JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Олигодендроциты Myelinating способствуют быстрое действие потенциал распространения и выживаемость нейронов. Описанные здесь — это протокол для выражения конкретных Олигодендроциты флуоресцентных белков в organotypic срезы мозга с последующим покадровой изображений. Кроме того представлена простая процедура для визуализации неокрашенных миелина.

Аннотация

Нейроны полагаться на электроизоляции и трофические поддержки myelinating олигодендроциты. Несмотря на важность Олигодендроциты дополнительные инструменты в настоящее время используется для изучения нейронов, лишь частично были приняты исследователями олигодендроциты. Ячейка пятнать вирусный трансдукции конкретного типа является полезным подходом для изучения динамики живых органеллы. Этот документ описывает протокол для визуализации Олигодендроциты митохондрий в срезах головного мозга organotypic, трансдукция с аденоассоциированный вирус (AAV) гены для митохондриального целевых флуоресцентных белков под контролем транскрипционный анализ Промоутер основной белок миелина. Она включает в себя протокол для изготовления organotypic корональных мыши мозга ломтиками. Ниже представлена процедура затем time-lapse изображений митохондрий. Эти методы могут быть переданы в другие органеллы и могут быть особенно полезными для изучения органеллы в Миелиновые оболочки. Наконец мы описывают метод легко доступны для визуализации неокрашенных миелина в живых фрагментов, конфокальная отражения микроскопии (ядро). Ядро не требует дополнительного оборудования и может быть полезно для идентификации Миелиновые оболочки во время живых изображений.

Введение

Белого вещества мозга состоит из аксонов нервных клеток, завернутые в миелина, специализированные расширенной плазматической мембраны, образованный олигодендроциты. Миелина необходима для быстрого и надежного действия потенциал распространения и долгосрочное выживание Миелинизированные аксонов, и потеря миелин может вызвать неврологической дисфункции. Несмотря на их важность свойства Олигодендроциты менее известные сравниваются с нейронов и астроциты. Следовательно меньше инструменты были разработаны для изучения олигодендроциты.

Живут изображений Органеллы клетки, такие как митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ER) или различные везикулярного структуры может быть полезным для изучения динамических изменений в органеллы с течением времени. Традиционно изображения живых Олигодендроциты была выполнена в монокультур1,2. Однако Олигодендроциты в монокультуре не отображаются компактные миелина, и кусочки острый мозга или organotypic таким образом, может быть лучшим вариантом, при изучении движения органелл и локализации. Локализация небольших органеллы и белков в Миелиновые оболочки может быть сложным из-за короткого расстояния между Миелинизированные Аксон и окружающие Миелиновые оболочки. Таким образом только свет микроскопические иммуноокрашивания процедуры не имеют пространственное разрешение для различения органеллы в Миелиновые оболочки и те в Миелинизированные аксон. Это может быть решена путем вирусного трансдукция с генами органеллы целевой флуоресцентных белков, движимый промоутеров определенного типа клеток. Преимущества являются клетки конкретные и разреженные выражение, которое дает возможность точной оценки органеллы локализации и динамики. Трансгенные животные могут также использоваться для достижения таких целевых Органеллы клетки конкретных выражение3. Однако производство и обслуживание трансгенных животных дорого и обычно не предлагают разреженные выражение, которое может быть достигнуто путем вирусных методов.

Метод, описанный здесь использует вирусные трансдукции Олигодендроциты с таргетингом на митохондриальной флуоресцентных белков (dsred или Зеленый флуоресцирующий белок, GFP) обусловлен промоутер основного белка миелина (MBP-mito-dsred или MBP-mito-GFP) для визуализации Олигодендроциты митохондрий в organotypic срезы мозга. Кроме того выражение другого флуоресцирующего белка в цитоплазме (GFP, используемые вместе с mito-dsred или tdtomato, используемые с mito-GFP) используется для визуализации морфологии клеток, включая цитоплазматических отсеков Миелиновые оболочки. Протокол включает в себя процедуры для приготовления organotypic срезы мозга (модифицированная версия протокола, описанный De Simoni и Юй, 20064,5). Мы затем описать покадровой изображений процедуры для изучения митохондриальной движения. Эта процедура использует вертикально Конфокальный микроскоп с непрерывный обмен изображений среднего, установки, что позволяет легко применение наркотиков или других средних изменений во время визуализации. Промежуток времени визуализации процедура может быть выполнена на любой конфокального микроскопа, с некоторым дополнительным оборудованием для поддержания жизни ломтиками, как описано ниже. Протокол также содержит несколько советов для оптимизации изображений и уменьшить Фототоксичность.

И наконец описан простой и быстрый способ визуализировать неокрашенных миелина, конфокальная отражения микроскопии (ядро). Это может быть полезно для идентификации Миелиновые оболочки во время живых изображений. В последние годы несколько методов были разработаны для миелина изображения без каких-либо окрашивание требуется, но большинство из них требуют определенного оборудования и специалистов6,7,8. Процедуру, описанную здесь используется отражательные свойства Миелиновые оболочки и версия упрощенный сингл возбуждения волны спектральных характеристик Confocal микроскопии (оценка, в которых некоторые лазерные длин волн объединяются, чтобы визуализировать миелина) 9. ядро может быть сделано на любой Конфокальный микроскоп имеющий 488 нм лазер и 470-500 Нм полосовой выбросов или выбросов перестраиваемый фильтр.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

описанные здесь процедуры были одобрены Норвежский орган исследования животных. Поставщики и Каталог номеров для расходных материалов и других необходимых оборудование доступны в списке материалов в конце документа.

1. Подготовка Organotypic ломтиками

Примечание: этот рецепт использует две мыши щенков на послеродовой день 7-9 (p7-9), которые дают 24 organotypic ломтиками, разделены на два шесть ну культуры блюда. Если не указано иное, все процедуры должно быть сделано в стерильных капот и nitril или латексные перчатки должны быть использованы. Должны использоваться только клетки культуры класс ингредиенты.

  1. Бутылки автоклав, рассечение инструменты (1 большой ножницами, 1 небольшой ножницами, 1 большой плоский шпатель, 1 небольшие округлые и заточенные шпателем и 1 щипцы, смотрите материалы список для деталей), стеклянные пипетки, наконечники и салфетки ткани, используется для подготовки фрагмента.
  2. Как половина из стеклянной пипетки следует использовать с большим открытием, разорвать узкий конец.
    1. Оценка с алмазной Чертилка ручка (если доступно) вокруг пипеткой чуть ниже точки, где стекло начинает сужения. Затем поместите заостренный конец пипеткой в нитриловые перчатки или аналогичный. Тщательно отломить кончик, сгибая пипеткой прижимая его против верстаке.
    2. Затем тупой конец сломанной, потерев на куске наждачной бумаги или расплава незначительно на горелки Бунзена. Сломанной пипетки используются для передачи вырезать мозг ломтики с конца сломанной, превратился в резиновую грушу и большой открытый конец, касаясь решения/ломтики.
      Примечание: Это делается не в стерильных капот и может быть сделано несколько дней, в.
  3. Готовят блюда культуры.
    Примечание: Это может быть сделано в день до нарезки или по крайней мере за 2 часа до нарезки.
    1. Стерилизовать политетрафторэтилена (ПТФЭ) мембраны (" конфетти "). Используйте два стерильный пинцет для удаления одного конфетти из окружающих синий пластиковых частей и стерилизации путем погружения дважды в чашку Петри, содержащий 96% этанола (EtOH). Затем заложить конфетти квартиру в стерильных большой Петри сушиться.
      Примечание: Конфетти, гидрофильные мембраны из PTFE, похож на мембраны в культуре вставок. Использование конфетти СПИД живут изображений, потому что одного ломтика может легко передаваться от вставки Микроскоп установки, подняв конфетти пинцетом (4,8 см. Подробнее). Кроме того срезы мозга может выращиваются без конфетти, (в котором срезы будет прикрепить непосредственно к мембране Вставка культуры). В этом случае вставка мембраны должны быть срезаны с помощью скальпеля для передачи фрагмента в Микроскоп ванну.
    2. Добавляют 1 мл питательной среды (рецепт в реагентов ' таблица) к каждой скважины шести ну культуры блюд.
      3. В каждой скважины с использованием стерильный пинцет вставить
    3. место одной культуры. Избежать воздушных пузырей между insert и культуры среднего.
      Примечание: Чтобы сэкономить деньги и окружающей среды, это возможно для повторного использования вставок культуры. Это может быть сделано путем тщательной промывки в дистиллированной H 2 O (dH 2 O) следуют инкубации в 70% EtOH минимум 24 ч до повторного использования. При подготовке новой культуры, сухие вставок в пластине культуры клеток под ультрафиолетового (УФ) света на 15-30 мин
      4. Вставки
    4. два (стерилизованные и сухой) конфетти на каждой культуры. Место конфетти к краям вставок для получения минимального дублирования.
    5. Поместить пластины в инкубатор культуры клеток при 37 ° C с 5% CO 2.
  4. Средний холодный рассечение пузырь (рецепт в реагентов ' таблица) четырёхокись газом (95% O 2 /5%CO 2). Чтобы раствор стерильный, подключить трубку от газового баллона к фильтру стерильный шприц (размером пор 0,22 мкм). Фильтр
    1. пара на другом конце шприца в стерильную пробирку подключен к стерильной стеклянной пипетки. Место стеклянной пипетки в растворе, накрыть парафина и поверните на газ. Держите средний рассечение на ice.
  5. Подготовить области рассечение/нарезка.
    Примечание: В идеале, эта процедура должна быть выполнена в стерильных Худ. Если это не представляется возможным, vibratome можно оставить на верстаке. В этом случае рекомендуется использовать маску сети и лица волосы.
    1. С помощью одним краем лезвия бритвы, вырезать прямоугольный кусок (примерно 2 см x 0.5 см) геля агарозы (рецепт в реагентов ' таблица) и клей это на сцену vibratome, таким образом, что длинной стороне сталкивается лезвие vibratome.
    2. Очистить все поверхности и части vibratome с 70% EtOH и протереть газобетона ткань салфетки.
      Примечание: Важно, что все части, которые будут контактировать с ткани мозга полностью сухой, с EtOH может повредить клетки.
    3. Придают стерильные лезвия бритвы vibratome и проверки вибрации, если vibratome имеет этой функции.
    4. Место газобетона рассечение инструменты в капюшоне вместе с газобетона ткань салфетки, четыре небольших Петри, раунд край скальпель, 2 стеклянные пипетки с резиновыми луковицы, двух рожковый стеклянные пипетки (см. пт 1.1) и супер клей (распыляется с EtOH).
    5. Pour передающиеся вверх рассечение среднего в лодке vibratome и в четырех небольших Петри.
      Примечание: Этот шаг должен только быть сделан непосредственно перед рассечение поскольку средний с этого момента не кипела или хранится на льду
  6. Нактоузах и горе мозги.
    Примечание: Для получения здорового ломтиками, этот шаг должен быть сделано быстро и точно. Необходима определенная практика.
    1. Усыпить животных #1 путем дислокации neckor согласно местных руководящих принципов и затем обезглавить с большими ножницами.
    2. Использование малых, острые ножницы, быстро снять кожу, делая Сагиттальный разрез от шеи к носу и тянуть в сторону раскрыть черепа.
      1. Разрезом вдоль Сагиттальный шов, а затем боковые разрезы над внутренней части лобной кости и шовный материал lamboid (граница между головного мозга и мозжечке).
      2. Использовать пинцет согнуть открытый череп на каждой стороне. Черепных нервов отрезаны от мозга, вставив округлые, резкий шпатель под вентральной стороне мозга и осторожно двигаться шпатель боково.
    3. Использовать одним краем лезвия бритвы, чтобы сделать корональный вырезать ростральной мозжечка.
      Примечание: Этот отрезок будет определять угол, на котором нарезаются ломтиками. Он таким образом, следует на прямой угол.
    4. Флип мозг из черепа и в небольшой Петри, содержащие рассечение среднего.
    5. Повторить шаги 1.6.1.-1.6.4. и для животных #2 место этот мозг в втором Петри блюдо.
      Примечание: Животные не являются стерильными. Выполните рассечение на одной стороне капота и затем перейти к другой, чистой стороне, как только мозги были удалены из черепа.
    6. Изменить перчатки.
    7. Присоединить мозга vibratome этап: добавить тонкий слой супер клей на сцену перед навесные агарозном геле. Держать мозг #1 с большой плоский шпатель с свежесрезанных (хвостовой) стороне трогательно шпателем и облицовки вентральной стороне (и быть как можно ближе) геля агарозы.
      1. Затем осторожно поместите мозг на клей, отталкиваясь шпатель с набором щипцами. Убедитесь в том оставить достаточно пространства для мозга #2.
        Примечание: Важно, что мозг хорошо прикреплены на сцену, но без чрезмерного клея, как это может помешать резки.
    8. Сразу же после монтажа головного мозга #1, используйте шпатель большой добавить несколько капель рассечение средней верхней части мозга. Это будет держать мозг влажные, упрочнения клея и предотвратить его от прилипания к бокам мозги.
    9. Повторите шаги 1.6.7 и 1.6.8. для мозга #2.
    10. Прикрепить сцену на лодке vibratome.
  7. Вырезать 230 мкм толщиной корональных ломтики с амплитудой 1-1,5 мм, частотой 85 Гц и скорости 0,2 мм/s. собирать кусочки примерно между ростральной 1.4 и 2,1 мм хвостового Bregma. Собирать фрагменты
    1. после того, как каждый ломтик была сокращена с помощью open-end стеклянной пипетки (pt. 1.1). Передача фрагментов на чашку Петри, содержащие рассечение среднего. Использовать закругленными скальпель разрезать фрагменты на две части, деления двух полушарий.
  8. Когда все фрагменты вырезаны, место ломтики в культуре блюда.
    1. Взять культуры блюдо (один в то время) из инкубатора.
    2. С помощью пипетки open-end стекла, тщательно передать один срез каждого из конфетти.
      Примечание: Срезы должны лежать в середине конфетти. Это требует некоторых навыков. Однако, если некоторые фрагменты не являются идеальными, то лучше оставить их чем тратить время пытаются переместить их, как это важно как можно быстрее получить все фрагменты в инкубатор.
    3. Использовать стеклянные пипетки (заостренный конец) аккуратно удалить избыток среднего без касатьться срез.
      Примечание: Фрагменты не должен быть погружен в жидкость во время инкубации. Таким образом избыток среднего должны быть придыхательным, таким образом, чтобы срезы подвергаются воздействию воздуха, (тонкая пленка среды по-прежнему будет охватывать срезы). Фрагменты, которые по-прежнему погружен в жидкость обычно быть нездоровым или умереть (4 и нашим наблюдениям).
    4. Перемещение блюдо обратно в инкубаторе, после того как все конфетти один ломтик.
    5. Повторите шаги 1.7.8.-1.8.4. блюдо #2.
  9. Изменить культуру среднего.
    Примечание: Это должно быть сделано на следующий день после нарезки (день 1 в пробирке, DIV1) и затем каждые 2-3 дня.
    1. Подогрева питательной среды в водяной бане или инкубатора.
    2. В стерильных капот, используйте вакуумного всасывания или регулярные пипетки с стерильных наконечником аспирационная питательной среды от каждой скважины. Это делается путем нежно чаевые блюдо (на приблизительно 30 градусов) и размещение наконечник пипетки на краю культуры Вставка.
    3. Удалить примерно 800 мкл из каждой скважины (оставляя только достаточно среднего сохранить в нижней части пластины покрыты в среде). Затем используя чистый пипетки, мкл 800 подогретую среднего для каждой скважины. Затем поместите блюда обратно в инкубатор культуры клеток.

2. Вирусная трансдукции

AAVs
  1. покупки или сделать с плазмиду интереса, как описано выше 10 ,- 11.
    Примечание: Этот протокол описывает использование AAV серотипа 2/8 (ААВ 2/8) ношение митохондриальной целевых dsred или GFP как репортер ген под контролем transcriptional промоутер основной белок миелина 12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred или AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) для визуализации Олигодендроциты митохондрий. Аав 2/8 перевозящих GFP или tdtomato как репортер ген обусловлен общим CAG промоутер (ААВ 2/8 CAG_GFP или Аав 2/8 CAG_tdtomato) используется для визуализации Олигодендроциты цитоплазмой. Таким образом, сочетание AAV2/8 MBP_mito_dsred с Аав 2/8 CAG_GFP дает красный митохондрии и зеленый цитоплазмы в олигодендроциты, тогда как сочетание MBP_mito_GFP AAV2/8 и Аав 2/8 CAG_tdtomato дает зеленый митохондрий и красный цитоплазмой. Конструкции описаны более подробно в другом месте 13.
  2. На день 7 в пробирке (DIV7), передают Олигодендроциты с AAVs.
    Предупреждение: Следуйте правилам безопасности для работы с AAVs. Убедитесь в том иметь надлежащую подготовку и требуется утверждение уровня биобезопасности. Все следующие моменты должны осуществляться в шкаф класса II биобезопасности, используя перчатки и лаборатории пальто. Здесь применение AAV для области коры ломтиков описано, как это область, которая показывает лучшие восстановления.
    1. Развести AAV в подогретую (37 ° C) питательной среды. Разведений вокруг 2 × 10 9 генома копий/мл (GC/мл) рекомендуется получить разреженных трансдукции олигодендроциты, который позволяет визуализации единичных клеток внутри фрагмента. Однако пилот, используя разные титры должно быть сделано для обеспечения плотности transduced олигодендроциты, которая подходит для конкретных экспериментов. Если используются два разных AAVs, они должны смешивать в одном решении и одновременно добавляется фрагмент.
    2. Добавить около 1.3 мкл разбавленный AAV для каждого фрагмента: Убедитесь, что снаружи кончика пипетки сухой. Пипетка 1.3 мкл разбавленный AAV и держать пипетку выше коры, максимально без касатьться срез кончиком пипетки (около 1 мм прочь).
    3. Затем медленно толкать раствора из пипетки. Когда решение касается фрагмента, наведите коры распространить решение над районом всей коры наконечник пипетки.
      Примечание: Эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы избежать, сохраняя фрагменты из капюшона для дольше, чем необходимо. Сделать это на одно блюдо в то время и положить обратно в инкубаторе первое блюдо перед началом на блюдо #2. Для получения удовлетворительного распределения AAV, не повреждая ткани требует некоторой практики и твердая рука.
  3. Если вертикально флуоресцентным микроскопом в лаборатории клетки, выражение протеина может проверяться во время в культуре, поместив блюдо под микроскопом.
    Примечание: Блюдо не следует из инкубатора для более чем 2-5 минут.

3. Промежуток времени изображений

Примечание: изображения может выполняться всякий раз, когда уровни выражения флуоресцентные маркеры являются достаточными и фрагменты выглядят здоровыми (обычно DIV11-14).

  1. Обеспечить Микроскоп, перфузии и Отопление настроены правильно, чтобы обрабатывать изображений решение нагревается и может войти и выйти из ванны.
    Примечание: Для ванной камер существуют различные решения. Здесь представлена простая версия.
    1. Сделать в - и точках ванны притупляются шприц иглами (Бент на ~ 45°), которые прикреплены к бокам ванны, blu Галс/весело тэкса.
    2. Убедитесь, что трубы идет от бутылка непрерывно обрабатывать решение отображения информации, через Перистальтический насос, через Отопление трубки отопителя, а затем иглу шприца входе в бане.
    3. Подключить другой трубки к выходу иглой шприца. Эта трубка затем проходит через Перистальтический насос и обратно в бутылку изображений решение (или отходов бутылка).
  2. Пузырь изображений решение (рецепт в реагентов ' таблицу) с газом четырёхокись.
    Примечание: Это должно быть started по крайней мере 15 минут до изображений и продолжаться на протяжении всего эксперимента.
  3. Поворот на перистальтического насоса и нагревателя и выполнения решения через ванну для получения оптимальной температуры (37 ± 0.5 ° C). Убедитесь, что датчик термометра, подключенных к температуре погружен в раствор для ванн.
  4. Включите Микроскоп, люминесцентная лампа и соответствующие лазеров.
  5. Набор подходящих свет путь для данного образца.
    Примечание: Это будет варьироваться в зависимости от установки микроскопа и зонд. Общие знания о том, как использовать конфокального микроскопа является обязательным и не будут рассматриваться здесь.
  6. Использовать цель погружения воды с соответствующим увеличением и числовая апертура (н.а.). Мы используем цель плана Апохромат погружения 40 x воды (н.а. 1.0).
  7. Открыть отверстие для достижения оптическая часть примерно 2-2,5 мкм для покадровой видео. Это снижает возникновение митохондрий, двигаться не в фокусе во время покадровой.
  8. Передачи organotypic срез для ванны:
    1. Добавить каплю тепловизионные решения или питательной среды для небольших пластиковых Петри.
    2. В стерильных капот, использования стерильных щипцы для передачи одного фрагмента organotypic от мембраны вставить до капли. Щипцами должны касаться только конфетти и не фрагмент.
    3. Поставить крышку на Петри блюдо.
    4. Немедленно положить культуры блюдо, содержащий остальные фрагменты обратно в инкубаторе.
    5. Принести Петри содержащие фрагмент микроскопом.
    6. Выключить Перистальтический насос при передаче фрагмента к Микроскоп ванны. Во-первых используйте корнцанг поднять конфетти с фрагментом из Петри в верхней части ванны (конфетти будет плавать). Затем место два советы щипцы на каждой стороне конфетти, так, что они касаются конфетти без касатьться на срез и нажимаем конфетти через решение на дно ванны. Центр конфетти в середине ванны.
    7. Использования щипцов поставить прижимной Анкер (арфа) поверх конфетти без касатьться срез.
      Примечание: Арфа является подковы Платиновый якорь, который используется для предотвращения срез с плавающей или дрейфующие в ванне. Для острых фрагментов тонкие струны запускать с одной стороны арфы на другой (напоминающие музыку арфы). Для organotypic ломтиками, Арфа следует без волокнистых нитей и размеру конфетти таким образом, что он может заложить на вершине конфетти без касатьться срез.
    8. Включите насос перистальтический.
  9. Ниже цели вниз образца.
  10. Выберите ячейку и региона образ.
    Примечание: Избегайте чрезмерного воздействия клеток лазерного света, как это может вызвать токсичность клеток (см. советы в пунктах ниже).
    1. Использовать окуляры и люминесцентных ламп для поиска с правильным выражением олигодендроциты, здоровый вид. Как правило олигодендроциты, которые имеют сильные гиперэкспрессия флуоресцентный белок появляются нездоровым. Нездоровый Олигодендроциты будет иметь процессы с blobby внешний вид, и митохондрии появится фрагментирован. В здоровых олигодендроциты, сома и процессы будут гладкими и митохондрии имеют различные длины (хотя обычно гораздо короче, чем в нейроны и астроциты 13 , 14 , 15).
    2. место клетки интереса в центре поля зрения.
    3. Использования " жить " функции в программное обеспечение (для микроскопов Leica и Zeiss) для выявления клеток на экране и выберите область интереса, например, частью ячейки, содержащей несколько основных процессов или миелиновой оболочки или один процесс или Миелиновые оболочки.
      Примечание: Чтобы иметь возможность изображение столько влагалищ процессы как можно скорее, выбрать области, содержащие процессы, которые откладывают относительно плоский в направлении x-y.
    4. Масштаб области интересов (обычно производит изображения с размером пикселя 0,14 - 0.30 µm).
    5. Использование " регионов " инструмента, нарисуйте прямоугольник вокруг области и выберите опцию для сканирования только выбранного региона. Сканирования, время и таким образом лазерное облучение, уменьшается только сканирование выбранного региона.
      Примечание: Горизонтальных прямоугольных областей будут сканироваться быстрее, чем вертикальные регионах вследствие короче количество отсканированных линий необходимо. Если вертикальный прямоугольник области сканирования, время сканирования может быть уменьшена путем ротации поля сканирования на 90 градусов (с помощью инструмента «поворот»).
  11. Регулировка мощности лазера и получить, чтобы получить хороший взгляд на митохондрии.
    Примечание: Используйте необходимую мощность минимальный лазера. Если возможно поверните вверх прибыль, а не увеличения мощности лазера. Помимо вызывая клеток токсичности, слишком высокой лазерной энергии будет отбеливать фотосъемка объектов с течением времени, таким образом, требует дальнейшего увеличения мощности лазера или получить во время сканирования. Мощность требуется лазера и получить будет зависеть от уровня выражения и Микроскоп. С помощью LSM700 конфокального микроскопа мы используем 555 Нм лазер на мощностью 20-40 мкВт на изображение dsred или tdtomato и 488 нм лазер используется в 20-30 мкВт для изображения GFP (мощность лазера измеряется на спине диафрагмы цели). Усиления устанавливается высокий для живых изображений, обычно в диапазоне 700-800 за GFP и 850-980 для dsred и tdtomato. Высокий коэффициент усиления может привести к некоторым более фоновый шум, который удаляется путем увеличения цифровой смещение (смещение, которое значения обычно лежит между 0 и 15). По нашему опыту, использование MBP_mito_GFP дает лучше сигнал шум чем MBP_mito_dsred.
    12. Скорость сканирования выберите
  12. .
    Примечание: Минимизировать время сканирования с помощью быстрая скорость сканирования и рисование небольшой регион сканирования (см. пункт 4.10.5 ниже). Это также позволяет сэкономить время, выполняя проверку двунаправленного сканирования. Однако, это не рекомендуется из-за бедных качество изображения.
  13. Набор частоты и продолжительности покадровой записи, например захват изображения каждые 2 секунды для в общей сложности 20 минут для митохондриального изображений в олигодендроциты.
    Примечание: Частота и продолжительность должен быть установлен согласно мобильности интересующие вас объекты. Высокой частоты будет подвергать образца более лазерного света, но быстрее движущихся объектов также требуют короче общая продолжительность покадровой видео (например митохондрий в нейроны, которые двигают более часто и в гораздо большей скоростью, чем митохондрий в олигодендроциты, обычно отражаются каждую секунду для в общей сложности 2 минут 16).
  14. Начать запись отснятого.
    Примечание: Митохондрий может двигаться не в фокусе и/или дрейфа из образа региона во время записи. Чтобы свести к минимуму вибрации и движения, отрегулируйте в - и точек ванны и уменьшить скорость насоса при необходимости. Небольшие изменения в фокусе обычно все еще происходят. Таким образом, непрерывный мониторинг на экране во время визуализации не требуется, с небольшой корректировки направленности во время записи.
  15. Захватить z стек всей ячейки для будущих идентификации клеток и образ процесса.
    Примечание: Для лучшего разрешения, Пинхол следует сбросить в 1 просторный блок для z стека.
  16. Дополнительно: визуализировать неокрашенных миелина.
    Примечание: В Олигодендроциты преобразованы с (цитоплазмы) GFP, миелиновой оболочки могут обычно быть определены как прямые линии цитоплазмы (цитоплазматических хребты) подключены к основным процессом (см. рис. 2 A и B). Однако если экспрессия гена GFP слишком слаб или цитоплазматическая маркер не используется, это позволяет визуализировать Миелиновые оболочки, конфокальная отражения микроскопии (ядро), как описано здесь.
    1. Созданы новые светового луча в программное обеспечение с лазерным возбуждением на 488 нм и захвата испускаемого света вокруг же волны, например 470-500 Нм.
    2. Отрегулируйте мощность лазера и получить пока не виден миелина (см. пример в < сильный класс =»xfig «> рисунок 3). С помощью микроскопа LSM 510 мета, мы обычно используется лазер мощностью 7-12 мкВт (измеряется на спине диафрагмы цель).
  17. Дополнительно: подготовка фрагментов иммуноокрашивания.
    1. Если образа ячейки должны быть определены после иммуноокрашивания, малое увеличение образ (10 x) ячейки и указать ее расположение в изображении рисуя стрелки или аналогичный. Для облегчения обнаружения ячейки, рекомендуется также нарисовать ручной карту весь срез, указывающий местоположение ячейки.
    2. Исправить фрагмент в параформальдегида 4% (PFA) на шейкер на 1 час при комнатной температуре.
      Предупреждение: PFA вредно. Использовать защитные носить и использовать только в вентилируемых Худ.
    3. Ослабить фиксатор 1:10 в PBS и оставить на 4° C до начала иммуногистохимии, как описано в других разделах 17.
      Примечание: Хотя фрагменты могут быть оставлены в разреженных фиксатором на несколько недель, флуоресценции может исчезать. Выполнение иммуногистохимия в течение 10 дней фиксации рекомендуется.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Срезы мозга organotypic, которые культивировали и преобразованы, как описано выше показан разреженный распределение корковых олигодендроциты, выражая mito_dsred и GFP. Иммуноокрашивания с антителами против Olig2 и MBP подтвердил, что выражение для Олигодендроциты (рис. 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол для изготовления organotypic культур, в описанный здесь является модифицированной версии18 протокола, описанный De Simoni и ю. (2006)5. Наиболее важные изменения были изложены ниже. Трис-буфер добавляется к питательной среды, которая улучшает выживание ломтики ког...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим Bergersen Линда Хильдегард и Magnar Bjørås для доступа к ячейке лаборатории и оборудование, персонал Janelia молекулярной биологии общий ресурс для плазмид и вирусом производства и Koen Vervaeke для помощи с измерения мощности лазера. Эта работа финансировалась ассоциацией норвежской здравоохранения, Норвежский исследовательский совет и микроскопии оборудование было профинансировано Norbrain.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Sigma A9539
BD Microlance 19GBD301500Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gasAGA105701
Brand pipette bulbsSigma-AldrichZ615927Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner)VWR89038-530
Cable assembly for heater controllersWarner Instruments64-0106 Temperature controller - thermometer part
CaCl2Fluka21100
CO2 AGA100309CO2 for incubator
Cover glass, square CorningThermo  Fischer Scientific13206778To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
Delicate forcepsFinescience11063-07For dissection
Diamond scriber penTed Pella Inc.54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mmVWR612-1702Glass pipettes
Double edge stainless steel razor bladeElectron Microscopy Sciences#7200Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco-Invitrogen24010-043
Filter paper circlesSchleicher & Schuell300,220Filter paper used for filtration of PFA
Fun tackLoctite1270884Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2Katrin344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber,Warner Instruments 64-1418Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3SigmaH-7006
Holten LaminAir, Model 1.2Heto-Holten96004000MLaminar flow hood
Horse serum, heat inactivatedGibco-Invitrogen26050-088
KClSigmaP9541
LCR Membrane, PTFE, MilliporeFHLC0130Confetti 
Leica VT1200Leica14048142065Vibratome
MEM-Glutamax with HEPESThermo  Fischer Scientific42360024
MgCl2R.P. Normapur25 108.295
Micro Spoon Heyman Type BElectron Microscopy Sciences62411-BSmall, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unitMilliporeSLGPM33RASyringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mmMilliporePICM03050Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control ModuleGILSONF155001Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS9888
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaHCO3Fluka71628
Nunclon Delta SurfaceThermo  Fischer Scientific140675Culture plate
Nystatin SuspensionSigma-AldrichN1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC Zeiss441452-9900-000 Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
ParafilmVWR291-1211
Paraformaldehyde, granularElectron Microscopy Sciences#19208
PC-R perfusion chamberSiSkiYou 15280000EBath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquidInvitrogen15070-063
Petri dish 140 mm Heger1075Large Petri dish 
Petri dish 92x16 mm Sarstedt 82.1473Medium Petri dish 
Petridish 55x14,2 mmVWR391-0868Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417PBS tablets
R2 Two Channel Head GILSONF117800Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Large spatula for dissection
Sand paperVWRMMMA63119Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cmFinescience14130-17Large scissors for dissection
Scissors, 8,5 Finescience14084-08Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem bladeElectron Microscopy Sciences#71972Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27BWarner Instruments64-0102Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mmMilliporeSCGPT05REFilter to sterilize solutions
Super glue precisionLoctite1577386
Surgical scalpel blade no. 22Swann Morton Ltd.209Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324BWarner Instruments64-0100Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma baseSigma T1503
Trizma HClSigmaT3253
Water jacketed incubator series IIForma Scientific78653-2882Incubator

Ссылки

  1. Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
  2. Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
  3. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  5. De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
  6. Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
  7. Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
  8. Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
  9. Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
  10. Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
  11. Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
  12. Gow, A., Friedrich, V. L. Jr, Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
  13. Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
  14. Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
  15. Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
  16. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
  17. Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
  18. Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
  19. Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
  20. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  21. Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
  22. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  23. Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
  24. Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
  25. Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

128organotypic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены