JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем технологии чипа оснастку для выполнения иммуноанализа кросс-reactivity-бесплатный мультиплексированных сэндвич, просто щелкая два слайда. Оснастки аппарат используется для надежной передачи реагентов от microarray дна microarray. Оснастки чип может использоваться для любых биохимических реакций, требующих colocalization различных реагентов без перекрестного загрязнения.

Аннотация

Мультиплексированных белка анализ показал Улучшенный диагностической чувствительностью и точностью по сравнению с одной белки. Microarrays антитела позволяют тысячи микро масштабе иммуноанализа выполняется одновременно на одном чипе. Сэндвич пробирного формат улучшает пробирного специфичность обнаружения каждой мишени с двумя антител, но страдает от перекрестной реактивности между реагентов, тем самым ограничивая их возможности мультиплексирования. Colocalization microarray антитела (ACM) был разработан для обнаружения кросс-reactivity-бесплатный мультиплексированных белка, но требует дорогостоящих корректировщик на месте для изготовления microarray дна во время анализов. В этой работе мы демонстрируем оснастки технологии чипа, который передает реагент от microarray дна microarray, просто щелкая две фишки вместе, таким образом не корректировщик требуется во время инкубации образца и последующего применения обнаружения антител (мазки) после Хранение предварительно пятнистый слайды, отделения подготовки слайдов от выполнения анализа. Оба одноместные и двухместные передачи методы представлены для достижения точного выравнивания между двумя microarrays и описаны изготовление слайд для обоих методов. Результаты показывают, что < был достигнут 40 мкм выравнивание с двойной передачей, достигнув массива плотность 625 пятна/см2. 50-plexed иммуноанализа была проведена продемонстрировать удобство использования оснастки чип в мультиплексированном белка анализа. Пределы обнаружения 35 белков находятся в диапазоне пг/мл.

Введение

Группа состоит из нескольких белки biomarkers может обеспечить более высокой чувствительностью и специфичностью чем один биомаркеров в диагностике сложных заболеваний, как рак1,2. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) был золотой стандарт технологии, используемые в клинических лабораториях, достижение предела обнаружения на низких пг/мл в плазме, но пределы одной цели в Пробирной3,4,5. Microarrays антитела были разработаны для размещения тысячи миниатюрных анализы проведены параллельно на один Микроскоп слайд6,,78. Однако мультиплексирования возможности этого метода ограничено реагент driven перекрестной реактивности, вытекающих из применения смеси мазками, и она становится более проблематичным с учетом увеличения числа целевых показателей9,10 , 11. пла и др. заявили, что результирующий уязвимость мультиплекс сэндвич пробирного весы как 4N(N-1), где N — это количество целей12.

Чтобы смягчить перекрестной реактивности в microarrays антитела, colocalization microarray антитела (ACM) был разработан в нашей лаборатории для мультиплекс сэндвич пробирного12. На подложке с корректировщик microarray дна запятнаны захвата антител (кабины). После блокировки образцы применяются на поверхности, а затем отдельные мазки были замечены на же пятна с комплексом кабины антигена. Все сценарии перекрестной реактивности между антитела и антигены могут быть уменьшены с ACM, и были достигнуты пределы обнаружения в ПГ/мл. Однако протокол assay требует подготовки и кровянистые выделения мазками в ходе экспериментов с использованием корректировщик на месте microarray с высокой точностью для выравнивания цели, которая является дорогостоящим и трудоемким, ограничивающие широкое применение этой технологии в другие лаборатории. Портативных ACM, с именем оснастки чип был разработан для кросс-reactivity-бесплатно и бесплатно корректировщик мультиплекс сэндвич иммуноанализа13,14,15. Кабины и мазками предварительно заметили на слайд пробирного и передача слайд соответственно в формате microarray и хранятся. В ходе анализа слайды извлекаются и microarray мазками коллективно передаются на пробирного слайд, просто сдвинув две фишки вместе. Оснастки аппарат используется для передачи надежной реагента. Нитроцеллюлоза покрытием слайды с емкостью привязки относительно большой антитела были использованы в качестве пробирного слайды для поглощения жидких капель и таким образом содействия передаче реагента, однако, слайды дороже, чем обычные стекла слайды и microarray сканеры совместимы с непрозрачными слайды необходимы для приобретения сигнала.

В этой работе мы демонстрируем протокол выполнения мультиплекс сэндвич иммуноанализа с чипом оснастки. Роман оснастки аппарат был разработан для более удобной и надежной передачи реагент от microarray дна microarray. Важно отметить, что здесь мы создали метод передачи реагентов на обычные стекла слайды с чипом оснастки. 1024 пятна были успешно переведены и выровнены на стекло слайд, значительно расширить использование этой технологии в большинстве лабораторий.

протокол

1. Изготовление и хранение оснастки микросхемы

  1. один метод ( Рисунок 1a)
    1. пятно кабины растворы, содержащие 400 мкг/мл антител и 20% глицерина в фосфат амортизированное saline (PBS) на нитроцеллюлозную (или функционализированных стекла) пробирного слайд с струйных корректировщик microarray 13 при относительной влажности воздуха 60% (1.2 nL для каждого пятна) с 800 мкм-центр интервал. Убедитесь, что слайд фиксируется на палубе корректировщик согласно один угол (здесь, был использован в нижнем левом углу).
    2. Инкубировать пятнистый пробирного слайд при комнатной температуре за 1 час с относительной влажности 60%.
    3. Зажим модуль прокладка слайд с 16 отсеков на слайде пробирного разделить его на 16 скважин. Промойте слайд три раза путем добавления 80 мкл PBS, содержащие 0,1% Tween-20 (PBST) в каждый хорошо и тряски при 450 об/мин на шейкер, 5 мин каждый раз,.
    4. Добавить 80 мкл блокирования решения для каждой хорошо и трясти за 1 ч при 450 об/мин.
    5. Удаление прокладки и сухой пробирного слайд с потоком азота.
    6. Исправить передачи слайдов на палубе корректировщик и нажмите в левом нижнем углу слайда с нижнем левом углу корректировщик палубы. Струйный пятно массив меток выравнивания (решение микро шарики полистироля) с тот же макет, что и для кабин.
    7. Пусть сухой меток выравнивания. Флип передачи слайдов и положил его обратно на палубу корректировщик, фиксации против в нижнем левом углу.
    8. Подготовить dAb кровянистые выделения растворов, содержащих 20 мкг/мл антител, 20% глицерина и 1% BSA.
    9. С использованием корректировщик ' s камеры, возьмите картину Марк выравнивания. Реализовать эту картину в пятнистость программу как доверительное и получить изображения распознавания системы струйных корректировщик для выявления наиболее верхний левый Марк. Используйте свои координаты как первое место тыкать массива. Место 8 nL за капли с центр центр расстояние 800 мкм.
  2. Метод двойной передачи ( рис. 1b)
    1. место передачи слайд 1 на палубе корректировщик струйный против в нижнем левом углу. Найди кабины растворы, содержащие 400 мкг/мл антител, 20% глицерина и 1% BSA в PBS на слайд с струйных microarray корректировщик при относительной влажности воздуха 60% (0,4 nL для каждого пятна и ~ 200 мкм в диаметре). Центр центр расстояние составляет 400 µm.
    2. Оснастки передачи с нитроцеллюлоза покрытием (или функционализированных стекла) пробирного слайда с помощью оснастки аппарат ( рис. 2) для передачи кабины капельки на пробирного слайд.
      1. Повернуть все шесть кнопок на стороне аппарата оснастки на 90 градусов, чтобы вытащить и заблокировать все поршни в открытом положении. Вставьте слайд передачи в слайд держатель в его сосуд с обрезанный угол, сталкивается с фиксированной ПОГО ПИН. Включите первый набор из трех кнопок освободить поршни с золотой ПОГО PIN-код и убедитесь, что слайды толкнул направляющие контакты.
      2. Вставить слайд нитроцеллюлозы покрытием в аппарат сидит вверх вниз оснастки на 4 контактов pogo. Поверните второй набор из трех кнопок освободить поршни с серебряной PIN-код и убедитесь, что слайды толкнул направляющие контакты.
      3. Закройте оснастку аппарат, поместив верхней оболочки на держателе слайдов с помощью выравнивания столбов и отверстия для точного позиционирования.
      4. Вставить аппарат закрытым оснастки в своей клетке и задвиньте закрытия вкладки довести microarrays лицом к лицу при применении соответствующего давления. Держать закрытыми за 1 мин
    3. Отдельные слайды. Инкубируйте пробирного слайд при комнатной температуре за 1 час с относительной влажности 60%. Вымойте, блокировать и сухой пробирного слайд, как описано в шагах 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Место другой передачи слайдов на струйных корректировщик палубы и упираются в нижнем левом углу. Пятно тыкать растворы, содержащие 50 или 100 мкг/мл антител (см. таблицу 1), 20% глицерина и 1% BSA в PBS. Убедитесь, что каждое пятно 0,8 nL и центр центр расстояние между пятна-400 мкм.
    5. Магазин пробирного и передача слайд. Уплотнение пробирного и передачи слайды в герметичной сумке с сиккативом и положить в морозильник-20 ° С.

2. Мультиплексированных иммуноанализа с оснастки чипов

  1. получить пробирного слайд из морозильной камеры. Оставьте мешок, опечатали за 30 мин до тех пор, пока слайд доходит до комнатной температуры.
  2. Подготовка 7-точка серийный разбавлена пики белков в PBS, содержащие 0,05% примеры решений Tween-20.
    Примечание: Здесь используется коэффициент разрежения 5 раз. В таблице 1 перечислены начальной концентрации для каждого белка.
  3. Подготовка образца решения в случае необходимости. Например, разбавить человеческой сыворотки 4 раза в буфер PBST.
  4. Хомут 16-купе прокладка на слайде пробирного.
  5. Заполнить один столбец 8 скважин с решениями 7 белка разрежения и белка бесплатная PBST буферный раствор, закупорить. Пипетка примеры решений в других 8 скважин на тот же слайд.
    Примечание: 80 мкл решения может поместиться в каждом хорошо. Более слайдов может использоваться для измерения дополнительных образцов при необходимости.
  6. Проинкубируйте образцы на шейкер при 450 об/мин за 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. мыть слайд три раза с PBST на шейкер при 450 об/мин, 5 мин каждый раз. Удалите прокладку и сухой слайд под струей газа азота.
  7. Получить передачи слайд с мазками из морозильной камеры. Держите сумку, запечатаны в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем, инкубировать слайд в закрытой камере (например, бокс пустые советы), содержащие 60% влажности стабилизации Бусины для 20 мин для регидратации.
  8. Оснастки передачи слайд с Пробирной слайд с помощью оснастки аппарат ( рис. 2) для передачи тыкать капельки. Смотрите раздел 1.2.2 для функционирования аппарата оснастки.
  9. Отдельные слайды. Инкубировать пробирного слайд в закрытой камере, содержащие 60% влажности стабилизации Бусины для 1 h. зажим пробирного слайд с прокладкой 16-купе и промойте слайд 4 раза с помощью PBST на шейкер при 450 об/мин, 5 мин каждый раз,.
  10. Пипетку 80 мкл растворы, содержащие 2,5 мкг/мл стрептавидина Флюорофор в PBS в каждой скважине. Проинкубируйте втечение 20 мин на шейкер при 450 об/мин.
  11. Промыть слайд 3 раза с PBST и один раз с дистиллированной водой в шейкер при 450 об/мин. Удалите прокладку и сухой слайдов, используя газ азот.

3. Слайд-сканирование и анализ данных

  1. Сканировать пробирного слайд с флуоресцентным microarray программы, используя Лазер 635 нм.
  2. Экстракт чистой интенсивности в каждом месте, с помощью анализа программного обеспечения (например, массив про анализатор) 16.
  3. Рассчитать предел обнаружения (LOD) каждого белка, с помощью программного обеспечения статистики и определения концентрации белка в пробах.
    Примечание: Лод определяется как Y-пересечение стандарта cuувеличивается в три раза стандартное отклонение трех независимых анализов RVE.

Результаты

Пробирного процедура для одно- и двухместные методы передачи показан на рисунке 1. В одной передаче кабины запятнаны прямо на слайде пробирного и мазками передаются на пробирного слайд после использования в шаблоне зеркало кабины (рис. 1a

Обсуждение

В этой работе мы представили оснастки чип технологии, что делает кросс-reactivity-бесплатный мультиплекс иммуноанализа широко доступны для исследователей с основные экспериментальной установки. В отличие от существующих microarrays антитела, не microarray корректировщик необходим для конечных пол?...

Раскрытие информации

Университет Макгилла подал заявку на патент на некоторые аспекты этой работы с ли Huiyan и Дэвид Juncker как изобретатели.

Благодарности

Мы благодарим д-р Роб Сладек за использование струйных корректировщик. Мы отмечаем окончательное поддержки от канадской институтов для медицинских исследований (КНИИЗ), естественные науки и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ), Канадский научно-исследовательский институт рака общества и Канадский фонд для инноваций (CFI). D.J. Спасибо поддержки от Канада исследований кафедры.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline tabletFisher Scientific5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5Rocklands000-06
Tween-20Sigma-Aldrichp1379
Bovine serum albuminJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc001-000-162
GlycerolSigma-AldrichG5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray StabilizerSurModics, IncSG02
Nitrocellulose coated slidesGrace Bio-Laboratories, Inc305116
Aminosilane coated slidesSchott North America1064875
Snap DeviceParallex BioAssays Inc.PBA-SD01
Inkjet microarray spotterGeSiMNanoplotter 2.0
Slide module gasketGrace Bio-Laboratories, Inc204862
Humidity Stabilization BeadsParallex BioAssays Inc.PBA-HU60
Array-Pro Analyzer softwareMedia CyberneticsVersion 4.5
Fluorescence microarray scannerAgilentSureScan Microarray Scanner
Biostatistics softwareGraphPad SoftwareGraphPad Prism 6
Endoglin capture antibodyR&D SystemsMAB10972
Endoglin proteinR&D Systems1097-EN
Endoglin detection antibodyR&D SystemsBAF1097
IL-6a (see Table 1)R&D Systems
IL-6b (see Table 1)Invitrogen

Ссылки

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129immunoassaysreactivity

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены