Реверсивные охлаждения индуцированной деактиваций учиться корковых вклад препятствие памяти в пешеходных Cat

Резюме

Сложные передвижения в натуралистическом сред, требующих тщательной координации конечностей включает регионы теменной коры. Следующий протокол описывает использование обратимых охлаждения индуцированной деактивации продемонстрировать роль теменной области 5 в памяти руководствуясь препятствием избежание в пешеходных cat.

Аннотация

На комплекс, натуралистический ландшафт сенсорной информации о экологические препятствия может использоваться для быстрой адаптации опорно движений для избежания. Например в Кот, визуальная информация о предстоящем препятствие может модулировать степпинг для избежания. Опорно-адаптация также может произойти независимо от видения, как внезапное тактильные вклад ногу препятствием ожидаемых может изменять шагая все четыре ноги для избежания. Такой комплекс опорно-двигательной координации включает в себя supraspinal структуры, такие как теменной коре. Этот протокол описывает использование обратимых, охлаждение индуцированной корковых деактивации оценить вклад теменной коре локомоции памяти руководствуясь препятствие в Кот. Маленькие охлаждения петли, известный как cryoloops, формируются специально для деактивации дискретных областей интереса для оценки их вклада в открытой поведение. Такие методы использовались для уточнения роли теменной области 5 в памяти руководствуясь препятствием избежание в Кот.

Введение

На натуралистических, неровной местности сенсорную информацию о препятствие, которое может быть приобретено через видение или touch, можно быстро изменить двигательный аппарат для избежания. Это тщательная координация шаговые движения включает в себя несколько корковых регионах^1,2. Например во время сложных опорно-задач, таких как препятствием избежание замешаны области моторной коры^3,4 и теменной коре^5,6,7 . В четвероногих животных шаг модуляции, необходимые для избежания препятствий должны распространяться на передних и задних конечностей. Если вперед локомоции задержка между foreleg и hindleg зазор препятствие (которые могут возникнуть как животное топчет тщательно через жертвой преследования сложных, натуралистических окружающей среды), информация о препятствие, сохранена в памяти используется для руководства hindleg, переступая через препятствие, однажды гуляя резюме.

Экспериментальные методы, направленные для отключения отдельных корковых областях может использоваться для изучения корковых вклад в памяти руководствуясь препятствие локомоции. Охлаждение индуцированной корковых деактивации обеспечивает обратимым, надежных и воспроизводимых метод оценки корковых вклад открытой поведение⁸. Cryoloops, сделанные из нержавеющей стали, трубы формируются специфичные для области коры интерес, обеспечивая весьма селективный и дискретные деактивация локусов. После имплантации, охлажденные метанола прокачивается через просвет cryoloop охлаждает область коры непосредственно под цикла < 20 ° C. Ниже этой критической температуры ингибируется синаптической передачи в регионе коры непосредственно под петлю. Такое отключение может быть отменено лишь путем прекращения потока метанола. Этот метод был использован для изучения корковых вклад сенсорной обработки и поведения^{9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17}, а также управления двигателем скачкообразных глаз движения¹⁸ и память руководствуясь препятствие локомоции¹⁹.

Целью настоящего Протокола является использование обратимых охлаждения индуцированной деактиваций для оценки участия париетальной корковых зон для опорно-двигательной координации в Кот. В частности память руководствуясь препятствие локомоции был рассмотрен с или без активного теменной коре. Эти методы были использованы для успешно демонстрирующих роль теменной области 5 в памяти руководствуясь препятствием избежание в пешеходных кошка¹⁹.

протокол

Все процедуры были проведены во исполнение национального исследовательского совета руководство для ухода и использования лабораторных животных (восьмое издание; 2011) и Канадский совет по животных уход Руководство по уходу и использование экспериментальных животных (1993) и были одобрен университета Западного Онтарио животных использования Подкомитет Совета университета по лечению животных.

Следующая процедура может применяться для экспериментов, изучая корковых вклад опорно-двигательного аппарата управления в пешеходных cat.

1. аппарат

1. Постройте аппарат используется для оценки препятствий памяти.
   Примечание: Аппарат состоит из 2,43 м длиной, 29 см широкий аллеи окружена высокой акриловый стены 18 см (рис. 1). Узкие слот на полпути вдоль аппарат позволяет 25,8 см широкий x 3 мм толщиной препятствием для быть подняты на или удалены из дорожки с помощью рычага, монтируется под ходьбу.
2. Чтобы сохранить внимание животного на еде, Избегайте использования руку для поднятия или опускания препятствие. Вместо этого препятствие можно поднимать или опускать, используя экспериментатора ногу рычаг под дорожкой, позволяя экспериментатор продолжать кормление животного.
3. Должным образом поддерживать рычажная система для обеспечения что препятствие можно поднимать или опускать шепнул.
4. Использовать маленькие повышенных платформа (23 см длиной x 23 cm широкий x 16 см высотой) после которой мягкую пищу помещается, руководство движения животного.
5. Запишите все испытания с использованием ethernet камеры (54 кадров/сек), установленной на штатив 1.85 m дорожки от средней линии.

2. Подготовка процедуры

Примечание: Для успешного сбора, период обучения, предшествующих поведенческого тестирования гарантирует, что каждое животное должным образом приспособиться к тестирования номер и аппарат. Многократное воздействие Роман окружающей среды будет помощь в сокращении поразительные или другие стрессовые поведения.  Адаптационного может варьироваться между животными и может потребовать 1-2 месяца обучения. Первоначальный адаптационного сессий может быть до 5 минут в длину в зависимости от направленности и мотивация животного есть. Последующих сессиях должны стремиться к увеличению продолжительности времени, которое животное является мотивирован, чтобы работать (обычно около 20-25 мин).

1. Приобрести Зрелые (> 6 месяцев) внутренних коротких волос кошки заводчик коммерческой лаборатории любого веса или пола.
   Примечание: Мотивация к работе для производства продовольствия и совместной дислокации составляют критерии отбора, при рассмотрении которых животные должны быть включены в исследование.
2. Акклиматизироваться каждое животное, чтобы носить ремень безопасности, к которому прилагается поводок длиной 1 м. Якорь поводке на полке над дорожкой через середину дорожки.
   Примечание: Это позволяет животное, чтобы ходить вдоль центральной части аппарата без какой-либо напряженности, способствуя тем самым животное, чтобы оставаться в рамках этой части аппарата. Создание таких границ полезен для работы с движущейся испытуемого.
3. Поместите животное на дорожки, позволяя ему поесть от платформы, на которой размещается мягкую пищу.
   Примечание: Одна из целей этой начальной подготовки заключается в обеспечении, что животное легко следующим питание платформы при перемещении вперед и можно спокойно ходить с упряжь и свора. Использование мягкой пищи в качестве позитивного армирование поощряет животное, чтобы сосредоточиться на протяжении каждой сессии обучения или тестирования и способствует комфортную рабочую среду.
4. Убедитесь, что животное комфортно с обработкой, включая случаи, когда животное должны быть перемещены в начало области дорожки.

3. Поведенческие обучение и протокол испытания

Примечание: Препятствие памяти оценивается в двух парадигм: визуально зависимых препятствие памяти задачи, а задачи памяти зависящих от тактильных препятствие. Во время начальной подготовки и последующего тестирования следует использовать обе парадигмы.

1. Визуальные препятствие памяти
   1. Чтобы оценить памяти визуального препятствие, поднимите препятствие на дорожки (рисунок 2A). Место платформы на дальней стороне препятствие. Поместите животное в районе начала дорожки.
   2. Разрешить животное подход пищи, переступая через препятствие с только его передними ногами для того, чтобы съесть от платформы.
   3. Как животное продолжает питаться, ниже препятствие, таким образом, что она становится вровень с дорожкой для предотвращения любого дальнейшего зрительной или тактильной входов.
   4. После периода переменной задержки перемещения препровождает еда снова призвать животное, чтобы возобновить ходить; Эта задержка может быть меньше, чем 1 s свыше 2 мин.
   5. Важно отметить, что выполните испытания, где отсутствует препятствие препятствие и разработки уроков избежания ответа во избежание привыкания. В таких визуальных препятствие отсутствие испытаний убедитесь, что препятствие не возникает на дорожки до размещения животных в области начало дорожки.
   6. Соблюдайте hindleg, шагая в препятствие настоящее и препятствие отсутствие испытаний для проверки типичный двигательного поведения и нетронутыми визуальные препятствие памяти до охлаждения. Убедитесь, что животное может очистить препятствия без контакта, и что шагать все четыре ноги значительно поднимается в испытаниях препятствие-по настоящее время.
      Примечание: Смотреть видео обучение судебных процессов может помочь в этой проверки.
2. Тактильные препятствие памяти
   1. Чтобы оценить тактильные препятствие памяти, убедитесь, что препятствие не возникает на дорожки до размещения животных в области начало дорожки (Рисунок 2Б).
   2. Разрешить животное ходить к платформе пищи, на той стороне слот препятствие.
   3. Как животное ест, поднимите препятствие на дорожки под блюдо еда, предотвращая любой визуальный ввод препятствие.
   4. Как пища перемещается вперед, обратите внимание, что животное должно связаться препятствие с их передние конечности до шагая над ним.
   5. Разрешить животное продолжать еды во время трансграничных препятствие между их план - и задних конечностей. В это время ниже препятствие, так что он становится вровень с дорожкой для предотвращения любого дальнейшего зрительной или тактильной входов.
   6. После периода переменной задержки переместите препровождает еда еще раз призвать животное, чтобы возобновить ходить.
   7. Главное, выполнить испытания, где отсутствует препятствие и для предотвращения привыкания к препятствие и разработки уроков избежания ответа происходит не foreleg контакт.
      1. В эти тактильные препятствие отсутствие судебных разбирательств у животных подход и съесть от платформы продуктов питания, как описано в шаге 3.2.1. Однако поднимать и опускать препятствие (шаг 3.2.2) прежде чем двигаться вперед еда в шаге 3.2.3. Убедитесь, что аналогичный период задержки, где животное разрешается продолжить еды (шаг 3.2.4) предшествует окончательное продолжение локомоции (шаг 3.2.5).
   8. Наблюдать за hindleg, шагая в настоящее время препятствием и препятствие отсутствие испытания для проверки нормального двигательного поведения и нетронутыми визуальные препятствие памяти до охлаждения.

4. видео анализ

Примечание: Для оценки препятствий памяти, анализы во время начальной подготовки и последующего тестирования после охлаждения цикла имплантации включают количественное определение высоты пика шаг, шаг распродажа и расстояние по горизонтали между ног и препятствие на пике каждого шага для визуальные и тактильные парадигмы (рис. 2 c).

1. Анализ видео с помощью пользовательских написанные скрипты.
2. Для каждого судебного разбирательства отслеживать каждую ногу, пометив положение ног ближе к камере на протяжении каждого этапа.
3. Измерьте высоту шаг пик как перпендикулярное расстояние между ног и поверхности дорожки на самой высокой точке траектории каждый шаг (рис. 2 c).
4. В настоящее время препятствием испытаниях измерьте зазор шаг как шаг высота непосредственно над препятствием слот, вычитанным Высота препятствий.
5. Кроме того Измерьте расстояние по горизонтали между ног и препятствие на пике каждого шага в испытаниях препятствие-по настоящее время.
6. Убедитесь, что возможности памяти препятствие нетронутыми до охлаждения цикла имплантации, проверяя, что пик шаг высота возводится в препятствие-настоящее время испытаний по сравнению с шагая в препятствие отсутствие судебных разбирательств.

5. охлаждение имплантации цикла (Cryoloop)

1. На двустороннем уровне имплантата cryoloops над районами 5 и 7 согласно сообщалось ранее хирургических процедур⁸ (рис. 3).
2. Короче говоря для каждого полушария, выполните краниотомии и durotomy Хорсли-Кларк координаты²⁰ A15 A25 подвергать этапе ansate и боковой борозды.
3. Положение отдельных охлаждения петли, фасонные из подкожного трубки из нержавеющей стали 23-го калибра с цикла в непосредственный контакт с поверхностью коры теменной области 5 или 7.
4. Закрепите основание каждого cryoloop к черепу Стоматологическая акрил, закреплены винтами из нержавеющей стали.
5. Закройте craniotomies с дополнительной стоматологической акрил; оформить края кожи до акриловая кромки и шовный материал вместе.

6. корковые охлаждения протокол

1. Экспериментальные установки
   Примечание: Прежде чем чего животное в комнату, тестирования, подготовлен и испытаны охлаждения. Контур охлаждения состоит из метанола водохранилища с впускную трубку (3,2 мм диаметр, 1,6 мм в.д.), поршневой насос поршневой и ванна сухого льда, подключенных через политетрафторэтилена трубки (1.6 мм O.D., 0.5 мм и.д.; Рисунок 4). Кроме того необходим цифровой термометр.
   1. Добавьте сухой лед 500 cc 200 мл метанола в ледяной бане. Концы подходят трубы плотно на входе и выходе Макетные cryoloop чтобы завершить контур охлаждения.
   2. Присоедините вилку термопары к цифровой термометр для непрерывного мониторинга состоит из двух мужчин термопара разъемы и термопара проволоки кабелю температуры. Убедитесь, что длина кабеля достаточно, чтобы достичь головы животного, когда один конец подключен к термометр.
   3. Включите насос поршневой, с помощью переключателя.
      Примечание: Метанол должен быть составлен из водохранилища, прошли через насос для ванны сухого льда, где течет метанола в трубке будет охлаждаться до-75 ° C. Охлажденные метанола будет затем выйти из ледяной ванне и запустить через прилагаемый cryoloop до возвращения в водохранилище метанола.
   4. Убедитесь, что установка насоса, длина труб в ледяной ванне и длина шланга от ледяной ванне Макетные петли являются оптимальными, таким образом, что Макетные cryoloop температура может достигать стабильного состояния около -5.0 ° C.
      Примечание: Такой температуры, достигнутые в ходе этой начальной установки часто являются достаточными для достижения температуры теста 3.0 ± 1,0 ° C, когда та же система используется для охлаждения имплантированных cryoloop. Трудности в достижении достаточного охлаждения может быть решена, регулируя скорость насоса, увеличение длины трубы, погруженной в ледяной ванне, и/или минимизации длины труб от ледяной ванне cryoloop.
   5. При необходимости, удлинить секции труб, резьбы к концу трубки через штуцер конец трубки и фланец конце трубки с инструментом отбортовки. Прикрепите трубы нужной длины с аналогичным образом фланцевый конец с помощью разъема.
   6. Убедитесь, что все соединения плотно и отсутствие утечек присутствуют. После того как удовлетворены первоначальной настройки, выключите насос и удалять Макетные cryoloop; цепь теперь готов для тестирования животного.
2. Поведенческое тестирование
   1. Поместите животное на тестирование аппарат. Слайд ремень над головой и закрепите ремень ожидающий вокруг животного. Прикрепите поводок.
   2. Снимите защитный колпачок имплантированных cryoloop подвергать впускных и выпускных труб. Fit труб заканчивается плотно на входе и выходе трубы cryoloop. Подключите термопары к цифровой термометр.
   3. Начало сессии тестирования с помощью visual (шаг 3.1) или тактильные (шаг 3.2) препятствие памяти суда. Следуйте с дополнительные испытания всех четырех типов (визуальные препятствие-по настоящее время, визуальные препятствие отсутствие, тактильные препятствие-по настоящее время, тактильные препятствие-отсутствует) случайным образом.
      Примечание: Типичный сеанс тестирования состоит из блока «теплый» судебных разбирательств, где память руководствуясь препятствием избежание наблюдается в отсутствие охлаждения для установления базовых мер.
   4. Включите насос поршневой и ждать cryoloop до температуры 3.0 ± 1,0 ° C (1-2 мин). Затем запустите «cool» блок испытания после включении поршневой насос. В ходе этого блока испытаний при необходимости, оценки вклада охлаждением области памяти гидом. Убедитесь, что температура cryoloop поддерживается на 3.0 ± 1,0 ° C на протяжении всего блока.
      Примечание: Все четыре суда типа должны быть случайно interspersed во всем блоке.
   5. Запустить последний блок «согревать» испытаний после выключения поршневой насос, и cryoloop вернулся в его оригинальной температуры.
      Примечание: Базовый степпинга поведение воссоздан во время этого блока. Опять же все четыре суда типа должны быть случайно interspersed во всем блоке.
3. Очистка
   1. По завершении поведенческое тестирование удалите трубки из впускных и выпускных труб. Быть сознательным остаточного метанола, который может капать из трубы концы и может раздражать животного.
   2. Убедитесь, что защитный колпачок заменяется. Удаление упряжь и Свора до возвращения животного в колонии. Обрежьте концы труб (3-4 мм) используя труборез для предотвращения Дырявый соединения на следующий день тестирования.

7. Проверка степени охлаждения

1. В конце поведенческое тестирование подтверждают, что степень деактивации ограничен для региона коры непосредственно под каждый cryoloop с помощью сообщалось ранее методы⁸.
   Примечание: Это может быть проверен с термоклина сопоставления¹² или тепловой тепловизионные камеры^13,14,19.

Результаты

Этот протокол успешно использовался для изучения теменной коре вклад препятствие памяти в пешеходных кошка¹⁹. В этом исследовании, cryoloops были имплантированы на двусторонней основе над теменной области 5 и 7 в трех взрослых (> 6 месяцев) кошки (Рису...

Обсуждение

Описывается парадигма использует охлаждения индуцированной деактиваций дискретных корковых областей с помощью cryoloop с целью изучения памяти руководствуясь препятствие передвижения в Кот. Визуальные и тактильные препятствие памяти парадигмы достаточно просты для животных для выпол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a