Определение экспрессии клеточной поверхности и эндоцитарной скорости белков в культурах первичных астроцитов с использованием биотинилирования

Резюме

В этом отчете представлены два метода на основе биотинилирования, предназначенных для определения экспрессии клеток и эндоцитарной скорости белков, экспрессируемых в плазматической мембране.

Аннотация

Белки клеточной поверхности опосредуют широкий спектр функций. Во многих случаях их активность регулируется эндоцитарными процессами, которые модулируют их уровни на плазматической мембране. Здесь мы приводим подробные протоколы для 2 методов, которые облегчают изучение таких процессов, оба из которых основаны на принципе биотинилирования белков клеточной поверхности. Первая из них предназначена для полуколичественного определения относительных уровней конкретного белка на поверхности клетки. В нем лизиновые остатки белков плазматической мембраны сначала мечены биотиновой частью. После того, как клетки лизируются, эти белки могут затем быть специально осаждены с использованием иммобилизованного агарозой стрептавидина, используя природную аффинность последнего для биотина. Белки, выделенные таким образом, затем могут быть проанализированы с помощью стандартного метода вестерн-блоттинга. Второй способ обеспечивает средство определения скорости эндоцитовAr-клеточной поверхности в течение определенного периода времени. Белки клеточной поверхности сначала модифицируют производным биотина, содержащим расщепляемую дисульфидную связь. Затем клетки переносятся обратно в нормальные условия культивирования, что приводит к поглощению эндоцитов доли биотинилированных белков. Затем дисульфидные связи неинниционированных групп биотина восстанавливаются с использованием мембранонепроницаемого восстановителя глутатиона. Благодаря этому подходу эндоцитозные белки могут быть выделены и количественно определены с высокой степенью специфичности.

Введение

Белки на поверхности клеток играют множество ролей, центральных для поддержания функции клеток. Во многих случаях их активность зависит от или модулируется эндоцитарными процессами, которые либо временно секвестрируют их во внутриклеточных сайтах, либо направляют их на деградирующие пути ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . Здесь мы выделяем два подхода на основе биотинилирования, предназначенные для того, чтобы пользователь мог специфически маркировать и изолировать белки, выраженные на плазматической мембране, и те, которые были недавно интернализованы. С помощью этих методов экспрессия клеточной поверхности и скорость эндоцитов любого представляющего интерес белка могут быть количественно определены, что позволяет получить более четкую оценку его регулирования.

Определение относительной экспрессии белка клеточной поверхности путем биотинилирования

Биотин или витамин B7, ранее известный как витамин H ⁶ , представляет собой небольшую водорастворимую молекулу, которая может быть использована для химического изменения реакционноспособных аминов, сульфгидрильных и карбоксильных групп биологических молекул. Текущая культура биотинилирующих реагентов на поверхности клеток состоит в основном из мембранно-непроницаемых сульфированных N-гидроксисукцинимидных (сульфо-NHS) эфиров биотина или его производных, предназначенных для взаимодействия с аминами, присутствующими на боковых цепях лизиновых остатков белков, выраженных в Клеточной поверхности, когда они депротонированы в основных условиях, в результате чего последний образует амидную связь с биотиновой частью ⁷ . Таким образом, модифицированные белки клеточной поверхности затем могут быть выделены с использованием авидина, теримерного белка 66-69 кДа, обладающего большим сродством к биотину, связывающегося с ним с константой диссоциации приблизительно ^10-15 , отмечая ее как одну из Самые сильные нековалентные взаимодействия, известные ^{8 , 9} .

В предыдущих исследованиях использовался ряд альтернативных методов количественного определения экспрессии белка на поверхности клетки. Маркировка неперфинансированных клеток с использованием флуоресцентно меченных антител, специфичных для интересующего белка, с последующей визуализацией с помощью флуоресцентной микроскопии, например, является обычно используемым подходом, но в значительной степени зависит от наличия антител, которые могут связываться с внеклеточными эпитопами. Совсем недавно были успешно применены методы, связанные с использованием химерных белков, несущих рН-чувствительные флуорофоры, которые реагируют на воздействие кислых сред. ¹⁰ . Однако такие анализы обычно включают экзогенную экспрессию этих конструкций в клеточных линиях, в которых интересующий белок изначально не обнаружен. Эти подходы, тем не менее, могут предоставить ценную информацию о субклеточной локализации и экзоцитарном маршрутеЦелевого белка, и поэтому его следует использовать в сочетании с подходами на основе биотинилирования, описанными здесь, если инструменты доступны.

В типичном анализе биотинилирования клетки сначала тщательно промывают в PBS при 4 ° С. Это удаляет любые следы белков сыворотки, вводимых культуральной средой, тем самым гарантируя, что они не будут потреблять избыточные количества биотина на следующем этапе. Что еще более важно, снижение температуры приводит к значительному замедлению эндоцитоза. Затем добавляют биотинилирующий реагент. Затем клетки снова промывают и затем инкубируют с закалочным буфером, содержащим либо глицин, либо NH ₄ Cl, целью которого является инактивация всех оставшихся следов непрореагировавшего биотина. Затем клетки лизируют, после чего добавляют агароз-иммобилизованный стрептавидин для осаждения биотинилированных белков. Анализ обычно проводят через вестерн-блоттинг, позволяя относительную экспрессию клеточной поверхности различных пр.Катехинов, подлежащих количественному определению.

Благодаря основанию этого анализа он подходит для использования только с белками, обладающими участками, подверженными воздействию внеклеточной среды. Наиболее эффективными для этого являются мультимные трансмембранные белки, которые, вероятно, обладают рядом реакционноспособных лизинов в их петлевых областях, в то время как однопроходные белки, как правило, менее восприимчивы к биотинилированию. Даже в этих случаях сохраняется вероятность того, что конформационные изменения или межмолекулярные взаимодействия могут перекрывать некоторые реакционноспособные сайты, что приводит к более низким, чем ожидалось, выходам биотинилирования.

Определение скорости интернализации белков клеточной поверхности путем биотинилирования

Принципы этого анализа во многом аналогичны принципам биотинилирования клеточной поверхности, за некоторыми исключениями, наиболее важным из которых является использование обратимых реагентов биотинилирования. Группы биотина (из них) обладают дисуВ пределах их структур, которые восприимчивы к восстановителям; Это используется для обеспечения того, чтобы только белки клеточной поверхности, взятые во внутриклеточные сайты в течение периода анализа, оставались биотинилированными. Анализ обычно проводится следующим образом. Клетки сначала промывают и биотинилируют с помощью холодных реагентов, затем снова добавляют среду для культивирования клеток при 37 ° С и клетки возвращают в инкубатор; Это приводит к тому, что меченые белки клеточной поверхности подвергаются эндоцитозу. Затем добавляют глутатион восстановителя, который не может проникать через мембрану, для разрыва дисульфидных связей биотиновых остатков, связанных с белками, остающимися на поверхности клетки. Наконец, сломанные дисульфидные связи реагируют с иодацетамидом, потребляя лабильные тиольные группы и препятствуя реформированию связей. Как и раньше, клетки затем лизируют, и меченые белки осаждаются с использованием стрептавидин-агарозы.

Ограничение дискаИспользуемые в предыдущем разделе, также применимы здесь из-за сходства между методами. Кроме того, следует иметь в виду, что температурные сдвиги, участвующие в этом анализе, исключают точное определение того, сколько белка эндоцитозу для каждого возрастания времени, особенно в случае быстро интернализованных или быстро рециркулирующих белков. Поэтому анализ дает только полуколичественную оценку показателей эндоцитов. Общая флуоресцентная микроскопия внутреннего отражения может использоваться для отслеживания поглощения каждого загруженного везикула и обеспечения более точного измерения кинетики эндоцитоза. Поэтому он может служить очень полезным дополнением к этому анализу, предполагая, что имеется флуоресцентно меченная химерная конструкция представляющего интерес белка ¹¹ .

протокол

1. Определение относительной экспрессии белка клеточной поверхности в астроцитах путем биотинилирования

ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь мы проиллюстрируем применение этой технологии биотинилирования для изучения влияния ламинана молекулы внеклеточного матрикса на локализацию клеточной поверхности водопроницаемого канала аквапорин-4 (AQP4). Специализированные материалы, необходимые для этого анализа, включают сульфо-NHS-LC-биотин и стрептавидин-агарозную смолу (см. Таблицу материалов ).

1. Используя метод, описанный в Noel et al. ¹² , готовят культуры корковых астроцитов примерно за 2 недели до анализа и выращивают их в 75 см ² вентилируемых культуральных колбах. Когда астроциты сливаются на 80 - 90%, отделите их от поверхности культуры, используя 0,05% трипсина, а затем пройдите их 1: 3.
2. В течение 48 ч до анализа, когда клетки снова сливаются на 80 - 90%, прохождение астроцитов 1: 3 (с учетом cВ формате культуры) на 60-миллиметровые чашки для культивирования клеток, чтобы они были> 70% конфлюэнтными в тот день, когда эксперимент должен состояться. Убедитесь, что ячейки распределены между блюдами.
3. В течение 16 ч перед анализом пилят ламинина в культуральную среду до конечной концентрации 24 нМ и инкубируют при 37 ° С.
4. Непосредственно перед анализом подготовьте следующее, а затем поместите на лед или охладите: CM-PBS (100 мг / л MgCl ₂ ∙ 6H ₂ O и 100 мг / л CaCl ₂ в 1X PBS, pH 7,4), биотиновый буфер (0,5 Мг / мл сульфо-NHS-LC-биотина в CM-PBS), гасящий буфер (50 мМ NH ₄ Cl в CM-PBS), буфер для лизиса (25 мМ Трис, pH 7,4, 25 мМ глицина, 150 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, 1% тритона X-100, 1X ингибитор протеазы), 3X загрузочный буфер (150 мМ Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% глицерин, 300 мМ DTT и 0,01% бромфеноловый синий) и промывочный буфер (10 мМ Трис (рН 7,4), 1,5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1X ингибитор протеазы коктейль).
5. RemПриготовление блюд, содержащих культуры астроцитов из инкубатора, и отбрасывание среды.
6. Промывайте клетки трижды охлажденным CM-PBS 4 мл и поместите посуду на измельченный лед.
7. Пипетируйте 2 мл биотинового буфера в каждую лунку и осторожно наклоните посуду назад и вперед несколько раз, чтобы обеспечить полное покрытие. Оставьте на льду 30 минут.
8. Удалите биотиновый буфер с помощью аспиратора и замените его на 4 мл тушителя. Оставьте на льду в течение 10 мин.
9. Аспирируйте буфер тушения и замените его эквивалентным объемом. Снова оставьте на льду в течение 10 минут.
10. Отбросьте буфер для тушения и промойте клетки трижды охлажденным CM-PBS 4 мл.
11. Очистите клетки в 1 мл охлажденного CM-PBS с помощью клеточного лифтера и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.
12. Клетки гранул центрифугированием при 100 мкг в течение 3 мин. Отменить супернатант и повторно суспендировать клетки в 500 мкл буфера для лизиса.
13. Оставить образцы на льду в течение 30 мин, встряхивать каждые 5 мин или плИх на концевом конце вращения при 4 ° C.
14. Центрифугируйте лизат при 14000 xg в течение 10 минут при 4 ° C для осаждения любых нерастворимых в воде веществ. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную пробирку.
    1. Сохраните 50 мкл этого лизата и добавьте к нему загрузочный буфер. Затем денатурировать его, нагревая при 95 ° С в сухом бане; Это «входная» фракция, содержащая как биотинилированные белки клеточной поверхности, так и небиотинилированные цитозольные белки.
15. Увеличьте отверстие наконечника пипетки, отрезав приблизительно 0,5 см материала от его конца, используя пару острых ножниц. Используя этот наконечник пипетки, переместите 75 мкл гранул стрептавидин-агарозы (обычно хранящихся при 4 ° С) в лизат и инкубируйте при 4 ° С в течение 3 часов на шейкере / качалке.
    1. Поскольку стрептавидин-агарозу часто продают в виде суспензии, содержащей по 50% объемных шариков, суспендируют в антимикробном растворе, растирают суспензию, чтобы гарантировать, что гранулыРавномерно суспендируют, а затем пипетируют 150 мкл суспензии в каждый образец.
16. Гранулы стрептавидин-агарозные гранулы центрифугированием при 1500 × g в течение 30 с при 4 ° С.
    1. Сохраните 50 мкл супернатанта (добавьте загрузочный буфер и денатурируйте его при 95 ° C на водяной бане или нагревательном блоке); Это представляет собой «внутриклеточную» фракцию и состоит в основном из небиотинилированных цитозольных белков.
17. Ресуспендируют гранулированные гранулы в 1 мл промывочном буфере и качают это в течение 3 мин при 4 ° С. Гранулы гранул (как на этапе 1.16) и отбрасывают супернатант. Повторите этот процесс 4х, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков.
18. Гранулируют гранулы центрифугированием (1500 xg в течение 30 с при 4 ° C) и отбрасывают вышележащий промывочный буфер. Добавить 50 мкл 1X загрузочного буфера (разведенного с использованием буфера для лизиса). Высвобождение биотина и стрептавидина из гранул путем денатурации при 95 ° С; Эта доля shoUld содержат только биотинилированные белки клеточной поверхности (фракция «клеточная поверхность»).
    1. Отдельные входные, клеточные и внутриклеточные фракции с помощью SDS-PAGE ¹³ и анализ путем вестерн-блоттинга ¹⁴ .
       ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя в наших экспериментах мы использовали гель-градиент с 4-20% гранулами в сборке, для протеинов, представляющих интерес в этом исследовании, достаточным было бы выделить 12-14% разделительный гель с 4% -ным слоем укладки (каждый из которых содержал 0,1% SDS). Также следует использовать стандарт молекулярной массы соответствующего диапазона размеров. Следует отметить, что иногда наблюдаются наблюдаемые сдвиги в видимых молекулярных массах биотинилированных белков.

2. Определение скорости интернализации белков клеточной поверхности в астроцитах путем биотинилирования

ПРИМЕЧАНИЕ. Далее мы опишем типичный эксперимент по биотинилированию с импульсной цепью, используемый в этом случае для отслеживания эндоцитоза AQP4 в астроцитах. ЭтаМетод основан на том, что используется Мадридом и другими. ¹⁵ . Необходимые специализированные материалы включают сульфо-NHS-SS-биотин, стрептавидин-агарозную смолу, восстановленный глутатион и иодацетамид (см. Таблицу материалов ).

1. Подготовьте культуры кортикальных астроцитов мыши в чашках 60 мм, используя методы, описанные в предыдущем разделе. Убедитесь, что в день анализа клетки примерно 70% сливаются и что каждое блюдо содержит эквивалентное количество клеток.
2. Непосредственно перед анализом подготовьте следующее и помещайте на лед или в холодильник: CM-PBS (100 мг / л MgCl ₂ ∙ 6H ₂ O и 100 мг / л CaCl ₂ в 1X PBS, pH 7,4), биотиновый буфер (0,5 Мг / мл сульфо-NHS-SS-биотина в CM-PBS), восстанавливающий буфер (50 мМ восстановленного глутатиона, 75 мМ NaCl и 75 мМ NaOH), гасящий буфер (50 мМ иодацетамид, 1% BSA, в CM-PBS), Лизисный буфер (25 мМ Трис, рН 7,4, 25 мМ глицина, 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА, 1% тритона Х-100, 1X-ингибитор протеазы), 3X загрузочный буфер (150 мМ Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% глицерин, 300 мМ DTT и 0,01% бромфеноловый синий) и промывочный буфер (10 мМ Tris, pH 7,4, 1,5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1% тритона X-100, 1X-ингибитор протеазы).
3. Подготовьте среду для культивирования свежих клеток (DMEM, дополненную 10% Fetal Bbovine Serum (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глутамина) и поместите его на водяную баню с температурой 37 ° C.
4. Удалите культуры астроцитов из инкубатора и аспирируйте среду, используя аспиратор.
5. Промывайте клетки трижды охлажденным CM-PBS 4 мл и поместите посуду на измельченный лед.
6. Пипеткой 3 мл биотина буфера в каждое блюдо, наклонять посуду назад и вперед несколько раз, чтобы буфер был хорошо распределен, и оставить это на льду в течение 30 мин.
7. Аспирируйте биотиновый буфер и замените его 5 мл теплой среды. Инкубируйте блюдо для культивирования при 37 ° С в течение 15 мин и второе блюдо при той же температуре в течение 30 мин. Оставьте еще одно блюдо в 46, C в качестве 0-минутного образца.
8. В конце инкубационного периода отбрасывают среду и промывают клетки трижды 4 мл охлажденного CM-PBS. Пипетируйте 6 мл буферного раствора на клетки и оставляйте на льду в течение 15 мин.
9. Удалите восстановительный буфер, а затем замените 6 мл свежего восстановительного буфера. Место на льду в течение дополнительных 15 мин.
10. Удалите восстановленный раствор и замените его на 6 мл закалочного буфера. Оставьте на льду в течение 15 минут.
11. Повторите этап гашения еще раз.
12. Откажитесь от гасящего буфера и промывайте клетки трижды 4 мл охлажденного PBS.
13. Очистите клетки в 1 мл охлажденного PBS с помощью клеточного лифтера и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.
14. Клетки гранул центрифугированием при 100 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 500 мкл буфера для лизиса.
15. Оставьте это на льду в течение 30 мин и вихря каждые 5 мин. В качестве альтернативы, поместите образцы на концевой поворотный ротатор при 4 ° C в течение этой продолжительности.
16. ЦентрифугаНасыщают при 14000 × g в течение 10 минут при 4 ° C для осаждения нерастворимых в моющем материале материалов, затем переносят супернатант в новую микроцентрифужную пробирку. Сохраните 50 мкл этого лизата, добавьте к нему загрузочный буфер и денатурируйте при 95 ° C в сухой ванне; Это «входная» фракция, содержащая как биотинилированные эндоцитозные белки, так и небиотилированные белки.
17. Используя наконечник пипетки, добавьте 150 мкл суспензии стрептавидин-агарозы в лизат и инкубируйте при 4 ° С в течение 3 часов на шейкере / качалке. См. 1.15 для получения дополнительной информации об этом шаге.
18. Гранулы стрептавидин-агарозные гранулы центрифугированием при 1500 мкг в течение 30 с при 4 ° С.
19. Ресуспендированные гранулы в 1 мл промывочного буфера и порошок в течение 3 мин при 4 ° С. Гранулы гранул (согласно шагу 2.18) и отбрасывают супернатант. Повторите этот процесс 4х, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков.
20. Гранулы гранул центрифугированием при 1500 мкг в течение 30 с при 4 ° С и отбрасываютПромывочный буфер. Добавить 50 мкл 1X загрузочного буфера (разбавленный буфером для лизиса). Высвобождение биотина и стрептавидина из гранул путем денатурации при 95 ° С; Эта фракция должна содержать только интернализованные белки клеточной поверхности («эндоцитозная» фракция).
21. Отдельные входные, клеточные и несвязанные фракции с помощью SDS-PAGE ¹³ и анализ путем вестерн-блоттинга ¹⁴ .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя в наших экспериментах мы использовали гель-градиент с 4-20% гранулами в сборке, для протеинов, представляющих интерес в этом исследовании, достаточным было бы выделить 12-14% разделительный гель с 4% -ным слоем укладки (каждый из которых содержал 0,1% SDS). Также следует использовать стандарт молекулярной массы соответствующего диапазона размеров. Следует отметить, что иногда наблюдаются наблюдаемые сдвиги в видимых молекулярных массах биотинилированных белков.

Результаты

Использование биотинилирования клеточной поверхности для оценки экспрессии AQP4 плазматической мембраны в астроцитах
Обработанные ламинином культуры астроцитов и необработанные контрольные клетки подвергались биотинилированию на клеточной поверхнос...

Обсуждение

Модификации:
Поскольку эти методы были разработаны для использования с адгезивными клетками, мы указали использование PBS, содержащего 100 мг / л MgCl ₂ ∙ 6H ₂ O и

100 мг / л CaCl ₂ (CM-PBS) для этапов промывки и в качестве основы некоторых буферов, чтобы гар?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647-50
Bromophenol blue	Bio-Rad	#1610404
cOmplete protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	11697498001
Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)	Bio-Rad	#1610729
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	#1610611
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21335
EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin	Thermo Fisher Scientific	#21331
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	16000-044
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Iodoacetamide	Bio-Rad	#163-2109
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane	Sigma-Aldrich	L2020	Thaw on ice.
L-glutamine	Gibco/Thermo Fisher Scientific	25030-081
Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15)	Sigma-Aldrich	A5441
Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)	Leica Biosystems	B-DG-CE
Penicillin/streptomycin	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	111-035-045
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	10010-023
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G6529
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	862010
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-100
Streptavidin agarose resin	Thermo Fisher Scientific	#20347
Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody	Alomone	AQP-004
Tris base (Trizma base)	Fisher Scientific	BP152-1
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-1
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500