Характеризующие клеток миграции в рамках трехмерной в Vitro рану среды

Резюме

Цель настоящего Протокола заключается в оценке влияния про - и анти migratory факторов миграции клеток в матрицу трехмерного фибрина.

Аннотация

В настоящее время большинство моделей в vitro ранозаживляющие, таких устоявшихся скретч анализов, включают изучение клеток миграции и раны закрытия на двумерной поверхности. Однако физиологической среды в которой в vivo заживления занимает место трехмерной вместо двухмерного. Она становится все более очевидным, что поведение клеток отличается значительно в двумерных и трехмерных средах; Таким образом существует потребность в более физиологически соответствующих в vitro моделей для изучения поведения миграции клеток в рану закрытие. Метод, описанный здесь позволяет для изучения миграции клеток в трехмерной модели, которая лучше отражает физиологических условиях чем ранее установленных двумерных скретч анализов. Цель этой модели является для оценки нарост клеток через изучение миграции клеток от тела сфероида, внедренные в матрицу фибрина в присутствии про - или анти migratory факторов. С помощью этого метода, нарост клеток от сфероида тела в матрицу трехмерного можно наблюдать и легко поддающихся количественной оценке с течением времени через brightfield микроскопии и анализа сфероида площади тела. Влияние pro перелетных и/или ингибирующих факторов на ячейку миграции также может быть оценен в этой системе. Этот метод обеспечивает исследователей с простой метод анализа миграции клеток в трехмерной рану связанных матрицы в пробирке, увеличивая таким образом актуальность в пробирке клеток исследования предварительного использования животных в естественных условиях модели.

Введение

Заживление ран — сложный процесс, который приводит к восстановлению целостности тканей, после травмы. Этот процесс разбит на четыре перекрывающихся стадии, охватываемых гемостаз, воспаление, распространением и реконструкции, которые каждый регулируются сложной сочетание растворимых подсказки, ячейки матрицы взаимодействия и коммуникаций ячеек. ^{1 , 2} согласование этих подсказок управляет множество клеточных реакций в заживлении ран, главное, включая миграции клеток. ^{3 , 4} ячейки миграция представляет собой весьма динамичный процесс зависит от сотовой фенотипы и биохимические и биофизические свойства окружения внеклеточного матрикса. ⁵ клеток непрерывно зондировать их внеклеточного матрикса среды при посредничестве Интегрин путями; Этот процесс позволяет клетки смысле широкий спектр свойства матрицы, включая топографию, жесткость и родов. Двухмерный (2D) анализ миграции клеток показывает, что миграция обусловлена формирования lamellipodia на переднем крае через поколение актина накаливания связки. Последующее формирование фокуса спаек на переднем крае, в сочетании с actomyosin driven сужением и втягивание в задней кромки, диски клетки вперед. ⁶ клеточной миграции трехмерные (3D) в настоящее время не вполне понятно, однако, последние исследования показывают, что 3D миграции заметно отличается от выше описанный механизм в 2D и скорее всего обусловлен укрепляющий механизмов. Например недавние исследования, проведенные Петри и др. продемонстрировал, что, в зависимости от свойства ECM, клетки в 3D матрицы можно переключаться между lamellipodium и lobopodium приводом механизмов миграции. ⁷ потому что клетки миграция является критически важным компонентом ранозаживляющее ответ, 3D модели миграции клеток имеют решающее значение для понимания физиологической реакции на различные раздражители во время заживления ран. Хотя было показано, что миграционные поведение клеток на 2D поверхности значительно варьируются от миграции в 3D матрицы, самые последние в vitro модели миграции клеток во время заживления процесса, в том числе устоявшихся скретч assay, используют 2D однослойная культур. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} более недавно разработали анализов использовали 3D матрицы, но по-прежнему культуры клеток в монослое поверх матрицы, ограничивая тем самым возможность действительно резюмировать трехмерность клетки окружающей среды в vivo. ¹⁵

Метод, описанный здесь предназначен для изучения миграции клеток в физиологически соответствующих 3D-модели, а не на 2D поверхности, чтобы получить более надежные понимание ответов миграции, связанные с прикладной раздражителей. Этот метод позволяет для оценки миграции клеток внутри 3D фибринового сгустка матрицы при наличии факторов, которые тормозят пути, связанные с миграцией ячейки или активировать. Матрица фибрина был выбран для этого метода за счет фибрина играет важнейшую роль на ранних этапах заживления ран; следующие травмы, сгусток фибрина образуется в рану среды остановить потери крови и служит леску для первоначальная клеточная инфильтрация ткани ремонт и реконструкцию. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} Кроме того, клинически, как хирургические герметик используется фибрина и состав герметики был привязан к миграции клеток и ultimate исцеление результатов. Предыдущие исследования, Кокс и др. расследование миграции фибробластов с сгустков фибрина, состоит из различной фибрина и концентрации тромбина для целей оптимизации фибринового герметика. В этих исследованиях была количественно миграции клеток из сгустков фибрина на пластмассовые блюда. ²⁰ здесь мы представляем метод, который позволяет для количественной оценки миграции клеток в среде 3D фибрина. В то время как метод, описанный в настоящем Протоколе конкретно использует фибрина, эта модель действия можно легко изменить для использования альтернативных матрица материалы по желанию, например коллаген или других 3D матрицы. Кроме того мы представляем использование сфероидов фибробластов в этот assay, потому что миграции фибробластов в рану кровать имеет первостепенное значение для синтеза внеклеточного матрикса и ткани ремонта/реконструкции. Однако во время ремонта процесс нейтрофилы являются первый тип ячейки для переноса в рану кровать, следуют макрофагов. Фибробласты начинают затем проникнуть примерно через 48 часов после первоначальной травмы, в начале пролиферативной стадии процесс заживления раны окружающей среды. ¹⁹ этот assay может быть легко изменен для включения нейтрофилов, макрофагов или другие типы клеток, чтобы оценить влияние изменений в структуре сгусток фибрина миграции этих типов клеток. ²¹

Для реализации этот assay, во-первых, сфероиде фибробластов формируется с помощью изменения методов, описанных ранее для стволовых клеток культуры. ²² фибробластов сфероида впоследствии передается в матрицу 3D фибрина, и следствием затем можно легко контролировать и количественно в течение нескольких дней. Этот протокол учитывает 3D физиологических систем, внедрив сфероидов 3D ячейку в матрице фибрина, таким образом избегая ограничений в релевантности, вызвали рост 2D поверхности с помощью монослоя клеток для мигрирующих поведение модели, в то время как все еще позволяющ для оценки поведения клеток в среде высоко контролируемых в пробирке .

протокол

1. день 1: клетки и подготовка реагента

Примечание: все ячейки и реагента подготовка должна быть выполнена в биологической безопасности кабинета для предотвращения контаминации образцов.

1. Теплый фильтруют Дульбекко ' s Modified Eagle ' s среднего (DMEM), плода бычьим сывороточным (ФБС), L-глютамина и пенициллин/стрептомицина в ванну воды 37 ° C.
2. Подготовка неонатальной человека фибробластов дермы (HDFn) средства массовой информации, дополняя утепленные DMEM с 10% FBS, пенициллин/стрептомицина 1% и 1% L-глютамина.
3. Оттепель флакон замороженных HDFns и центрифуги для 8 минут при 200 x g для удаления криоконсервирования среднего. Ресуспензируйте клетки в подготовленный HDFn СМИ на плотности 1 x 10 ⁶ клеток/мл и семян в колбе культуры T-75.
4. Место колбу в инкубаторе (37 ° C, 5% CO ₂), чтобы позволить пролиферации.
5. СМИ HDFn магазин на 4 ° C.
6. Подготовить про - и анти migratory реагентов при необходимости.

2. День 3: Подготовка сфероида

1. выполнить следующее в капюшоне культуры для предотвращения контаминации образцов.
2. Когда клетки достигают 80% confluency, аспирационная СМИ и добавьте 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Хранить настой в инкубаторе 37 ° C за 5 мин до полного отсоединения клетки с поверхности колбы.
3. Добавить 5 мл утепленные СМИ в колбу для нейтрализации трипсина.
4. В пробки microcentrifuge, смешать 10 мкл Трипановый синий и 10 мкл суспензии клеток.
5. Центрифуга оригинальный суспензию клеток для 8 минут при 200 x g.
6. В то время как это время центрифугировали суспензии клеток, добавить 10 мкл суспензии клеток Трипановый синий Горяева и выполнить подсчет клеток.
7. После центрифугирования, аспирационная СМИ без выбивании Пелле ячейки. Ресуспензируйте Пелле клеток в концентрации 1,25 x 10 ⁵ клеток/мл.
8. Добавить 5 мл стерильной фосфатный буфер (PBS) в нижней части 10 см Петри для поддержания гидратированных окружающей среды во время роста сфероида.
9. Инвертировать крышку Петри. Добавить несколько капель 20 мкл суспензии клеток на внутренней поверхности крышки Петри.
10. Быстро перевернуть крышкой снова и снова поместите ее на нижней части блюдо, стараясь не выбить висит капли. Рисунок 1 иллюстрирует успешно сформированные висит капли.
11. Осторожно поместите блюдо в инкубаторе 37 ° C и позволяют сфероидов расти в висит падение культуры в течение 72 ч.

3. День 6: Встраивание сфероидов в 3D матрицы

1. выполнить следующее в капюшоне культуры для предотвращения контаминации образцов.
2. Для формирования первого слоя фибрина, создайте решение сгусток достаточного объема для добавления 100 мкл раствора сгусток на хорошо для как много скважин как требуется (1 сфероида за хорошо). Тромбы состоят из 10% 10 X HEPES буфера тома (250 мм HEPES, 1500 мм NaCl, 50 мм CaCl ₂, рН 7,4), 2 мг/мл человека фибриногена и 0,1 ед/мл человека альфа тромбина. Остальная часть объема сгустка состоит из сверхчистой воды.
   1. Добавить тромбина последний и быстро добавить решение в желаемой скважин в 48-ну пластине для того, чтобы предотвратить сгустки полимеризовать до добавляемый скважин.
3. Осторожно встряхните/ПТП хорошо пластины для обеспечения что смесь сгусток фибрина покрытие всего хорошо, а затем поместить хорошо пластины в инкубаторе для 1 h, чтобы нижний слой сгусток для полимеризации. Не трясите хорошо плиты достаточно трудно побудить формирования пузыря; просто рок плита при необходимости до тех пор, пока полностью хорошо покрытием. Если используются большие объемы сгусток, этот шаг не может быть необходимым.
4. Передать слоем фибрина сфероидов. Плиты
   1. Удалить также и Петри, содержащий сфероидов в висит падение культуры из инкубатора и изучить сфероидов под микроскопом. Затем поместите блюдо в культуре Худ.
   2. Осторожно перевернуть крышкой Петри блюдо, чтобы разрешить доступ к висит падение культур.
   3. Иглой 21 G прилагается к 1 мл шприц, тщательно передачи одной капли от Перевернутый крышку в центр каждый хорошо, стараясь не прокола слой полимеризованной фибрина, покрытие нижней части колодца. Для эффективной передачи падение, медленно потяните падение в иглу. Остановить потянув поршень обратно, как только весь падение находится внутри иглу; слишком далеко отойти падение может ввести пузырьки воздуха, которые могут помешать передаче эффективных сфероида или последующих изображений.
   4. Изучить хорошо пластины под микроскопом, чтобы обеспечить, что сфероидов должным образом переведены все желаемые Уэллс.
5. Для формирования второго слоя фибрина, создайте другое решение сгусток, используя же подготовку, как указано выше для создания первого слоя фибрина (шаг 3.2). Тщательно Пипетка 100 мкл на каждой капли, содержащие сфероида и рассмотреть под микроскопом снова, чтобы убедиться что сфероидов цел и не были толкаемых к краям скважин.
6. Возвращение хорошо пластины для инкубатора и позволяют второй слой для полимеризации за 1 ч.

4. День 6: Добавление Pro мигрирующих или ингибирующих факторов

1. теплой HDFn СМИ до 37 ° C.
2. Выполните следующие действия в капюшоне для предотвращения контаминации.
3. Подготовить СМИ для каждой группы, включая соответствующие концентрации pro/анти-migratory агентов оцениваться.
4. Удалить пластину хорошо из инкубатора и место в культуре Худ.
5. Добавить 500 мкл стандартных средств массовой информации для каждой скважины в контрольной группе сфероида, 500 мкл ингибирующее средств массовой информации для каждой скважины препятствует миграции сфероида группы и 500 мкл pro мигрирующих СМИ для каждой скважины группе миграции расширение сфероида.
6. Пластину хорошо вернуться инкубатора.
7. Изменение СМИ каждые 48 ч.

5. 6-9 дней: оценки клеток миграции и пролиферации

сфероидов

1. изображения, с помощью микроскопии brightfield сразу же после добавления СМИ (0 h) и затем каждые 24 ч для 72 ч. Дополнительно: в каждый момент времени, принимать z стек изображений для того, чтобы определить, если миграция происходит в плоскости вне области основного внимания. Наш опыт это не происходит; Однако, это полезно для обеспечения, в этом случае в каждом эксперименте.
2. Использование ImageJ определить ячейки нарост в каждой скважине, анализируя процентное увеличение площади для каждого сфероида трассировки границы ячейки для каждого сфероида в каждой точке раз подряд и используя " меры " функции для получения области.

Результаты

Сфероида культуры могут быть использованы для успешно оценить влияние pro и анти мигрирующих агентов миграции фибробластов в пробирке
3D фибробластов сфероидов могут быть созданы через повешение падение культуры в течение 72 ч (рис. 1). После пе...

Обсуждение

Этот протокол позволяет для изучения миграции клеток в заживлении ран связанные ECMs через 3D модель в пробирке . Решающим шагом в правильное выполнение процедуры является надлежащее развитие фибробластов сфероидов; концентрация клеток во время подготовки был оптимизирован дать на...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes