка Пастера с широким отверстием, нежно Пипетка вверх и вниз один раз чтобы Ресуспензируйте клетки.
6. Центрифуги для 7-10 мин в 1355 x g и 4 ° C. Осторожно удалить SN.
7. Выполняют клетки гомогенизации.
   Примечание: Условия должны быть нежным, так что плазменных мембран клеток разбиты, но endosomes остаются нетронутыми.
   1. Добавить известный объем HB с ингибиторами протеазы на каждой ячейки Пелле (примерно 100 мкл в Пелле клеток). Аккуратно с помощью микропипеткой 1000 мкл, Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока высокомобильна клетки. Не надо ввести воздушных пузырьков.
   2. Подготовить туберкулин 1 мл шприц с иглой 22G предварительно промыть HB и свободного воздуха или пузырьков.
   3. Наполните шприц суспензию клеток сравнительно медленно (чтобы избежать создания пузырьков воздуха), место среза кончик иглы к стене трубы и высылать суспензию клеток быстро для сдвига от мембраны плазмы клеток прилагаемый.
   4. Взять небольшой Алиготе огневки (примерно 3 мкл) и развести его в 50 мкл HB на стеклянное скольжение. Mix и крышка с coverslip стекла. Осмотрите огневки под микроскопом фазово контрастной оснащены 20 X или 40 X цель.
      Примечание: При оптимальных условиях, большинство клеток нарушена, но не являются ядра, которые появляются как темно-серый и круглых структур, ( рис. 1).
   5. Повторите шаг 3.7.3 и 3.7.4 до большинства клеток сломанной; как правило, необходимы 3-6 прихваченного ударов через иглу. Храните небольшой Алиготе (10-30 мкл) огневки для определения белков.
8. Гомогенат трутневых центрифуги для 7 мин в 1355 x g и 4 ° C.
   Примечание: после центрифугирования, гранулы (определяемой как ядерной гранулы; NP) содержит ядра и супернатант (определяемой как шпагу супернатант; ПНС) содержит цитозоле и органеллы, выпущенный после гомогенизации и свободного подвеса.
9. Тщательно собирать ПНС. Держите небольшой аликвоты (10-30 мкл) векселей и NP для определения белков и отбросить NP.
10. Отрегулировать ПНС на 40,6% сахарозы, разбавляя 62% раствор сахарозы с ПНС, с использованием коэффициента 1:1.1 PNS:62% сахарозы. Смесь осторожно, но тщательно, не создавая пузырьки воздуха. Проверка концентрации сахарозы с помощью рефрактометра.
11. Место ПНС в 40,6% сахарозы в нижней части трубки ultracentrifugation. Наложение тщательно с 2,5 мл раствора сахарозы 35% и заполнить пластиковых пробирок с HB.
    Примечание: Сахароза решения следует слоистых интерфейсов явно видны.
12. Ультрацентрифуга градиенты на 1 ч в ̴165, 000 x g и 4 ° C.
13. Тщательно удалить белый слой липидов на вершине градиента. Далее, собирать интерфейс, содержащий endosomes, между HB и 35%-ая сахароза, используя 200 мкл микропипеткой с вырезать кончик.
    Примечание: Дроби от англ может использоваться непосредственно в assay актина полимеризации в пробирке или может быть aliquoted на льду, флэш замороженные в жидком азоте и хранятся на -80 ° C.
14. Определения концентрации белковых фракций ПНС и от англ.
    Примечание: Эта концентрация должна быть по крайней мере 100 мкг/мл. Примерно 2,5 x 10 ⁷ клеток, выращиваемых в 2 чашки Петри необходимы для получения ПНС с по крайней мере 100 мкг/мл (см. примечание выше).

4. Цитозоль подготовка

Примечание: подготовка 2 чашки Петри (диаметр 10 см; 57 см ²) вырожденная клеток HeLa как исходный материал. При необходимости, цитозоле также может быть получен из клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих wildtype или мутантные формы протеина интереса. Что касается протокола endosome фракционирования, все шаги должны выполняться на ice.

1. Повторите пункты 3.1-3.8.
2. Место ПНС в пластиковых пробирок и ультрацентрифугирования 45 мин в ̴250, 000 x g и 4 ° C.
3. Тщательно удалить белый слой на вершине и собирать SN (цитозоль фракция) не нарушая микросомы Пелле. Держите Алиготе цитозоль дроби для определения белков.
   Примечание: Цитозоль может использоваться непосредственно в assay актина полимеризации в пробирке или может быть aliquoted на льду, флэш замороженные в жидком азоте и хранятся на -80 ° C.
4. Определить концентрацию белка цитозоль.
   Примечание: Он должен быть по крайней мере 3 мг/мл.

5. Assay измеряя Endosome зависимых актина полимеризации В пробирке

Примечание: Endosome зависимых актина полимеризации может производиться с использованием двух альтернативных подходов. Первый подход материалы смешиваются в пробирке, фиксированной и переведен в coverslip и проанализированы. Второй подход, описанный здесь assay может осуществляться непосредственно в тепловизионной камере и можно фиксированной и анализировать без механических возмущений ( рис. 2 c). В этой второй подход пробирного смесь не передается из пробирки coverslip и таким образом остается невозмущенной, уменьшение опасности F-актина сетей, будучи физически возмущенных во время передачи. Кроме того этот второй подход совместим с покадровый анализ F-актина полимеризации. Следует отметить, что с любой подход было отмечено никакой разницы в анализе F-актина полимеризации.
Примечание: Использование вырезать советы по всему протоколу.

1. В пробирке
   1. нежно микс ледяной очищенный GFP-RAB5 endosomes (шаг 3) с цитозоле (шаг 4) в соотношении 1:10 (концентрация белка) в ледяной 1,5 мл коническую пробирку.
      Примечание: Типичный эксперимент проводится с приблизительно 40-50 мкл.
   2. Настроить ледяной реакционную смесь для окончательного концентрации 125 мм KCl (с помощью Стоковый раствор KCl 1 М), 12,5 мм Hepes и 1,5 мм MgOAc ₂ (с использованием 50 x Стоковый раствор). Затем настройте в смеси с ингибиторами протеазы для окончательного концентрации leupeptin 10 мм, 1 мм pepstatin A и 10 нг/мл Апротинин. Осторожно смешать все компоненты.
   3. И инкубировать на требуемое время и место пробирки, содержащие реакционной смеси при 37 ° C без встряхивания,.
      Примечание: Как правило, это займет примерно 3 мин для обнаружения актина полимеризации на endosomes и 30 минут для формирования широкой сети.
   4. В нужный момент (т.е., 3 мин или 30 мин), остановить реакции, поместив пробирки на льду и добавить 1/10 (vol:vol) помощи 3% раствора PFA.
   5. Добавить 0.3:10 (vol:vol) из 200 единиц/мл (~6.6 мкм) Фаллоидин спрягаются в красно оранжевый краситель пятно полимеризованной актина.
   6. Место 12 мкл смеси на 12 мкл ПВА монтажа среды на слайде микро стекла. Положить сверху coverslipon стекла 18 x 18 мм ².
   7. Анализ образца с confocal микроскопии.
2. В тепловизионной камере
   1. сделать микроскопических тепловизионных камер, используйте плазмы пылесос за 1 мин для очистки круглые диаметром 18-мм coverslip и круглых 35 мм диаметр Петри с низа стекла 20 мм (0,16-0,19 мм).
   2. Инкубировать очищенные поверхности с 1% β-казеина для 20 минут свести к минимуму связывания белков на стекло. Мыть дважды с 3 мм имидазола.
   3. Добавить endosome и цитозоле, в том же пробирного смесь как шаги 5.1.1 и 5.1.2, к помощи 1,5 мл пробирку и дополняют пробирного смесь с 0,1 мкг/мкл родамин актина.
   4. Настроить окончательный преломления смеси 1.375 (26,5% сахарозы) 39% раствором сахарозы.
      Примечание: Как правило, добавляется того же объема; Однако, это должно быть эмпирически повторно скорректированной, в зависимости от концентрации сахарозы собираемой фракции, определяется с использованием refractomer, так как концентрация сахарозы может слегка изменить от эксперимента к эксперимент.
   5. Поместить смесь в предварительно обработанные блюдо 35-мм (шаг 5.2.1) и залить предварительно обработанные coverslip 18-мм (шаг 5.2.1).
   6. Место палата при 37 ° C без встряхивания.
   7. Анализ образца с помощью конфокальной микроскопии флуоресцирования.

6. Внешние изображенияние анализа актина сети и

1. захвата изображений
   1. приобрести изображений на Перевернутый Сканирующий конфокальный микроскоп.
      Примечание: Приобретение параметры изображения были оптимизированы для Перевернутый Сканирующий конфокальный микроскоп с целью нефти NA 63 X 1,25. Отрегулируйте мощность лазера (обычно около 50%), для достижения хорошее соотношение сигнал шум.
2. Количественное определение сети актина
   1. анализ флуоресцентной микроскопии. Использование программного обеспечения с открытым исходным кодом CellProfiler (v2.1.1) ¹² измерить количество актина за endosome (альтернативное программное обеспечение может использоваться).
      1. Во-первых, определить endosomes как основной объект с помощью GFP-RAB5 сигнал. Затем, количественно F-актина, связанные с отдельными endosomes, используя распространение сигнала актина (красно оранжевый краситель конъюгированных Фаллоидин) как вторичные объект.
      2. Средняя и нормализует количество связанного материала для каждого объекта в состояние элемента управления.

Результаты

Чтобы получить понимание формирования F-актина патчи на ранних endosome мембраны, мы следовали протокол, изложенные на рисунке 2. Вкратце были transfected клеток с GFP-RAB5 и затем раннего endosomes были подготовлены субцеллюлярные фракционирования. Эти чистые раннего en...

Обсуждение

Актин играет решающую роль в endosome мембраны динамика^4,14. Мы ранее сообщали, что актина нуклеации и полимеризации происходит на начале endosomes, образуя небольшие F-актина патчи или сетей. Эти сети F-актина абсолютно необходимы для мембранный транспорт за преде?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma-Aldrich	71380
KCl	Acros Organics	196770010
KH2PO4	AppliChem	A1042
Na2HPO4	Acros Organics	424370025
Hepes	AppliChem	A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate	Fluka	63047
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A2948
Imidazole	Sigma-Aldrich	10125
NaOH	Fluka	71690
Sucrose	Merck Millipore	107687
Leupeptin	Roche	11017101001
Pepstatin	Roche	10253286001
Aprotinin	Roche	10236624001
Paraformaldehide	Polysciences. Inc	380
Alexa Fluor 555 phalloidin	Molecular Probes	A34055
Actin rhodamine	Cytoskeleton. Inc	APHR-A
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich	81381	poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000
DABCO	Sigma-Aldrich	D-2522
Tris-HCl	AppliChem	A1086
β-casein	Sigma-Aldrich	C6905
Filter 0.22 μm	Millex	SL6V033RS
Round 10 cm dishes for cell culture	Thermo Fisher Scientific	150350
Plastic Pasteur pipette	Assistent	569/3 40569003
15-mL polypropylen tube	TPP	91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm	BD Microlance	300900
Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle	BD Plastipak	300013
Micro glass slides	Assistent	2406
18 x 18-mm glass coverslip	Assistent	1000/1818
SW60 centrifuge tube	Beckman coulter	344062
TLS-55 centrifuge tube	Beckman coulter	343778
200-μL yellow tip	Starlab	S1111-0706
1,000-μL Blue Graduated Tip	Starlab	S1111-6801
1.5-mL test tube	Axygen	MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip	Assistent	1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm)	In vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Refractometer	Carl Zeiss	79729
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge	Thermo Fisher Scientific	46900
Tabletop ultracentrifuge	Beckman coulter	TL-100
SW60 rotor	Beckman coulter	335649
TLS-55 rotor	Beckman coulter	346936
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM-780
Fugene HD transfection reagent	Promega	E2311
Protein assay reagent A	Bio-Rad	500-0113
Protein assay reagent B	Bio-Rad	500-0114
Protein assay reagent S	Bio-Rad	500-0115
Cell scraper	Homemade		Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer	Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma-Aldrich	M0643
FCS	Thermo Fisher Scientific	10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Thermo Fisher Scientific	11140-035
L-Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
pH Meter 691	Metrohm
ImageJ software			NIH, Bethesda MD