JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем метод, который сочетает в себе в situ MHC-Тетрамер пятнать иммуногистохимия для определения локализации, фенотип и количество антиген специфические Т-клеток в тканях. Этот протокол используется для определения пространственных и фенотипические характеристики антиген специфические CD8 Т-клеток по отношению к другой тип клеток и структуры в тканях.

Аннотация

Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка MHC-Тетрамер пятнать антиген специфические Т-клеток проанализирована подачей cytometry революционизировало нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии невозможно определить пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущие методы дезагрегирования чтобы извлечь T клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани. На месте MHC-Тетрамер окрашивание (IST) — это метод для визуализации Т-клеток, которые являются специфическими для антигенов интерес в тканях. В сочетании с иммуногистохимия (IHC) IST можно определить изобилие, местоположение и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях. Здесь мы описываем протокол к пятно и перечислить антиген специфические CD8 Т-клеток, с конкретными фенотипов, расположенных в пределах конкретных тканей отсеков. Эти процедуры являются те же, что мы использовали в нашей недавней публикации Li et al., под названием «Обезьяний вирус иммунодефицита-продуцирующие клетки в фолликулах частично подавлен CD8 клетки+ In Vivo.» Описанные методы широко применяются, потому что они могут использоваться для локализации, фенотип и количественно практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток для которой доступны MHC-тетрамера, в любой ткани.

Введение

Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка пептида/MHC класса I Тетрамер окрашивание антиген специфические CD8 T клетки1 и более последние разработки MHC класса II Тетрамер окрашивания клеток CD4 T2 подачей cytometry революцию нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии не позволяет для обнаружения пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущий дезагрегирования методы для извлечения Т-клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани3.

Мы и другие разработали методы, с помощью загрузки пептидной MHC класса I и класса II Тетрамер или multimer реагенты пятно антиген специфические CD4 T и CD8 клетки в тканях4,5,,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Эти IST методы позволяют для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях и обеспечивать средства для выявления этих клеток относительно других ячеек и структур в тканях. Наша группа широко использовала MHC-I Тетрамер окрашивания для изучения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) - и обезьяний иммунодефицита (СИВ) - конкретных CD8 Т-клеток лимфоидной, половых органов и ректальной тканей, чтобы получить представление о ВИЧ и Сив иммунопатогенезе и выявления корреляты успешной вакцинации стратегии14,,1516,17. Кроме того мы также разработал метод, который сочетает в себе IST в situ гибридизация (ISH) для локализации и количественно вирус специфических Т CD8 клетки и клетки, инфицированные вирусом, в тканях и определить в vivo эффекторных до целевых уровней 18 , 19.

Здесь мы описываем протокол, с помощью загрузки пептидной MHC-I тетрамера пятно антиген специфические CD8 Т-клеток в разделах свежие ткани, чтобы изображение тканей с помощью IHC и дать количественную оценку клетки с конкретными фенотипы в отсеках конкретных тканей. Эти процедуры являются так же, как были использованы в нашей недавней публикации Li et al., в котором мы определили местонахождение, изобилия и фенотип SIV-специфических Т-клеток в лимфоидной ткани во время хронической инфекции SIV в макак20.

Для выполнения этой процедуры, свежие ткани секционного и инкубированы всю ночь с загрузки пептидной MHC-I тетрамера конъюгированных флуоресцеин тиоцианат молекулы (FITC). Затем они фиксируются в параформальдегида. После фиксации ткани, сигнал от тетрамера MHC усиливается с использованием антител анти FITC кролика и инкубировали с дневно меткой анти кролик IgG антитела, которые далее усилить сигнал от связанного тетрамера. IHC используется в сочетании с IST характеризовать антиген специфические Т-клеток и окружающие клетки. Антитела, которые признают epitopes на поверхности клеток или внеклеточного пространства, включены в основной инкубации с тетрамера. Антитела, которые признают внутриклеточных epitopes требуют пропитывание клеточной стенки до окрашивания. В разделах окрашенных тканей отражаются с помощью конфокального микроскопа и проанализированы с помощью конфокальной программного обеспечения. Приклеенные этикетку клетки являются количественно с помощью конфокальной микроскопии программного обеспечения или ImageJ. Описывается протокол может использоваться для пятна практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток в любой ткани для которых MHC-I тетрамера доступны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. день 1: свежие ткани секционирование и основная инкубация

  1. использования скальпеля для свежих ткани нарезать небольшие (около 0,5 см шириной 0,5 см высотой). Отдельно клей каждой ткани на поршень и вставлять их в 3-5 мл 4% температура расплава агарозы в PBS. Ярлык поршень с информацией ткани с помощью наклейки. Положите его в охлажденной держателя в ведёрке со льдом затвердеть.
  2. Включите микротома и набор, толщина секций 200 µm. установки лезвия бритвы микротома и вставьте поршень монтируется с ткани в ванне микротома.
  3. Подготовить фосфат амортизированное saline с гепарином (PBS-H), добавив 100 мкг/мл или 18.7 ед/мл гепарина PBS для сохранения РНК и разрешить потенциальные иш приложений вниз по течению. Наполнить ванну микротом, охватывающих встроенных ткани, с 100-120 мл охлажденного, стерильные PBS-H. Добавить кубики льда PBS-H в ванну для поддержания температуры на 0 - 2 ° C. Start микротома и вырезать ткань разделов 200 мкм.
    Примечание: Важно сохранить ткани, охлаждается на льду для сведения к минимуму клеточную активность в тканях и потому что свежие ткани легче раздел, когда он охлаждается. PBS одиночку может использоваться, если есть нет планов по течению ISH.
  4. В качестве альтернативы, для тканей, которые не режут с микротом (например, кишечника и легких), использовать скальпелем или лезвием бритвы для нарезать тонкими полосками, как ткани как можно ближе к 200 µm.
  5. Этикетка крышку 24-ну тканевые культуры пластин с данными экспериментального образца и место ткани камер в соответствующих скважин. Использовать кисть для передачи разделов в ткани камеру набор в хорошо 24-ну культуры ткани пластины, содержащие 1 мл охлажденной PBS-H.
    Примечание: Многоразовые ткани камеры должны быть сделаны до начала пятнать. Ткани камеры могут быть сделаны с помощью 14 мл полипропиленовые раунд дно оснастки крышка трубки и сетка. Используйте острые лезвия бритвы с обрезают в нижней части 14 мл полипропиленовые раунд дно оснастки Кап трубки. Вырежьте сетка в круг, чтобы поместиться в отверстие в нижней части трубки. Тепла в круг сетки проволока, с помощью горелки Бунзена, до тех пор, пока это докрасна. Очень быстро установить круг сетки проволока вниз и вставьте трубу на сетке. Убедитесь, что сетка надежно прикреплена к нижней части трубки и затем тщательно отрезать в верхней части трубки на отметке 3 мл, используя острые лезвия бритвы. В каждой ткани камеру, или до 1 см 2 ткани в хорошо Положите до 3 разделах ткани. Сохранить по крайней мере один пустой колодец между скважинами с комбинации различных антител, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    6. Тетрамер
  6. приступить к первичной реплике и антитело пятная сразу же после окончания передачи всех отрезока разделов в ткани камеры. Держите разделы погружен и охлажденные в 1 мл PBS-H во все времена.
  7. Инкубировать разделов ткани на ночь с 0,5 мкг/мл конъюгированных FITC, загрузки пептидной MHC-I тетрамера разводят в PBS-H с 2% нормальной козьего сыворотки (НГС). Мышь или других кролика-антитела, направленные на внеклеточные epitopes интерес в этом инкубации (например, антитела анти CD8 крыса разводят 1: 500 в PBS-H с 2% NGS). Место 1 мл разбавленной антител в каждой скважине.
    Примечание: Следует при выборе CD8 антител, как некоторые могут повысить и некоторые могут препятствовать MHC-тетрамера к Т-клеточных рецепторов 4 , 21. Крыса античеловеческие CD8 антитела описанных здесь неустойчива и иногда приводит к несколько слабых пятнать. Он используется здесь для тройной маркировки, потому что это только не кролик и антитела CD8-мышь протестированы что CD8 Т-клеток окрашенных резус макака.
  8. Использовать 1 мл раствора на хорошо для основного антитела и всех последующих инкубаций и выполнять этот и все последующие инкубаций при 4 ° C, с пластинами на качающейся платформе.
    Примечание: Ткани должны свободно плавать в камере.

2. День 2: Фиксация и вторичных инкубации

  1. после первичного инкубации, мыть разделы дважды с 1 мл охлажденного PBS-ч 20 мин каждый мыть. Сделать это путем передачи ткани камер различных культуры ткани 24-ну пластины, содержащие 1 мл охлажденной PBS-H в соответствующем скважинах.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не капать содержимое из одного экспериментального образца в другую, при перемещении между камерами ткани. Для всех последующих инкубаций и смывки аналогичным образом передать ткани камеры чистого пластину, содержащий соответствующее решение. Убедитесь в том, что контролировать разделов в ткани камерах во время процедуры, чтобы убедиться, что разделы не застревают в стороны ткани палат. Если они подтолкнуть их обратно в решение.
  2. Исправить разделы с 1 мл свежего PBS-амортизированное параформальдегида 4% для 2 ч при комнатной температуре (не слишком исправить). Мыть холодной PBS-h дважды за 5 мин
    Предупреждение: Параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
    Примечание: Если для выявления внутриклеточных epitopes требуется извлечение антигена и permeabilization, антигены можно извлечь путем кипячения в подразделах 0,01 моль мочевины после фиксации параформальдегида.
  3. Переноса разделов в 24-ну культуры пластин, содержащий 0,01 моль мочевины и место этих плит в микроволновой печи. Отварить в разделах три раза около 10 s каждого, в общей сложности 30 s.
    Примечание: Будьте очень осторожны, как кипячение решение может заставить разделы из скважин. Если это произойдет, используйте кисть для отодвинуть разделы из сторон палаты ткани или крышку плиты в нижней части камеры соответствующие ткани.
  4. Ранее на вторичное антитело инкубации, разрушения и блокировать разделов ткани, инкубации их в блокировки раствор, содержащий PBS-H, 0,3% моющего средства (PBS-H-T) и 2% NGS на рокер за 1 ч при 4 ° C. выполнение последующих антитела инкубаций с PBS-H-T/2% NGS.
  5. Для вторичного инкубации, передачи разделов в ткани камер для скважин, содержащие мэм разбавленный антитела анти FITC кролика в PBS-H-T/2% NGS. Инкубируйте на ночь.
  6. Выполнять counterstaining с помощью мыши анти CD20 антитело разводят 1: 200 в PBS-H-T/2% NGS. Для этого варианта получения epitopes, если это необходимо, пронизывают клетки и блокировать до инкубации, как описано выше.

3. День 3: Третичный инкубации

    ,
  1. после второго инкубации, мыть в разделах три раза в PBS-H на 4 ° C для по крайней мере 20 мин.
  2. Выполнить окончательное инкубации с соответствующим дневно помечены антител (например, коза анти кролик конъюгированных зеленовато-жёлтый, коза анти крыса конъюгированных далеко красного красителя и коза анти мыши конъюгированных зеленый краситель антитела разбавленных 1:5, 000, 1:5, 000 и 1:2, 000, соответственно, в PBS-H-T/2% NGS). Инкубируйте на ночь.
    Примечание: на данный момент, инкубации может продлеваться на срок до трех суток при необходимости. Держите разделы, защищенном от света, завернув пластины в жестяной фольги во время этой incuшаг bation и впоследствии, как свет утоляет флуорофоров.

4. День 4: Монтаж в разделах

  1. мыть секции три раза в PBS-H для по крайней мере 20 мин
    Примечание: Если планирование течению иш 19, исправить разделы параформальдегида 4% за 1 час для обеспечения тетрамера и антител на месте, а затем вымыть разделы дважды с PBS-Ч 5 мин.
    Предупреждение: Параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
  2. Использовать кисть для передачи в разделах микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не толкать ткани слишком много. Покройте каждый раздел с глицерином/желатин содержит галлат н пропиловый 4 мг/мл или другой носитель монтажа, содержащий Флюорофор консерванта. Крышка с coverslip.
  3. Хранить слайды в контейнере свет защищенные слайд в -20 ° C. промойте пластины культуры ткани и удалить метки на крышки, с помощью спирта.
    Примечание: Пластины могут быть повторно использованы.

5. Приобретение Конфокальный микроскоп изображений

  1. захвата изображения с высоким разрешением с конфокального микроскопа, используя соответствующие лазеры и фильтры для каждого Флюорофор ( Рисунок 1A и B).
    Примечание: В этом примере конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов) был использован. Изображения были собраны с использованием 561 Нм лазер на 20% мощности для зеленовато желтые меченых антиген специфические Т-клетки, 488 нм лазер на 10% мощности для Грин меченых CD20-выражая B клеток и 640 Нм лазер на 15% мощность для далеко красной надписью CD8 Т-клеток. 20 X цель и числовая апертура 0,8 использовались.
  2. Последовательно собирать z серии на 3 мкм (или других) интервалы на трех каналах в нескольких полях 800 x 800 пикселей. Строительство монтаж собранных поля ( рис. 1 c -E). Имя каждого Фотомонтаж изображения, основываясь на информации соответствующего слайда и сохранить для анализа.
  3. Выполнять анализ количественных изображений с помощью программного обеспечения анализа и количественной оценки соответствующих Конфокальный микроскоп или ImageJ.

6. Количественный анализ изображений

Примечание: анализ количественных изображения может быть достигнуто с помощью программного обеспечения анализа и количественной оценки Конфокальный микроскоп или с помощью ImageJ программного обеспечения. Здесь, ImageJ был использован в качестве примера.

  1. Открыть в конфокальных фотомонтаж, перетащив его в ImageJ окно ( рисунок 2A).
    Примечание: ImageJ можно напрямую открыть фотомонтажи, собранные многих различных конфокальные микроскопы. Если монтаж не может быть открыт непосредственно ImageJ, экспортировать z сканирования как TIFF файл, чтобы открыть его
  2. Дублировать z сканирования, выбранного для анализа (" изображение "-> " дублировать ") ( рис. 2B).
  3. Разделить различные каналы (" изображение "-> " цвет "-> " разделить каналы ") ( рис. 2 c).
  4. Нарисовать ROI для количественного анализа в соответствующем канале быть объективными и добавить его к диспетчеру ROI, нажав " Т " на клавиатуре. Измерить площадь.
    Примечание: ROI менеджер ImageJ показывает область в мкм 2 ( Рисунок 2D).
  5. Флуоресценции улучшает яркость и контрастность канала для анализа (" изображение "-> " Настройка "-> " Яркость/контраст ") ( рис. 2е).
  6. Свести ROI на изображении (" ROI менеджер "-> " Flatten ") ( Рисунок 2F).
  7. Количественно оценить позитивные клетки в изображения с помощью " многоточечный " инструмент ( рис. 2 g).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 показывает как собирать конфокальный изображения с помощью конфокального микроскопа. Рисунок 2 демонстрирует анализ количественных изображений с помощью ImageJ. Рисунки 3 и 4 Показать представитель изображени?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

IST, в сочетании с IHC обеспечивает важным инструментом для обнаружения, характеризующие и количественного определения антиген специфические CD8 Т-клеток в родной среде других клеток и тканей структур с контекстом. Здесь мы описали подробные процедуры для IST, в сочетании с МГС, следуют анал...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения гранты от национальных институтов здравоохранения (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MHC-I monomerNIH tetramer core facilityMaterials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serumJackson Immunoresearch005-000-121
Low melt agarosePromegaV3121
HeparinSigma-AldrichSLBL6391V
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
UreaJ.T.Baker4204-05
Glycerol gelatinSigma-AldrichSLBH2672V
n-propyl gallateSigma-AldrichP3130
rat-a-h-CD8 (1:500)Acris0714Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)Vector6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000)Jackson Immunoresearch124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)Jackson Immunoresearch106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)Jackson Immunoresearch118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome: VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments, LLC1079
Quick Set Instant AdhesiveLoctite46551
24-well flat bottomed tissue culture platesFalcon353226
Microscope slideGlobe scienfitic Inc.#1321
Razor  bladeTed Pella, Inc121-6
Feather Disposable ScalpelFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.No. 21
Round paintbrush #2PRINCETON ART & BRUSH CO.4350RCan trim as needed with razor
Confocal MicroscopeOlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus

Ссылки

  1. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
  3. Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  4. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  5. Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
  6. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  7. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
  8. Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
  9. Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
  10. Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519(2014).
  11. Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679(2014).
  12. Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).
  13. Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
  14. Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
  15. Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).
  16. Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).
  17. Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
  18. Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
  19. Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561(2009).
  20. Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
  21. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  22. Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
  23. Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
  24. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

127situ ISTCD8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены