JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем способ изображения нескольких молекул в гетерогенных наноструктурах с точностью одной молекулы с использованием последовательного связывания и элюирования флуоресцентно меченных антител.

Аннотация

Для изображений гетерогенных клеточных структур, использующих одномодовую локализационную микроскопию, препятствовала неадекватная точность локализации и мультиплексирование. Используя флуоресцентные нано-алмазные фидуциальные маркеры, мы описываем процедуры коррекции и выравнивания дрейфа, необходимые для получения высокой точности в одномодовой локализации микроскопии. Кроме того, описана новая стратегия мультиплексирования madSTORM, в которой несколько молекул нацелены в одной и той же клетке с использованием последовательного связывания и элюирования флуоресцентных антител. MadSTORM демонстрируется на активированной Т-клетке, чтобы визуализировать расположение различных компонентов в связанной с мембраной структуре с несколькими белками, называемой микрокластером рецепторов Т-клеток. Кроме того, обсуждается применение madSTORM в качестве общего инструмента для визуализации многобелковых структур.

Введение

Для преодоления дифракционного предела световой микроскопии (~ 200 нм) были разработаны различные методы микроскопии с высоким разрешением. Среди них - категория методов, называемых одномолекулярной локализационной микроскопией (SMLM), которая включает в себя фотоактивационную локализационную микроскопию (PALM) и стохастическую оптическую реконструктивную микроскопию (STORM). Методы SMLM участвуют в использовании флуорофоров, которые могут переключаться между (флуоресцентными) и выключенными (темными / фотопереключаемыми) состояниями, обеспечивая последовательную локализацию флуоресценции от одиночных молекул 1 , 2 , 3 .

Благодаря совместимости с коммерчески доступными красителями и микроскопами, прямой STORM (dSTORM) стал широко распространенным методом SMLM 4 . DSTORM может регулярно достигать точности локализации ~ 10 нм, определяемой как неопределенность при вычислении центра дифрагированияИонно-ограниченная функция точечного распространения (PSF). Однако, несмотря на высокую точность, оцененную с использованием алгоритмов локализации 5 , 6 , 7 , точное определение фактического расположения отдельных молекул затруднено рядом проблем. Во-первых, механическое перемещение ступени микроскопа во время получения изображения добавляет существенную неопределенность в точность локализации. Поскольку изображения SMLM получены в течение тысяч временных рамок, наномасштабные перемещения ступени микроскопа могут значительно скомпрометировать точность окончательного изображения с высоким разрешением 8 . Чтобы компенсировать перемещение сцены во время захвата изображения, сценический дрейф обычно оценивается на основе регрессионного подгонки локализованных локализаций из самого изображения (кросс-корреляция) или последовательных локализаций из фидуциальных маркеров (коррекция фидуциарных коррекций) 1 , 9 . HowevEr, эти методы требуют оптимизации нескольких параметров для каждого стека изображений и не могут учитывать перемещение ступеней на коротких временных масштабах, таких как механическая вибрация. Золотые наночастицы и многоцветные флуоресцентные гранулы использовались в качестве фидуциальных маркеров в SMLM, но они не являются фотостабильными и приводят к значительно меньшей точности после коррекции дрейфа, чем используемые флуоресцентные наноалмазы (FND) на основе азота В madSTORM 10 .

В дополнение к пределу дифракции световая микроскопия дополнительно ограничена спектральными пределами. Для одновременной визуализации нескольких целей требуются флуоресцентные зонды с неперекрывающимися спектральными профилями, обычно ограничивающие флуоресцентную световую микроскопию до 6 цветов и SMLM до 2-3 цветов 4 , 11 , 12 . Более того, нелинейная хроматическая аберрация вызывает несоосность многоцветных изображений, wДля чего требуются обширные процедуры выравнивания с использованием разноцветных фидуциальных маркеров 8 , 13 . Чтобы преодолеть эти ограничения, в предыдущих исследованиях были отображены множественные мишени с использованием повторного фотообесцвечивания или химического тушения последовательно связанных флуорофоров 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Хотя эти способы могут преодолевать спектральные пределы микроскопии, флуоресцентное отбеливание, как известно, является токсичным процессом 20 , а длительное отбеливание или тушение может вызвать нежелательные побочные эффекты, такие как потеря сшивки. Более того, накопление флуоресцентных зондов может привести к стерической блокировке сайтов связывания в образце, предотвращению крупномасштабного мультиплексирования и надежного нацеливания эпитопов. Чтобы избежать таких стерических помех,Tudy достигло мультиплексирования с использованием стохастического обмена свободно диффундирующих фрагментов белка 21 . В то время как этот метод позволяет плотную маркировку клеточных структур, он требует обширной биохимической подготовки для выделения пептидных фрагментов, не может локализовать положения одной молекулы и не может легко облегчить крупномасштабное мультиплексирование с использованием коммерчески доступных зондов. Мы представляем подробный видео-протокол, описывающий последовательное связывание и элюирование флуоресцентных антител для мультиплексированных изображений с ограниченным размером антител размером dSTORM (madSTORM), а также использование флуоресцентных нано-алмазов для достижения точной коррекции и выравнивания дрейфа.

протокол

Предостережение: Перед использованием проконсультируйтесь со всеми листами данных о безопасности материалов (MSDS). Некоторые из химических веществ, используемых в этом протоколе, являются токсичными и канцерогенными. При выполнении протокола используйте все соответствующие меры безопасности, включая использование технических средств управления (вытяжной шкаф, перчаточный ящик) и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторные халаты, штаны полной длины, туфли с закрытыми носками).

1. Мультиплексированное изображение активированных Т-клеток

  1. Непосредственно конъюгированные антитела с краской Alexa-647 (A647) с использованием набора для маркировки антител Alexa 647. Следуйте протоколу маркировки, предоставленному производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Диализ раствора антител в 1x PBS рекомендуется перед этим шагом для повышения эффективности маркировки антител.
  2. Спиновые меченые антитела в течение 5 мин при 20 800 гц и собирают супернатант для удаления агрегированных антител.
  3. Приготовление флуоресцентных покрытий, покрытых нано-алмазом
    1. Покройте 8-луночные покровные камеры (см. Список реагентов / материалов) с 250 мкл 0,01% поли-L-лизина (PLL) в течение 15 мин, аспирируйте и высушите при 65 ° C в течение 30 минут. (Перед высыханием не промойте).
    2. Подготовьте разведение 100 нм FND в 1x PBS. Протестируйте различные разведения, чтобы обеспечить достаточное количество FND для каждого поля зрения на шаге 1.2.7 (мы используем разведение FND 1: 200, предоставленное производителем).
    3. Вихрь разведенных FND в течение 1 мин.
    4. Оказывайте супернатант FND в течение 30 с при высокой мощности.
    5. Инкубируйте ультразвуковой супернатант FND в покрытой PLL 8-луночной покровной камере в течение 30 мин при комнатной температуре.
    6. Вымойте 5x с помощью 1x PBS и визуализируйте камеру с покрытием FND, используя лазерное возбуждение 647 нм на микроскопе TIRF. В идеале, 4-10 отдельных FND должны быть видны в поле зрения с учетом соответствующего разведения FND на шаге 1.2.2 (мы используем 100X объектив с настройкой пикселя 256 x 256 пикселей, чтобы получить поле зрения 61 x 61 мкм) СПо меньшей мере, один FND, присутствующий в каждом квадранте поля формирования изображения. Если FND кажутся кластеризованными ( то есть FND со значительно более высоким сигналом, чем окружающие FND, и функцией с точным разбросом больше 200 нм), центрифуги FND на скорости 6800 rcf в течение 1 мин и повторите процедуру покрытия с использованием супернатанта FND.
    7. Добавьте в каждую лунку 250 мкл анти-CD3-антитела (10 мкг / мл) и инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C или в течение ночи при 4 ° C.
    8. Удалите раствор и добавьте 1x PBS в течение 30 секунд. Повторите эту операцию промывки 5 раз (промыть 5 раз).
  4. Активация T-клеток Jurkat
    1. Спин 1 мл T-клеток Jurkat при 800 гц в течение 6 мин и ресуспендируют в 300 мкл 1 × HBS-растворе. В идеале клетки Jurkat T должны быть в концентрации 0,5-1,0 × 10 6 клеток / мл перед вращением. 1x раствор HBS состоит из буферного раствора HEPES с 1% альбумина бычьей сыворотки, как описано ранее 22 .
    2. Добавить 150 мкл1x раствора HBS в каждой лунке и инкубировать при 37 ° C в течение 15 мин.
    3. Добавить 50 мкл ресуспендированных Т-клеток Jurkat в каждую лунку и инкубировать в течение 3 мин при 37 ° С.
    4. Добавить 300 мкл 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
    5. Вымойте 3x с 1x PBS.
    6. Пермеабилизируют клетки, добавляя 250 мкл 0,1% раствора Triton-X в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Вымойте 3x с 1x PBS.
    8. Добавить 250 мкл 1% раствора рыбьего желатина в 1х PBS в каждую лунку в течение 30 мин при комнатной температуре.
    9. Вымойте 3x с 1x PBS.
  5. Работа с изображениями Jurkat T-клеток с использованием madSTORM
    1. Добавьте 200 мкл меченого антитела в количестве 0,1-0,5 мкг / мл в фиксированные клетки в течение 1 часа при комнатной температуре.
    2. Вымойте 5x с 1x PBS.
    3. Добавьте 1 мл буфера STORM и накройте камеру стеклянным покровным стеклом, чтобы ограничить воздействие воздуха. Буфер STORM описан ранее 10 . Мы рекомендуем maKing новый буфер STORM для каждого раунда визуализации и формования буфера STORM при 20 800 rcf в течение 2 минут для удаления осадков.
    4. Используя малую мощность лазера на 647 нм в режиме TIRF, найдите в поле зрения окрашенную ячейку с по меньшей мере 3 FND. Чтобы помочь в обнаружении FND, для увеличения яркости сигнала FND можно использовать сопутствующее возбуждение с лазером на 568 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выполнение усредненной коррекции фидуциарности, описанной в разделе 2.1, улучшается с включением большего количества FND.
    5. Увеличьте мощность лазера на 647 нм и приобретите изображения. Обычно мы приобретаем 10000 кадров при 200 мс, 125 мВт, 647 нм лазер, 100X объектив TIRF (1,49 NA), 100X EM gain (5 МГц при 16 бит, коэффициент усиления 1). Детали нашей установки изображения были описаны ранее 10 .
    6. Вымойте 5x с 1x TBS.
    7. Добавить 1 мл o(3,5 М MClCl 2 , 20 мМ ТРУБ, 0,1% Tween-20, pH 6,5) и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 мин.
    8. Повторите элюирование 3 раза. (Для каждого используемого антитела необходимо проверить точные условия элюирования и количество полосканий элюирования, необходимых для удаления сигнала).
    9. Промыть 3 раза 1x TBS и добавить 1 мл 1x PBS.
    10. Photobleach с использованием лазера на 647 нм при большой мощности (125 мВт) с 405 нм лазером при 2-5 мВт для фотоактивирования красителей A647 в темном состоянии. Подождите, пока весь оставшийся сигнал от неэлюированного антитела не будет очищен от фотоэлемента. Обычно это занимает 2-5 с лазерного воздействия. Приобретение образцов изображений (~ 100 кадров) с использованием настроек STORM в 1.3.5 после элюирования и фотообесцвечивания рекомендуется подтвердить удаление сигнала.
      Этот метод обычно удаляет 99,8% сигнала. Мы рекомендуем проверить эффективность элюирования каждого антитела перед использованием в madSTORM, как показано ранее 10 .
    11. Добавить 250 мкл 4% параформальдегида в течение 15 мин. Этот пр.События обратного сшивания фиксированных молекул в клетке.
    12. Вымойте 3x с 1x PBS.
    13. Повторите шаги 1.3.1-1.3.12 для последовательной маркировки нескольких целей. На рисунке 1 показано составное изображение нескольких молекул в активированной Т-клетке Jurkat, полученной с использованием madSTORM.

2. Коррекция смещения и выравнивание мультиплексированных изображений

  1. Коррекция смещения стеков изображений madSTORM
    1. Открывайте изображения с помощью ImageJ. Мы рекомендуем конвертировать файлы изображений в формат TIFF перед открытием в ImageJ. Используйте прямоугольник ROI для выбора одного FND. Проиграйте время, чтобы убедиться, что FND отображается в каждом кадре стека изображений. Используйте Run Analysis в плагине ThunderSTORM, чтобы локализовать FND. Для усредненного метода коррекции фидуциальной коррекции, описанного в 2.1.5, важно, чтобы один FND был локализован в каждом кадре изображения ( то есть число идентифицированных пиков должно быть eКачество к числу кадров).
    2. Если FND не идентифицируется в каждом кадре, выберите другой FND. Если несколько пиков расположены в одном кадре, удалите пик, который больше всего отличается от предыдущих пиков.
    3. Повторите 2.1.2 для каждого FND в стеке изображений. Имейте в виду, что некоторые FND не должны включаться в процесс коррекции дрейфа, чтобы они могли служить в качестве независимого датчика точности коррекции дрейфа, как описано в шаге 2.1.7.
    4. Для более быстрой и менее точной коррекции дрейфа используйте алгоритмы корреляции или коррекции фидуциальной коррекции, включенные в ThunderSTORM для коррекции изображений FND. Как правило, мы используем 100 бинов, 5 коэффициентов увеличения и 0.1 коэффициентов сглаживания траектории для взаимной корреляции и 10 макс. Расстояния, 0,1 мин коэффициента видимости маркера и 0,01 коэффициента сглаживания траектории для коррекции фидуциальной коррекции. Кросс-корреляция и коррекция фидуций приведут к созданию файла коррекции, который можно применить к другим FND для проверки точности коррекции дрейфа.
    5. Для более строгой, более точной коррекции дрейфа используйте алгоритм усредненной коррекции фидуциальной коррекции (AFC), как описано ранее 10 . Этот процесс не требует оптимизации параметров и дает более высокую точность локализации, чем прогнозируется алгоритмами локализации SMLM. Однако для усредненной коррекции дрейфа требуется, по меньшей мере, 4 FND и для локализации FND в каждом кадре стека изображений. Коррекция дрейфа АФК лучше работает с включением большего числа FND, потому что большое количество локализованных FND уменьшит искажающий эффект пика выброса в данном кадре.
    6. Локализовать все функции точечного распространения в стеке изображений, используя ThunderSTORM, как описано ранее 10 . Обычно мы используем размер пикселя 100 нм, фотоэлектроны на число A / D 4,28, базовый уровень A / D - 100, коэффициент усиления EM 100, PSF: встроенная гауссовская локализация, 5-пиксельный радиус установки, метод максимального правдоподобия и 1,3 Пиксельная начальная сигма.
    7. Примените коэффициент коррекции дрейфа, полученный от FND, к локализации из всего стека изображений. Визуально проверьте окончательное изображение, чтобы обеспечить правильную коррекцию дрейфа ( рисунок 2 ). Полученный коэффициент коррекции дрейфа должен быть независимо протестирован на FND, не включенных в процедуру AFC, для измерения уровня точности коррекции дрейфа. Точность коррекционных, независимых FND с дрейфами должна быть близка к среднему значению точности / неопределенности, вычисленному из алгоритма локализации, используемого на этапе 2.1.6.
    8. Повторите шаги 2.1.1-2.1.7 для пакетов изображений madSTORM последовательно меченных антител. Имейте в виду, что локализация одного и того же набора FND в каждом стеке изображений madSTORM имеет решающее значение для следующей процедуры выравнивания.
  2. Выравнивание изображений madSTORM
    1. Вычислите положение центра тяжести с коррекцией с помощью дрейфа FND в каждом изображении madSTORM. Для этого найдите среднюю ось x и y poДля каждого локализованного FND, и усредняют средние значения x и y всех FND в каждом изображении madSTORM. Подробный алгоритм для этого шага описан ранее 10 . Выровняйте последовательные изображения madSTORM, используя положения центроида фидуциарных маркеров FND. Чтобы выполнить выравнивание, вычислите смещение между двумя локализованными изображениями madSTORM, вычитая центральное положение FND во втором изображении madSTORM с первого. Затем вычитайте величину смещения из всех локализаций во втором изображении madSTORM.
    2. Мы рекомендуем использовать первое изображение madSTORM в качестве эталонного изображения и повторить этот шаг выравнивания между первым и третьим, первым и четвертым и т. Д. Проверьте точность выравнивания, измеряя смещение между FND, не включенными в процесс выравнивания. Большие смещения могут указывать на то, что при вычислении позиций централизованного последовательного изображения madSTORM использовались различные наборы FND.
    3. Если это так, шаги 2.2.1-2.2.2 shouLd повторяется с использованием того же набора FND для выполнения выравнивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Предусмотрены пользовательские коды как для процедуры коррекции смещения АЧХ, так и для выравнивания.

Результаты

Последовательный метод элюирования и окрашивания использовался для создания мультиплексированного изображения madSTORM микрокластеров и других структур в активированной Т-клетке Jurkat ( рисунок 1 , выравнивание фигур). Каждое псевдоцветное изображение пр...

Обсуждение

Процедуры последовательного мультиплексирования, коррекции дрейфа и выравнивания в madSTORM обеспечивают точную, очень мультиплексированную визуализацию гетерогенных структур в клетках. 10 Кроме того, madSTORM избегает ограничений многоцветного STORM, таких как хроматическая абе...

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Xufeng Wu за доступ к микроскопу STORM. Это исследование было поддержано Программой внутриутробных исследований Национального онкологического института (NCI) по исследованию рака и Национальным институтом сердца и легких крови (NHLBI).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
8 well coverslip chamberLab-tek155409
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamondAdamasRed FND
anti-CD3ε antibodyBD Biosciences555329
Bovine serum albumin, Fraction VKSE Scientific98-100P
Triton-XSigma-AldrichT9284
10% ParaformaldehydeEMS15712Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skinSigma-AldrichG7041
Alexa 647 antibody labeling kitThermo FisherA20186
Magnesium Chloride hexahydrateSigma-Aldrich138924
PIPESSigma-AldrichP6757
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7154Highly toxic, air sensitive
CysteamineSigma-Aldrich30070Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%Sigma-Aldrich138924Highly toxic, air sensitive
10x PBSKD MedicalRGF-3210
10x TBSKD MedicalRGF-3385

Ссылки

  1. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  2. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  4. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  5. Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
  6. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  7. Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
  8. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
  9. Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
  10. Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
  11. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  12. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  13. Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  16. Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
  17. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  18. Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
  19. Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
  20. Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
  21. Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
  22. Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
  23. Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены