Создание личиночной данио рерио как модель животного к расследованию Trypanosoma cruzi подвижности In Vivo

Резюме

В настоящем Протоколе дневно обозначенных т. cruzi вводили в прозрачной данио рерио личинки, а паразит подвижности наблюдалось в естественных условиях с помощью микроскопии флуоресцирования света листа.

Аннотация

Болезнь Шагаса это паразитические инфекции, вызванные Trypanosoma cruzi, чьи моторики важно не только для локализации, но и для сотовых привязки и вторжения. Текущий животных моделей для исследования т. cruzi разрешить ограниченное наблюдение паразитов в естественных условиях, представляющий вызов для понимания поведения паразита на начальных этапах инфекции в организме человека. Этот простейших flagellar этап в вектор и млекопитающих хостов, но Есть никаких исследований, описывающих его подвижность в естественных условиях. Целью данного проекта было создать живой позвоночных zebrafish модель для оценки подвижности т. cruzi в сердечно-сосудистой системы. Прозрачные данио рерио, личинки вводили с дневно помечены trypomastigotes и наблюдается с помощью микроскопии флуоресцирования света листа (LSFM), неинвазивный метод визуализации живых организмов с высоким оптическим разрешением. Паразиты могут быть визуализированы для длительных периодов времени из-за этот метод относительно низкий риск по сравнению с конфокальный фотоповреждения или микроскопия помощью эпифлуоресцентного. Т. cruzi паразитов были замечены, путешествуя в системе кровообращения, живые рыбки данио рерио в разных размеров кровеносных сосудов и желток. Они могут также рассматриваться прилагаемый к стенке желточного мешка и предсердно клапан несмотря на мощные силы, связанные с сокращениями сердца. LSFM т. cruzi-привитых данио рерио личинок-это ценный метод, который может использоваться для визуализации, распространение паразитов и оценивать их тропизма, миграции и подвижности в динамической среде сердечно-сосудистой системы живых животных.

Введение

Болезнь Шагаса вызвано простейших паразитов т. cruzi. Примерно 6-7 миллионов человек во всем мире инфицированы т. cruzi. Заболевание передается главным образом в Латинской Америке, но уже сообщалось в Соединенные Штаты, Канада и многие европейские, а также некоторых стран Западной части Тихого океана, главным образом из-за миграции инфицированных лиц¹. Шагаса в значительной степени трансмиссивных и переданы для людей контакта с калом hematophagic насекомых Триатомовые клопы подсемейства, широко известный как «целовать ошибок». Однако т. cruzi может также передаваться через переливание крови, вертикальная передача от матери ребенку, или употребление в пищу продуктов питания, загрязненных паразитов². Острой фазе инфекции главным образом бессимптомно или конститутивно симптоматическая и длится от 6 до 8 недель, после чего участия иммунной системы контролирует паразита нагрузки, но не полностью устранить инфекции³. Большинство людей введите хронической бессимптомной фазы; Однако почти 30% больных разработать симптомом хронической фазы, в котором сердечно-сосудистой системы и реже пищеварительной и нервной систем, нарушенной⁴. Этот сценарий представляет собой проблему для лечения заболеваний и управления, поскольку Есть нет вакцины, и есть только два эффективных препаратов для Шагаса: benznidazole и нифуртимокс. Обе процедуры требуют длительного администрирования и может иметь серьезные побочные эффекты².

Возросшее понимание поведения т. cruzi поведения в естественных условиях является ключом к определению паразитарные миграции, сотовой вложения и вторжения в пределах принимающей страны; отсутствие в vivo моделей ограничивает развитие новых терапевтических подходов. В vitro исследования т. cruzi инфекции показали, что подвижность trypomastigotes имеет важное значение для привязки к принимающей клеточных мембран и последующих клеточных вторжения⁵. Энергии истощения в trypomastigotes в культуре совместно с линией клеток восприимчивых было показано, уменьшить сотовой вторжения⁶. Интересно, что в trypanosomatids, flagellar движение также характеризуется как уклонение механизм против паразитов специфические антитела⁷.

Flagellar подвижность был широко изучены в пробирке в Trypanosoma brucei, тесно связанных паразита, который вызывает Африканский трипаносомоз⁸. В vitro исследования моторики этих трипаносом показал, что моделирование условий кровью или жидкостями организма, в том числе вязкость и наличие препятствий, представитель клеток крови, имеет важное значение для паразита движение вперед⁹ . Как еще он не удалось визуализировать движение паразитов в крови в естественных условиях.

Данио рерио личинки являются мощной модели для изучения хост возбудитель взаимодействий в естественных условиях. Они являются небольшими, недорогой и относительно легко поднять по сравнению с другими установленными позвоночных моделями для болезни Шагаса. Данио рерио имеют врожденного и адаптивного иммунитета похожи на людей, но их адаптивной иммунной системы начинает развиваться на 4 дня пост оплодотворение (dpf) и не созрели для еще несколько недель¹⁰. Во время раннего развития когда присутствуют только макрофагов, есть большое окно для изучения поведения паразита без немедленного вмешательства иммунной¹⁰. Однако самое главное преимущество использования данио рерио личинки как позвоночных модель для изучения поведения возбудителя заключается в их оптической прозрачности, что делает их поддаются микроскопических скрининг и изображений¹¹. Кроме того есть несколько инструментов для обработки рыбы генетики. К примеру Каспер штамм — мутант линия данио рерио с без пигментации, что делает животное полностью транспарентным и полезным для визуализации отдельных органов и для слежение в реальном времени вводили клетки¹².

Основным ограничением продольных наблюдения быстро движущихся паразитов в живой данио рерио с помощью конфокальной или микроскопия помощью эпифлуоресцентного заключается в невозможности изображений на приобретение высокой скорости и глубины проникновения больших с хорошим качеством изображения и низкой риск повреждений. Легкие лист флуоресценции micsroscopy (LSFM) является формирующейся Тепловизионная техника, которая преодолевает эти ограничения разрешить эти замечания. С помощью одной цели для обнаружения флуоресценции и вторая цель ортогональных освещения, что только освещает фокальной плоскости обнаружения цели, это возможность получения высокого разрешения оптического разделы как Конфокальный микроскоп, но с значительно сниженным фотоповреждения, даже в том, что касается эпифлуоресцентного микроскопии¹³. LSFM техника, используемая здесь называют одной плоскости освещения микроскопии (SPIM), в которой тонкий лист света освещает одной плоскости в пределах данио рерио личинки.

Цель этой методологии является установить личиночной данио рерио как жизнеспособной модели-инфекции для понимания т. cruzi подвижности и связанное с ним поведение в естественных условиях. Для этого, мы вводили прозрачный данио рерио личинки дневно обозначенные trypomastigotes, сотовых форме ответственность за заражение людей и определили движение т. cruzi в сердечно-сосудистой системы циркуляции данио рерио с помощью LSFM.

протокол

следующие протоколы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета из Лос Андес университета (CICUAL). Биобезопасности уровня 2 (BSL-2) руководящие принципы строго следует использовать для предотвращения загрязнения с возбудителя т. cruzi.

Примечание: животных уход и обслуживание: Каспер данио рерио, генетически модифицированных штамм данио рерио (Danio rerio) используется в настоящем Протоколе, из-за их ценные оптической прозрачности на всех этапах развития. Рыба манипулировать, используя оптимальный уход мульти танк условий для видов ¹⁴, в 14 ч света-10 h темные цикла, 28 ± 1 ° C, pH (7,0-7,4) контролируемых рециркуляции воды системы. Животных кормят два раза в день с живой артемии (Artemia salina) и обогащенный выращивания продуктов питания. Все протоколы были одобрены CICUAL на Универсидад де-Лос-Андес (C.FUA_14-017).

1. Подготовка яйцо воды

0,6 г/Л

1. подготовить аквариум соли в обратный осмос (RO) или обессоленной воды (DI) и в решение добавьте Метиленовый синий 0,01 мг/Л.
   Примечание: Измеренная проводимость должна быть 400-500 мкСм/см и рН уровня на 7,2-7,9. Чтобы снизить рН, аэрации воды яйцо на несколько часов.

2. Приготовление раствора фондовая Tricaine

1. подготовить 0,4% tricaine раствор путем растворения 400 мг tricaine (MS-222) в 97,9 мл дистиллированной воды (ddH ₂ O). После того, как порошок полностью не растворится, Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с помощью 2.1 мл 1 М трис (рН 9,0) и охладите решение.

3. Подготовка 1,0% температура плавления агарозы

1. растворяют низких плавления точки агарозы порошок в яйце воде до конечной концентрации 1,0%. Нагреть смесь в микроволновую печь или на горячей плите с постоянно помешивая, пока представляется однородной агарозы решение.
2. Хранить аликвоты на 4 ° C не более чем неделю.

4. Сопрягаемые пробирного и эмбриона коллекции

1. за три дня до инъекции созданы вязки с помощью здорового пар мужской и женский рыбы в разведении танков. Обогащение с стеклянные шарики и искусственные растения повышает нереста. Вязки должна быть создана во второй половине и оставил на ночь.
2. Следующее утро, собирать породил яйца, слива цистерны через ситечко и мойки яйца с водой яйцо. Удалите все яйца, инвертирование ситечко и наливание воды яйцо через стрейнер в чашку Петри. Сохранить эмбрионы здоровой, чистой их воды путем удаления любого мусора и мертвых эмбрионов с передачей Пластиковые пипетки.
3. Переноса эмбрионов в инкубаторе при стабильной температуре 28,5 ° C позволяет развитие зародышей согласно данио рерио промежуточных стандартов ¹⁵. Изучить эмбрионы два раза в день и отбросить нежизнеспособные яйца, чтобы сохранить сцепление здоровым.

5. Эмбриона Dechorionation

Примечание: Эта процедура является обязательным, если эмбрионы не вылупились во время инъекции. В этой процедуре " личинок " животных из их Хорион от 48 h вперед вывесить оплодотворение (hpf).

1. В день эксперимента, место Петри, содержащий здорового эмбриона под рассечения стереоскоп.
2. Захватить противоположные концы хориона с двумя острыми щипцами (Дюмон #5), и нежно слезы и вытащить открыть хориона. Отражаются около 5-6, личинки внедряются в то время и, как правило, 3-4.
3. Удалить chorions из воды, с помощью передачи пипетки.

6. Подготовка материала инъекций

1. подготовить 1.0 мм иглы с помощью тонкой стенки капилляров стекла и микропипеткой съемник устройства со следующими параметрами: 2 легких весов 1 тяжелый вес, верхняя тяга 2 мм + 5 мм нижняя тяга, 75.9 ° C (шаг 1) + (78,2 ° C Шаг 2). Хранить иглы в чашке Петри на полосе глина моделирования. Идеальная игла должны иметь узкие подсказка, как т. cruzi измерения приблизительно 20 х 1-3 мкм и будет легко проходить через иглу. Может изменяться длина наконечника: длиннее подсказка является полезным для достижения более глубоких структур, но короче подсказка будет более жесткой, облегчая инъекции для пользователя.
   Примечание: Размер кончика иглы зависит от температуры используется: более высокая температура для шага 2 приводит в кончик длиннее и тоньше.
2. Приготовляют раствор 1,5% агарозном ddH ₂ O и залить его в 10 см Петри. Обложка на глубину приблизительно 1.0 см.
3. Место сборных микроинъекции плесени над агарозы и позволить ему затвердеть.
4. Поднимите сборных микроинъекции плесень и добавить яйца воды для хранения при 4 ° C. Это предотвращает высыхание агарозы.
5. Добавить яйцо воды Стоковый раствор tricaine до конечной концентрации 150 мг/л. магазин на 4 ° C.

7. Клеточные культуры для паразита роста

1. паразитов поддерживаются в линию клеток человека астроцитома (CRL-1718), с помощью метода, описанного в Варгас-Самбрано et al. ¹⁶
2. начать культуры клеток человека в колбах культуры T25 (площадь = 25 см ²) на плотности тарелок ⁵ 2 x 10 или 4 x 10 ⁵ клеток в 4 мл среды RPMI 1640 с 10% сыворотки плода теленка (FCS), дополнены с 2 мм L-глютамином, глюкоза 4,5 г/Л, 10 мм HEPES, пируват 1 мм и 1% пенициллин стрептомицином (именуемые " завершить СМИ "). Инкубировать астроцитома культур при 37 ° C в среде 5% CO ₂.
3. Как только монослой вырожденная, отсоединить клетки, с помощью 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА, инкубации их за 3 мин при 37 ° C. визуально проверить клетки для отряда и блокировать решение трипсина, используя 3 мл RPMI 1640 с 10% FCS в 15 мл.
4. Центрифуга суспензию клеток 5 мин в 1350 x g.
5. Мыть результате сотовой Пелле в среде DMEM 15-мл пробирку и центрифуги для 5 мин на 1350 x g при 22 ° с.
6. Подсчитать количество ячеек вручную в камере Нойбауэр и проверить жизнеспособность в световой микроскоп на 40 кратном.
7. Нежно вновь приостановил сотовых пеллет в 4 мл полного средств массовой информации и использовать его для создания новых культур клеток, используя 2 x 10 ⁵ клеток за флакон культуры T25.

8. Cruzi т. культура и маркировка

1. паразиты являются штамм первоначально получены от зараженного человека и характеризуется как штамм (MHOM/CO/01/DA), т. cruzi да генотип TcI дискретного ввода блока (DTU) ¹⁶. После 3 или 4 суток культивирования, собирать движущихся паразитов от супернатант культуры клеток человека астроцитома и центрифуги для 5 мин в 1350 x g. отказаться от среднего.
   Примечание: Паразитов в полной среды может использоваться для повторного культуры в соотношении 1:1 с астроцитома клеток в колбах культуры T25.
2. Аккуратно вновь приостановить Пелле в 10 мл стерильной 1 x Натрий-фосфатный буфер (PBS) с 0.1% FCS и центрифуги для 5 мин в 1350 x g.
3. Удалить супернатант и вновь приостановить в 1 мл ФСБ. Возьмите 10 мкл для подсчета свободноплавающих паразитов в камере Нойбауэр.
4. Взять остальные вновь приостановлено паразитов (990 мкл) и 1 мкл Карбоксифлуоресцеина диацетата SuccinimiDyl эфира (CFSE), конечной концентрации 5,0 мкм. инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
   Примечание: CFSE запасов на 5 мм должны быть aliquoted и поддерживаться на уровне -20 ° с.
5. Гранулы паразитов (1350 x g, 5 мин). Воссоздания паразита Пелле, стряхивая трубки и стирать в 10 мл 1 x PBS-0.1% FCS следуют последующих спина (1350 x g, 5 мин).
6. Удалить супернатант и нежно вновь приостановить Пелле помечены паразита в ПБС с соответствующим объемом для получения конечной концентрации около 10-20 паразитов/nL для инъекций.
7. Использовать небольшой объем (∼ 10 мкл, примерно 1 x 10-⁴ -2 x 10 ⁴ паразитов) из trypomastigotes оценить жизнеспособность и маркировки. Перевернутый флуоресцентным микроскопом может использоваться для прямой визуализации паразитов. В передаваемых света режиме проверьте, что паразиты двигаться. В режиме флуоресценции, используйте фильтр флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) для оценки паразита маркировки.

9. Инъекций данио рерио личинки

1. загрузки паразита
   1. взять 10 мкл паразитов из ресуспендирования (100 мкл) и загрузить их в запаянные стеклянные иглы с помощью кончика пипетки 10 мкл microloader.
   2. Вставить иглу стекла в иглодержатель микроманипулятор, использовать магнитного стенд и место рядом с стереоскоп.
   3. Использование тонкой щипцы под стереоскоп, вырезать иглы, создавая тупым открыть конец и измерить размер капли для получения объем впрыска 1 nL (это эквивалентно шарик диаметром 0,12-0,13 мм при измерении в минеральное масло ¹⁷). Длиннее подсказка является предпочтительным, таким образом, чтобы игла может достигать структур глубоко внутри рыбы не повреждая ткани. В этом протоколе, используется тупой иглой, но среза иглы могут быть использованы также.
2. Установка
   1. анестезировать личинки 48 hpf, с tricaine 150 мг/Л. Убедитесь, что они не отвечают на ощупь, но убедитесь, что сердце бьется.
   2. Место личинки в микроинъекции агарозы плесень в боковой позиции.
   3. Место иглодержатель рядом с Стереоскоп и отрегулировать микроманипулятор, таким образом, чтобы кончик иглы в центре поля зрения. Переместите Петри блюдо, приготовленное в шагах 6.2 - 6.4, так что личиночной желток близка кончик иглы. Проверить состояние личинка сохранения бьющееся сердце.
   4. Значения microinjector следующим образом: инъекции давление 9,6 фунтов на дюйм (psi); держать давление: 20 psi; 100 мс спектр стробирования; значение периода 1.9 (соответствует параметру 10,9 мс). Объем впрыска должно быть между 1-3 nL, с приблизительно 10-20 паразитов/nL.

10. Инъекции паразита

1. Inject рыбы в Улучшенный передняя часть желток в воздуховод Кювье. Этот шаг следует практиковать обеспечить выживаемость животных после инъекции. Она занимает примерно 10 минут, успешно придать личинки 5-6.
2. Как элемент управления, придать личинок 1-2 с того же объема транспортного средства (ПБС).
3. Немедленно передать воде свежие яйца личинка.

11. LSFM монтаж из вводят личинки

1. переноса личинок, вводится с паразитов к пустой Петри и тщательно удалить окружающие воды с пластиковых дозаторов и фильтровальную бумагу. Сразу же 100 мкл разогретой 1,0% низких плавления агарозы точки (см. шаг 3 для подготовки агарозы) для покрытия личинка. Обеспечить агарозы не более 40 ° C.
2. Вставьте прямой провод внутри 1,0 мм стеклянный капилляр и использовать его как поршень, чтобы всосать вверх личинка в вертикальном положении. Убедитесь в том оставить небольшое количество агарозы выше личинка. Подождите, пока агарозы твердеет прежде чем подвергать личинка (это потребует несколько минут). При необходимости, вытолкнуть избыток агарозы ниже личинка и резать выкл
3. Место капилляра в держателе образца микроскопа и вытолкнуть конца, содержащие личинки до тех пор, пока он висит свободно от капилляров. Образца камеры должны быть заполнены раствором tricaine (150 мг/Л) и температуры, установленной на 28 ° с.
4. Положение личинка перед учеником обнаружения цели с помощью XYZ-микроманипулятор системы. Для вращения вокруг вертикальной оси используйте этап вращения. Позиционирование личинка должно быть сделано в передаваемых света режиме, чтобы четко определить личиночной структуры.

12. LSFM изображений из вводят паразитов

1. изменения для флуоресценции режим и регулировать интенсивность освещения, а также время экспозиции для снижения фотоповреждения и оптимизировать время разрешение. Для этих конкретных экспериментов мы использовали мощностью 2,8-3,0 МВт для образца и подвергается каждый кадр для 200 мс, с помощью камеры с 6.45 мкм пикселей и ~ 70% Квантовая эффективность на длинах волн обнаружения. Эти параметры должны привести к надлежащим образом экспонированные снимки на около 5 кадров/s. Убедитесь, что использовать объективный с высоким возможным числовая апертура.
2. Начать видео приобретение региона интерес (ROI). В нашем случае паразиты наблюдаются прилагаемый к клапанам и свободно движущихся вокруг области сердца. Рекомендуется взять видео одной плоскости с течением времени, или использовать систему микроманипулятор или пьезо гальво сосредоточить внимание различных плоскостях, в то время как паразит движется.
   Примечание: Данная процедура полезна для коротких приобретение раз до 2 ч. Для приобретения в долгосрочной перспективе, личинки должны устанавливаться с помощью альтернативных методов ²⁰.

13. Обработка изображений и анализ приобретенных данных

Примечание: обработка изображений была выполнена на персональном компьютере с 2,90 ГГц процессором, 8.00 ГБ оперативной памяти и видеокарта с 1.00 ГБ памяти.

1. Открыть приобретенного набора данных в обработки изображений программное обеспечение по выбору. Открытое программное обеспечение Фиджи рекомендуется для LSFM обработки данных и анализа ²¹.
2. В программное обеспечение анализа изображения, настроить уровни яркости и контраста для повышения изображений.
   Примечание: Нет фиксированных параметров используется в данном случае, но при выборе " авто " параметр может быть полезен для получения первоначального расширение.
3. Выберите ROI.
   Примечание: Для отслеживания отдельных паразитов, Фиджи имеет оба ручного и автоматического отслеживания плагины доступны.

14. Восстановление Imaged личинки

1. Удалить личинки тщательно от агарозы с помощью тонкой щипцы и инструмент цикла волос. Передача рыбу обратно к воде свежие яйца и проверьте для восстановления после 15 минут возвращения личинка в инкубатор на 28 ± 0.5 ° C.
2. В качестве альтернативы, переходите к усыпить фотосъемка личинки с передозировкой tricaine. Затем ввести личинок в раствор гипохлорита натрия (6,15% NaClO) на 5 минут, чтобы убить паразита. Распоряжаться согласно учреждение ' s стандартные протоколы.

Результаты

Оптимальные условия для инъекций:

Группы данио рерио личинок вводили на 24, 48, 72, 96 и 120 hpf, на различных анатомических участках и их выживание был рассмотрен каждый день в течение 5 дней. Через 5 дней после инъекции, эмбрионы вводят в 24 hpf имел 6,25% выживания (2/32), тогда как 95% (38/40) личинок, вводят в 48 hpf выжил. Как элемент управления личинки вводили с ПБС как транспортное средство. Не было выявлено различий в выживаемости между вводили транспортного средства и вводят паразита личинок, указывающее не зависящих от паразитических влияния на выживаемость рыбы (p = 0,08). Личинки, вводят между 72-120 hpf у постоянных инъекций объем сопоставимых выживаемости до 48 вводят hpf личинок. Для всех процедур, представленные здесь 48 hpf личинки были использованы из-за их легкости манипулирования и разработав органов и легко проницаемые кожи без очевидной повреждения после инъекции.

Личинки, вводят в 48 hpf были вводят в пространстве перикарда, хвост мышц, задний мозг желудочка, слуховой пузырек, Хорда и канальные Кювье в желточного мешка. Не наблюдалось разницы в выживании личинок, вводят на различных анатомических участках. Однако быстрый и простой региона придать был протока Кювье, расположенный в передней части желточного мешка (рис. 1, 1 кино). Инъекции в этом месте допускается введение более высоких объемах с более низкий риск травмы для жизненно важных структур. Кроме того между 24-72 hpf, этот регион является оптимальным сайт для прямого доступа к развивающихся сосудистую и сердце¹¹.

Паразит визуализации с помощью LSFM:

В течение 8-10 мин после инъекции т. cruzi в протока Кювье паразиты были определены в zebrafish личинки, с помощью LSFM из-за их CFSE флуоресцентного сигнала и оптической прозрачности личинки. После прививки паразиты были замечены что либо придерживаться стен вокруг системы кровообращения или путешествие в направлении потока крови (рис. 2, рис. 3). Когда паразита остается прикрепленным к сердечной структуры, например предсердно клапан, она колеблется с сокращениями сердца, указав, что молекулярные механизмы для соблюдения паразитов может быть эффективным в нашей позвоночных модели (2 фильм, кино 3 Дополнительная кино 1). Т. cruzi также придерживаться стен личинок желточный мешок ( рис. 2, фильм 2), структура, которая будет впоследствии реабсорбируется и стать частью данио рерио кишечника²². Это может быть похож на то, что происходит на этапе хронических болезней в зараженных людей, где паразиты находятся в cardiomyocytes и пищеварительной системы нервной^23,24. Когда не прилагается, паразиты дрейфовал через поток крови в том же направлении эритроцитов ( рис. 3, 4 кино). Паразитов можно наблюдать в различных судов размера рыбы, но были более обильны в пространство перикарда и в регионе рядом желток, содержащий поток крови ( рис. 2, рис. 3, Дополнительные фильм 2).

В 10 мин пост инъекций было более трудно пятно одиночные формы паразита из-за их распределение вдоль сосудистую и неспособность быстро экрана различных анатомических сайты рыбы из-за ограниченного поля зрения LSFM (на 40 кратном ). После 24 часов пост инъекции (hpi), CFSE сигнал начинает накапливаться в регионе рядом развивающихся кишечника (дополнительная цифра 1).

Рисунок 1: Оптимальные укола. (A) образ личинка 48 hpf показаны оптимальный укола на воздуховод Кювье (желтая стрелка) с помощью регулярных стереоскоп. (B) Magnified вид коробки в показаны протока Кювье (желтая стрелка). Шкалы бар = 200 мкм (A), 50 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: LSFM изображения статических паразита в 48 личинка hpf. Т. cruzi паразит (желтая стрелка) по-прежнему соблюдать стенок желточного мешка, на протяжении всего покадровой последовательности (7.2 s, 17,2 s и 27,2 s), около ~ 15 мин после инъекции паразита. Никаких изменений в позиции паразитов наблюдается в период приобретения по крайней мере 30 s. а, атриум; v, желудочка. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Траектории паразита путешествие в пространстве перикарда, используя LSFM. Т. cruzi паразит может отслеживаться во время дрейфа в пространстве перикарда (PS), после направления потока крови (трек, отображаются в красном цвете) около ~ 15 мин после инъекции паразита. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фильм 1: Долина циркуляции крови желток в личинки 48 hpf. Кино личинки 48 hpf показаны Долина циркуляцию крови или протока Кювье, с помощью регулярного стереоскоп. Различных регионах сосредоточены во время видео, чтобы показать красных кровяных клеток, обеспечивая циркуляцию повсеместно в воздуховоде. Желтая стрелка показывает оптимальную укола. Фильм был записан около 10-15 мин после инъекции паразита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.

Фильм 2: Т. cruzi паразитов прилагается к стенам желточного мешка. LSFM фильм личинка 48 hpf показаны, что паразиты т. cruzi по-прежнему соблюдать желточного мешка около 10-15 мин после инъекции паразита. Никаких изменений в позиции паразита наблюдалось в период приобретения по крайней мере 30 s. а, атриум; v, желудочка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.

Фильм 3: Т. cruzi паразитов прилагается к стенкам сердца. Фильм LSFM личинки 48 hpf показаны remai паразитов, т. cruzi n присоединились к стенке сердечно-сосудистой системы, несмотря на сильное сердце схватки около 10-15 мин после инъекции паразита. Эритроцитов может наблюдаться как черный округлые тени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.

Фильм 4: паразитов, перемещение в пространстве перикарда. Фильм LSFM личинка 48 hpf показаны т. cruzi паразитов, дрейфующих в пространстве перикарда. Два паразитов могут быть прослежены в разное время точках (ID 1, красный круг, и ID 2 в желтом круге), после схожей траектории. Фильм был записан около 10-15 мин после инъекции паразита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.

Дополнительные рисунок 1: накопление CFSE флуоресцентного сигнала в желтке. Стереоскоп изображения larva wildtype вводят в 48 hpf на воздуховод Кювье. CFSE флуоресцентного сигнала постепенно накапливается в желтке, через два дня после инъекции (48 hpi). Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать рисунок.

Дополнительные фильм 1: паразитов прикреплены к стенам и клапаны системы кровообращения. Стереоскоп время серии изображений дикого типа личинки вводят в 48 hpf. Изображения взяты интервалом 0.2 s захвата т. cruzi паразитов в синхронности с сокращениями сердечной мышцы в предсердно клапан. Фильм был записан около 30 мин после инъекции паразита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.

Дополнительные фильм 2: перемещение и придерживался паразитов в перивентрикулярной пространстве и желток. Фильм LSFM личинка 48 hpf показаны т. cruzi паразитов дрейфующих или придерживаться перикарда пространства или желток. Представление передачи света было отмечено за первые 5 s. Флуоресценции мнение было отмечено с 5,2-25,8 s. Фильм был записан около 10-15 мин после инъекции паразита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать видео,.

Обсуждение

Это исследование подчеркивает преимущества данио рерио, как животной модели для изучения возбудителя поведения в естественных условиях. В частности, это исследование предлагает метод для визуализации патогенный т. cruzi в своей естественной среде: кровяной циркуляции. Окружающей среды кровообращения микроокружения рыб сопоставима с млекопитающих, и trypanosomatids были разработаны механизмы для путешествий, уклонение от иммунной системы и присоединение к клеткам для инфекции в этой среде²⁵. Этот протокол предоставляет описание оптимальные процедуры для культуры т. cruzi в линию клеток человека и последующая изоляция flagellar форм для люминесцентные маркировки. Затем он показывает соответствующие параметры для успешного введения паразитов в прозрачной данио рерио позднее монтажа и визуализация с помощью LSFM. Наконец этот протокол предложений для эффективной и действенной в vivo визуализации движения в обращении с помощью LSFM и расположение паразита.

Жгутика трипаносом вытекает из его задней региона, вытекающих из тела клетки, и висит бесплатно на передней части организма²⁶. Т. cruzi продвигает себя, размахивая жгутика впереди тела, которое ползёт паразита всего тела. Flagellar движения необходима не только для подвижность паразит, как и в случае brucei т.²⁷ (возбудитель Африканский трипаносомоз), но он также используется для сотовых инфекции, как было продемонстрировано в т. cruzi^{5 ,28}. Хотя данио рерио не естественный принимающей страны т. cruzi, паразита сократительной способности могут быть изучены в развивающейся сердечно-сосудистой системы циркуляции системы, используя протоколы, описанные здесь. Кроме того существуют виды трипаносом, заразить карповые, класс данио рерио, например т. carassii и т. borreliв²⁵. Эти виды паразитов могут быть использованы для изучения в режиме реального времени движения и механизмы крепления этих trypanosomatids; такие исследования могут оказать понимание процесса инфекции клеток млекопитающих.

В этом исследовании, вводят подвижные cruzi т. паразиты были наблюдаемых путешествие через сердечно-сосудистой системы циркуляции привитых рыбы, перемещаясь вместе с непрозрачной эритроцитов и придерживаясь структуры в стенах сердечно-сосудистой системы. Мы использовали LSFM построенный дом с 10 X ахроматические рабочим расстоянием воздуха цель (17,6 мм) для освещения руку с числовой апертуры 0.25. 40 X цель погружения apochromatic воды с числовой апертуры 0,8 и рабочее расстояние 3,5 мм был использован для обнаружения руку. Цель обнаружения был погружен в палате образец, в то время как цель освещения был вне камеры. Порт в камере, запечатанный с coverslip и оптические клея допускается для освещения пучка войти в камеру, как показано в Лоренцо et al. ¹⁸ для освещения, мы использовали 50 МВт DPSS лазера на 488 нм, мощность которого был модулированные Акусто оптический перестраиваемый фильтр. Обнаружения пути используются фильтры совместим с зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) или FITC. Микроскопом света лист с держатель образца капиллярной (в идеале с автоматической ротации) и контроля температуры образца камеры должны быть пригодны для этого приложения. Микроскоп следует согласовать и калибровать согласно инструкциям производителя или пользователя Лаборатория стандартные протоколы до приобретения, в случае необходимости. В этом протоколе мы под контролем микроскопа с помощью программного обеспечения SPIM¹⁹.

Важно отметить, что в обращении данио рерио, личинок паразитических вложений является эффективным. В кардинал Вен паразиты оставался прилагаемый для до нескольких минут; в сердце они провели клапаны и стены, колеблющимся с сокращениями сердца. Дальнейшие исследования остаются с целью выяснения ли т. cruzi взаимодействует с течет эритроцитов, которые дрейф в направлении потока крови. Предыдущий в vitro исследования показали, что наличие твердых структур (например, клетки крови), или увеличению вязкости жидкости для имитации крови в пробирке, имеет значительное влияние на подвижность и скорость паразита ⁹.

Есть много вопросов относительно курса инфекции T. cruzi в организме человека после amastigotes побег фагоцитирующих клеток, первоначально инфицированной клетки типа²⁹. К примеру как они приходят, чтобы их органы-мишени? Какие существуют механизмы для тропизм к предпочтительным органов, таких как инфаркт, пищеварительной и центральной нервной системы? Интересно, что в этом исследовании паразиты были изначально отображаемого в самом сердце потому, что это был сайт наивысшую плотность паразитов. Однако CFSE сигнал впоследствии накопленных в развивающихся кишечника путем инъекций пост 7 дней. Хотя анатомии рыб и млекопитающих отличается, результаты этого исследования демонстрируют формы тропизма, как было отмечено, что паразиты выставлены тропизм к органов известно предпочитаемая несмотря на научные разногласия. Одно существенное ограничение этого исследования касается температуры, используемых в экспериментах. Данио рерио личинки должны храниться около 28 °C в течение всей процедуры. Хотя эта температура может быть похож на узел вектор (насекомые Триатомовые клопы подсемейства), это сильно отличается от теплокровных млекопитающих, которые составляют окончательный хостов (около 37 ° C). Т. cruzi , как известно, имеют flagellar живых форм в обоих узлов; Однако важно иметь в виду, что этот фактор может иметь эффект в поведении животных в естественных условиях.

Хотя fish´s адаптивной иммунной системы не пожилые до 4 недель после оплодотворения, врожденная иммунная система активна в начале развития¹⁰. 48 или 96 hpf, в кратчайшие сроки фагоцитирующих клеток были замечены, что охватил помечены трипаносом (данные не показаны). Это ограничивает окно времени для визуализации паразита. Однако если исследование должно было сосредоточить внимание на оценке fish´s иммунный ответ, может быть рекомендовано инъекций на более поздних этапах. Кроме того инъекции паразитов в трансгенной рыбы строки с метками макрофаги или другие клетки иммунной системы может быть полезным при изучении паразита привязанность и эндоцитоз возможных механизмов. Важно отметить, что если паразитов помечены CFSE, трансгенными ячейку метки не должно быть GFP и маркер в желтого или красного конца спектра не требуется.

Для оценки подробных направление движения паразита, может быть полезно следовать их траектории в трех измерениях (3D). Для 3D визуализации и реконструкции процесса необходим высокоскоростной системы. С оборудование, используемое в настоящем Протоколе это возможно только для визуализации паразитов в одной плоскости. В этом случае мы и приоритетными для поддержания стабильности фокальной плоскости во время движения паразита, записи траектории в одной плоскости.

Методология, предложенная здесь прокладывает путь для дальнейшего расследования поведения паразита в сердечно-сосудистой системы циркуляции. Таким образом существенные шаги для визуализации живой флуоресцентный паразитов внутри данио рерио личинки являются:(i) использование раннего вылупившиеся эмбрионы (24-48 hpf) или личинок или животных между 72-96 hpf с без пигментации так, что они являются прозрачными и легко придать; (ii) изображения личинки как можно скорее после инъекции, чтобы избежать паразита фагоцитирующих клеток; и (iii) основное внимание LSFM на сайте интерес (например, перикарда район) и поддерживать фокус. Эта новая процедура позволяет визуализировать trypomastigotes в среде сопоставимы с ее природные инфекции нишу, обеспечивая для в первый раз возможность изучить т. cruzi в живом организме.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5-10 μL Micropipette	Fisherbrand	21-377-815
Agarose RA	Amresco	N605	Regular
Agarose SFR	Amresco	J234	Low Melting point
Aquarium salt	Instant ocean	SS15-10
Cell Count chamber	Boeco	Neubauer
Cell culture flasks	Corning	430639
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
CFSE	ThermoFisher	C34554
Detection objective	Nikon 40x 0.8NA	40x CFI APO NIR
DMEM medium	Sigma-Aldrich	D5648
Dumont #5 fine forceps	World precision Instruments
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Fetal calf serum (FCS)	Eurobio	CVFSVF00-01
Filter	Chroma	ET-525/50M
Glass capillaries for embryo mounting	Vitrez Medical	160215
Glass capillaries for pulling needles	World precision instruments	TW100-4
Glucose	Gibco	A2494001
HEPES	Gibco	156300-80
Incubator	Thermo Corporation	Revco
Larval microinjection mold	Adaptive Science Tools	I-34
Laser	Crystalaser	DL488-050
L-glutamine	Gibco	250300-81
Methylene blue	Albor Químicos	12223
Micromanipulator	Narishige	MN-153
Micromanipulator system	Sutter Instrument	MP-200	For LSFM
Micropipette puller device	Narishige	PC-10
Microscope	Olympus	CX31
Microscope (inverted)	Olympus	CKX41
Multipurpose microscope	Nikon	AZ100M
Neubauer counting chamber	Boeco Germany
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-163
Petri dish 94x16	Greiner bio-one	633181
Plastic pasteur pipette	Fisherbrand	11577722
Rotation stage	Newport	CONEX-PR50CC
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R4130
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Stereoscope	Nikon	C-LEDS
Tricaine (MS-222)	Sigma-Aldrich	886-86-2
TRIS	Amresco	M151
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	R-001-100
Tubes 15 ml	Corning	05-527-90