JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта статья конспектирует протокол для обнаружения одного или нескольких плазмы и/или внутриклеточные мембранные белки с помощью основного состояния истощения (GSD) суперразрешением микроскопии в mammalian клетках. Здесь мы рассмотрим преимущества и ограничения использования таких подходов для визуализации и количественной оценке клеточных белков.

Аннотация

Достижения в флуоресцентной микроскопии и ячейки биологии тесно коррелируются с расширенной способность визуализировать сотовой события часто приводит к драматическим МПДООС в нашем понимании того, как клетки функции. Разработку и наличие суперразрешением микроскопии значительно расширился пределы оптическое разрешение от ~ 250-20 Нм. Биологи больше не ограничивается описанием молекулярных взаимодействий с точки зрения colocalization в пределах дифракции ограниченной области, скорее это теперь можно визуализировать динамического взаимодействия отдельных молекул. Здесь мы приводим протокол для визуализации и количественной оценке клеточных белков на истощение земли государство микроскопии для фиксированной клеток. Мы предлагаем примеры из двух различных мембранных белков, элемент translocon эндоплазматического ретикулума, sec61β и плазматической мембраны локализованных напряжения закрытый L-типа Ca2 + канал (CaV1.2). Обсуждаются конкретные Микроскоп параметры, методы фиксации, Фото переключения буфера формулировки и ловушки и задач обработки изображений.

Введение

Клеточных сигналов реакции перевод, изменение внутренних и внешних сред клеточный ответ инициировать. Они регулируют все аспекты человеческой физиологии, выступающей в качестве основы для гормонов и нейромедиатора релиз, сердцебиение, видение, оплодотворение и когнитивные функции. Нарушение этих сигнальных каскадов может иметь серьезные последствия в виде патофизиологические условий, включая рак, Паркинсона и болезнь Альцгеймера. На протяжении десятилетий биологических и медицинских следователей успешно использовали флуоресцентных белков, зонды и биодатчиков, в сочетании с микроскопии флуоресцирования как основной инструмент для понимания точной пространственной и временной организации этих сотовых сигналы.

Сильные оптические методы, такие как эпифлуоресцентного, конфокальная, или полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) являются их чувствительность, скорость и совместимость с живой клетки изображений, в то время как основным ограничением является их невозможно разрешить дифракционный резолюции, смысл структур или белковых комплексов меньше 200-250 Нм. С теоретической и практической разработки детерминированной суперразрешением (например, простимулированное излучение истощения микроскопии (1интереса), структурированных освещения микроскопии (2SIM) или стохастические суперразрешением (например , photoactivated локализации микроскопии (3PALM), или основного состояния истощения (GSD4,,5)), боковой и осевой резолюции в микроскопии флуоресцирования вышла за рамки дифракции барьер, в порядке от несколько десятков нанометров. Таким образом следователи теперь имеют беспрецедентную возможность визуализировать и понять, как динамики белков и организация переводит функцию на около молекулярном уровне.

Основного состояния истощения микроскопии следуют отдельные молекулы возвращение (GSDIM), или просто GSD как известно, обходит дифракционного предела снижая количество одновременно испуская флуорофоров4,5. Высокой энергии лазера используется для возбуждения Флюорофор, меченного образца, бомбардирующих электронов с фотонами и увеличивая вероятность того, они проходят в спин сальто и введите триплет или «темно государство» из возбужденного состояния4. Это эффективно истощает землю государства, отсюда название «землю состояния истощения». В государстве, триплет флуорофоров не излучают фотоны и образца появляется диммер. Однако эти флуорофоров ковшах вернуться в состояние земли и может пройти через несколько фотон, испуская возбужденных Земля состояниями прежде чем вернуться в состояние триплет. С меньше флуорофоров излучающих в любой момент времени, фотон очередей излучаемый отдельных флуорофоров, становятся пространственно и височно отличается от соседних флуорофоров. Всплеск фотонов может быть установлен с функцией Гаусса, расчетный центр тяжести которого соответствует позиции Флюорофор с точностью локализации, которая зависит от числовой апертуры (NA) объектива, длина волны света, используемого для возбуждения и самое главное, количество фотонов, на Флюорофор. GSD ограничение состоит в том, что, поскольку только подмножество флуорофоров активно излучает в любое время, тысячи изображений должны быть собраны за несколько минут, чтобы создать карту полной локализации. Длинные приобретение время, в сочетании с высокой лазерной требования к электической мощности, означает, что УГГК лучше подходит для фиксированной вместо живых образцов.

В этой статье описывается подготовка фиксированной образцов для супер-резолюции микроскопии изображений и мембраны эндоплазматического ретикулума (ER)-резидентов белков (для получения списка необходимых расходных материалов и реагентов просмотреть Таблицу материалов). Примеры как этот протокол может быть легко адаптирована для количественного определения размера и степени кластеризации L-типа условного напряжения Ca2 + каналов (Cav1.2) в сарколеммы культивировании, или используется для визуализации клеточных распределения ER, демонстрируются. Понимание распределения и организации этих клеточных компонентов критически важную роль в понимании возбуждение, перевод и в конечном счете функции многих Ca2 +-зависимые сигнальные каскады. К примеру Cav1.2 каналы являются принципиально важными для возбуждения сокращение муфты, в то время как рецептор опосредованный Ca2 + освобождение от ER является, пожалуй, наиболее распространенным сигнальный Каскад в mammalian клетках.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Мойка стекла Coverslips

  1. за день до обработки образца, очистить #1.5 стекла coverslips, sonicating в 1 М растворе KOH за 1 час. Это удаляет любой флуоресцентные загрязняющих веществ, которые могут присутствовать на coverslips.
    1. Промыть Кох из coverslips деионизированной водой.
    2. После того, как мыть в Кох, хранить coverslips в 70% этанол до готовой к использованию.

2. Покрытие стекла Coverslips

Примечание: шаги в этом разделе должна быть выполнена в капюшон культуры клеток для предотвращения загрязнения.

  1. Использовать щипцы для удаления отдельных coverslip из 70% этанола раствор и быстро пламя, чтобы удалить излишки. Место coverslips в 6-ну плиту. Если пылающий в капюшоне культура не является альтернативой, рассмотрим автоклавирования coverslips после промывки с деионизированной воды и/или стерилизации под ультрафиолетовым светом в культуре капот для по крайней мере 30 мин
  2. Для помощи адгезии клеток, пальто coverslips с стерильных 0,01% поли L-лизин за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Аспирационная поли L-лизин и промойте coverslips с стерильных фосфатный буфер (PBS). Воздух сухой и поставьте в холодильник на ночь.
  4. Следующее утро, удалить coverslips из холодильника и 300 мкл Ламинин, в концентрации 50 мкг/мл, по крайней мере 30 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что Ламинин тщательно размещены непосредственно на coverslip.
    Примечание: Этот шаг Ламинин не является необходимым для COS-7 клетки или клетки, HEK293, но требуется для изолированных желудочков миоцитов. Другие первичные элементы такие, как клетки сосудистой гладкой мышцы или нейроны могут придерживаться лучше коллагена и фибронектина покрытием coverslips.

3. Подготовка клетки

    1. культивируемых клеток клетки растут COS-7 (или предпочтительным клеточная линия) на 10 см культуры блюдо в 10 мл Дульбекко ' s среднего изменения орлы (DMEM) культуры среднего дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллин/стрептомицина (PS) решение. Рост клеток в инкубатор культуры клеток при 37 ° C и 5% CO 2.
    2. Когда клетки достигают 90% confluency, собирать их от 10 см блюдо, аспирационных DMEM СМИ и добавив 5 мл 0,05% раствора трипсина EGTA. После того, как клетки начинают облавы и отсоединение, немедленно нейтрализовать трипсина с дополнениями DMEM.
      1. Использования 5 мл Серологические Пипетки для удаления клеток из блюдо. Пипетка средство против базы блюдо несколько раз для удаления любых клеток, которые остаются сторонником и содержанием однородно распределить клетки всей культуры среднего.
    3. Пластины на 35 мм культуры блюда для достижения 70% confluency для transfection клетки. Сделать объем среднего в блюдо до 2 мл с свежий раствор DMEM/FBS/Л.С.
    4. Transfect COS-7 клеток с желаемой плазмидной ДНК конструкции (например, плазмида sec61β-mCherry), используя соответствующие трансфекции реагента и по заявлению производителя ' s инструкции.
      Примечание: Это может занять 24-48 ч для белка, в зависимости от плазмида или трансфекции реагент, который используется выразить.
  2. Взрослых мыши желудочков миоцитах
    1. изолировать взрослых мыши желудочков миоцитов, используя налаженные Langendorff перфузии метод 6. Вновь приостановить результате Пелле миоцитов в среде 199 (M199) дополнены 2,5% FBS и 1% PS.

4. Покрытие клетки

  1. клетки Transfected COS-7
    1. аспирационная 2 мл раствора в среде DMEM/FBS/PS из 35 мм блюдо и добавить 1 мл Ca 2 +-бесплатно PBS. Вернитесь в блюдо инкубатора для 2 мин урожай клетки от блюдо, первый аспирационных Ca 2 +-бесплатный PBS и затем Добавление 1 мл 0,05% раствора трипсина EGTA.
      1. После того, как клетки начинают круглый вверх и отсоедините, немедленно нейтрализовать трипсина с 1 мл раствора дополнениями DMEM. Аккуратно Пипетка вверх и вниз несколько раз для обеспечения transfected клеток равномерно распределяются по 2 мл суспензии трипсина EGTA-DMEM.
    2. Пластина transfected клетки COS-7 на поли L-лизин с покрытием coverslips в соответствующей плотности, чтобы отдельные клетки могут быть визуализированы и заполнить блюдо объем до 2 мл с DMEM/FBS/PS (например, добавить 90 мкл суспензии клеток в coverslip затем добавить 1 910 мкл дополнены DMEM, вихрем блюдо, чтобы равномерно распределить клетки).
      Примечание: Клетки не должны учитываться, но объем ячеек добавляется к каждому блюду будет варьироваться в зависимости от confluency клеток.
    3. Возвращение покрытием клетки клетки культуры инкубатор на ночь чтобы клетки присоединиться и восстановить.
  2. Взрослых мыши желудочков миоцитах
    1. аспирационная Ламинин и пластины миоцитах непосредственно на покрытые coverslips в соответствующей плотности, так что отдельные клетки могут быть визуализированы. Это будет зависеть от плотности жизнеспособных клеток, полученных из изоляции,.
    2. Баланс суспензию клеток в купол на coverslip и место в инкубатор культуры клеток при 37 ° C и 5% CO 2 ~ 45 мин разрешить прилипание.

5. Фиксация клеток

  1. Удалить ячейки из инкубатора и тщательно удалить носитель.
    1. Промыть адэрентных клеток с PBS.
    2. Исправление клетки с фиксатором, оптимизированный для отдельных приложений и антител.
      Примечание: Важным критерием иметь в виду при выборе фиксатором является сохранение клеточную структуру образца, а также обеспечение того, чтобы не конформационные изменения в антиген интереса. Для целей данного протокола фиксации с 3% paraformaldehyde/0.1% глутаровый (PFA/GA) и фиксации с 100% метанола обсуждается.
  2. PFA/GA фиксации transfected COS - 7 клеток, выражая Sec61β-mCherry
    1. микс 1.9 мл 16% PFA и 20 мкл 50% GA и добавить PBS сделать окончательный объём 10 мл.
    2. Добавить 1 мл свежеприготовленные PFA/GA решение к каждому блюду клеток и исправление для 10 мин при комнатной температуре.
    3. Аспирационная PFA/GA и промыть клетки 3 раза с PBS.
    4. Мыть придерживался клетки с PBS, 5 раз за 5 мин. Выполнить все шаги стирки на вращателе, равным с умеренной скоростью (например, 50 циклов в минуту).
    5. , Уменьшения свободной альдегидной группы с 1 мл свежеприготовленной 0,1% Масса/объем натрия боргидрид в деионизированной воде.
    6. Промыть клетки дважды затем вымойте 3 раза за 5 мин в PBS для удаления всех следов алкоголя, он производит, когда он реагирует с бесплатным альдегиды и натрия боргидрид.
  3. Метанола фиксации взрослых мыши желудочков миоцитах
    1. осторожно добавьте 1 mL ледяной 100% метанола в клетки. Наклона пластины 6-Ну и Пипетка метанола против боковой стенке, а не непосредственно на coverslip. Затем наклон пластину 6-Ну обратно к горизонтальной разрешить метанола равномерно мыть над клетки. Исправление для 5 мин при-20 ° C.
    2. Аспирационная фиксатором и промыть клетки 3 раза с PBS.
    3. Мыть придерживался клетки с PBS, 5 раз за 5 мин на вращателе.

6. Блокирование привязки неспецифические

  1. блок на 1 ч при комнатной температуре в решении блокировки (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Различные решения могут использоваться для блокирования неспецифической антитела связывая, включая 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) или не иммунной сыворотки из того же вида, как основное антитело.

7. Обнаружение

  1. основное антитело инкубации
    1. аспирата блокирования решения. Не мыть или полоскания.
    2. Подготовить решение основное антитело следующим образом (см. шаг 7.1.5): разбавить основное антитело к концентрации 10 мкг/мл (или производителя ' s предложила концентрации) в растворе инкубации антитела (см. таблицу материалы, ). Сбалансировать этот небольшой объем на coverslip и тщательно установить квадрат пластиковых парафин фильм на верхней части. Это помогает распространять небольшой объем антитела над coverslip и оберегает от испарения.
    3. Место 6-ну пластины в камере влажность и инкубировать на ночь в холодильник.
    4. Утром, удалить ячейки из камеры влажности, тщательно удалить парафин фильм площадь поверхности coverslip и аспирационная решение основное антитело.
    5. Промыть 3 раза с PBS, затем смывают 5 раз за 5 мин с моющего раствора блок (см. Таблицу материалы) по ротатору.
      Примечание: Этот протокол использует следующие антител, анти RFP мыши моноклональные антитела для изображения отображаются на рисунке 2 и кролика polyclonal FP1 7 анти Ca V 1.2 антитела (подарок от проф. Йоханнес ад, UC Davis) для изображений, отображаемых на рисунке 3. Что касается влажности камера пластиковые коробки обед с плотно закрывающейся крышкой, выстроились с мокрого бумажные полотенца работ. PBS может использоваться для промывки шаги, однако этот протокол улучшает маркировки специфичность и уменьшает фона с помощью блокирования разбавленный раствор для промывки шаги.
  2. Вторичное антитело инкубации
    1. аспирационная моющий раствор и добавить 200 мкл конъюгированных вторичное антитело раствор разбавляют 1:1,000 в растворе инкубации антитела. Место площади парафина фильма поверх coverslip (см. шаг 7.1.2).
    2. Инкубировать 1 час при комнатной температуре в темноте.
    3. Аспирата вторичные антитела и промыть 3 раза с PBS.
    4. Мыть ячейки с разбавленным блокирования решения 5 раз за 5 мин на коромысле.
    5. Мыть 3 раза за 5 мин с PBS.
      Примечание: Этот протокол описывает использование анти мыши Alexa 647 конъюгированных вторичные антитела и анти кролик Alexa 647 конъюгированных вторичное антитело для Рисунок 2 и на рисунке 3, соответственно. Для маркировки одного белка, Alexa 647 является предпочтительным Флюорофор благодаря своей высокой Фотон игр (улучшает точность локализации) и низкой Скважность импульсов (улучшает временное разрешение) 8. Многие другие варианты вторичное антитело проспряганное Флюорофор, таких как Атто или Cy красители, доступны. Обратитесь к Демпси и др. 8 и Chozinski и др. 9 для всесторонней оценки пригодности несколько флуорофоров/красители для визуализации суперразрешением.

8. После фиксации (необязательный шаг)

  1. разбавить 50 мкл 50% GA 10 мл PBS для получения 0,25% раствор га. После исправления клетки для 10 минут в этом растворе при комнатной температуре.
  2. Мыть с PBS 3 раза за 5 мин на вращателе.

9. Хранение образцов

  1. хранить образцы в холодильнике (4 ° C) в контейнере алюминиевая фольга выстроились для защиты от света до изображений.
  2. Для длительного хранения образцов (до нескольких месяцев), хранить в PBS, содержащие азид натрия 3 мм для предотвращения роста бактерий.

10. GSD суперразрешением Imaging Photoswitching буфера подготовка

  1. подготовить очистки кислорода ' GLOX ' решение следующим образом:
    1. в трубку microcentrifuge 1,5 мл, добавить 12,5 мкл каталазы (штока 34 мг/мл), 3,5 мг оксидаза глюкозы и 0,5 мкл 1 М трис (рН = 8) до 49,5 мкл PBS.
    2. Vortex кратко, чтобы распустить компонентов в решение, а затем центрифуги на 20 800 g x 3 мин на 4 ° C.
      Примечание: были найдены решения, очистки кислорода, например GLOX, против Фотообесцвечивание. GLOX должны храниться в холодильнике до одной недели. Повторите шаг центрифуги каждый раз, когда он используется.
  2. Подготовить photoswitching заставить тиоловых решение следующим образом:
    1. для приготовления раствора β-mercaptoethylamine (MEA) 100 мм в PBS и изменить рН рН 8, или в качестве альтернативы использования β-меркаптоэтанол (βME). Хранить aliquoted MEA раствор в холодильнике (-20 ° C) до 1 недели.
  3. Непосредственно перед изображений, подготовить окончательный переключения буфера на льду, добавив тиоловых и очистки кислорода компонентов вместе. Для 500 мкл GLOX-МПС, добавить 5 мкл GLOX 50 мкл МПС (рН = 8) и 445 буфер солевой мкл (2,5 мл 1 М трис рН = 8, 29.22 мг NaCl (10 mM концентрации выпускных экзаменов), 5 г глюкозы и 47.5 мл воды). Кроме того, для решения GLOX-βME добавить 5 мкл GLOX 5 мкл βME и физиологическим 490 мкл буфера.
    1. Решения на льду сохранять и использовать по мере необходимости для монтирования образцы на стеклянных вставках депрессии.
      Примечание: Тиоловых содержащих решения, такие как βME или МПС побудить photoswitching на основе цианиновые красители например Alexa 647 10 или на основе xanthene красителей, например Alexa 568. ΒME производит лучшие результаты с Alexa 647, тогда как МПС является предпочтительным для Alexa 568 или когда 2 белков должны быть imaged с двойной маркировки подход, используя Alexa 568 и 647. Буфер будет ухудшаться в течение часов вследствие подкисления. Это приведет к сокращению в среднем Фотон количество образца. Чтобы предотвратить это, это целесообразно сделать свежий photoswitching буфера после 2-3 часа или если наблюдается снижение числа средняя Фотонная либо заметное расширение времени индуцированных photoswitching. Недавней статье описывается новый изображений буфер Ox-EA которые мы еще не тестировал, но по сообщениям экспонатов стабильным рН уровней в течение нескольких дней и выполняет лучше, чем GLOX многоцветные изображения приложения 11.

11. Установка образцов

  1. Горе coverslips с метками клеток (см. разделы 1-9) на депрессии слайдов, используя 100 мкл буфера изображений.
  2. Уплотнение края coverslip силиконовым клеем для предотвращения быстрого окисления визуализации буфера. Подождите несколько минут, пока Клей силиконовый полностью вылечил иначе coverslip будет дрейфовать когда imaging.
    Примечание: Силиконовый клей затвердеет, не если он вступает в контакт с βME. Будьте уверены, чтобы сухие края coverslip чтобы предотвратить обращение буфере визуализации Клей силиконовый.

12. Видеосъемка

  1. см. в таблице 1 для списка изображений параметры, используемые в рисунке 2 и рис. 3.
    1. , Чтобы начать, выберите соответствующий лазерный для освещения образца в зависимости от выбранного Флюорофор. SR-GSD системы, используемые в настоящем Протоколе оборудован мощных лазеров (488 нм, 1,4 кВт/см 2; 532 нм, 2,1 кВт/см 2; 561 Нм, 2,1 кВт/см 2 642 Нм, 2,1 кВт/см 2). Рисунок 2 используется 642 Нм лазер.
  2. Использовать объектив нефти погружения с высокой NA. SR-GSD система, используемая здесь оборудован HC PL АПО 160 X / 1,43 NA цель.
  3. Выбрал соответствующую дихроичных изображений куб. SR-GSD системы в этом протоколе оборудован 488 HP-T, 532 HP-T, 568 HP-T, 642 HP-T с выбросов полосовые фильтры 505-605 Нм, 550-650 нм и 660-760 Нм.
  4. Выберите режим 2D приобретения. Установите камеру в кадр передача режима и выдержка времени до 10 мс (100 Гц). Установите получить EM до 300. Выберите порог обнаружения.
    Примечание: Низкие пороги производят изображения с высоким фона. Высокие пороговые значения могут отфильтровать сигнал интерес. Определить порог, основанный на негативный контроль таких изображений coverslips не transfected клеток или клетки инкубировали с вторичное антитело только.
  5. Включите авто событие управления и набор событий для каждого изображения 8.
  6. Введите размер пикселя в закладке GSD-приобретение (Начните с 10 Нм или размер пикселя 20 Нм). Убедитесь, что " гистограммы режим " выбран на вкладке Инструменты GSD под параметры расчета высокое разрешение изображения до захвата изображений в.
  7. Изображение белков на плазматической мембраны, выберите режим TIRF и изменять угол падения для определения глубины проникания.
  8. Для отправки электронов в темной состояние (так называемый накачки), равным 100% интенсивности лазера.
  9. Выберите одной молекулы обнаружения во время перекачки и установить автоматически приобретать, когда рамка корреляции – 0.20.
  10. Для приобретения, установки лазерной интенсивности до 50%.
  11. Задать количество кадров приобретения до 60.000.
    Примечание: Следователь может оказаться, что пример требует более или менее кадры, чем это. Изменить количество кадров, базируется на показателях измерений Флюорофор Фотообесцвечивание и остановка приобретения когда никакие дальнейшие события обнаруживаются.
  12. Начать приобретение.
    Примечание: В начале приобретения, все молекулы красителя находятся в состоянии флуоресцентные и затем переключиться в состояние темно. Когда рамка корреляции достигает 0,20, изображения начнет быть приобретены. При обнаружении менее 8 события каждого кадра 405 лазер включается, поощряя флуорофоров переход от темного состояния в состояние земли. При приобретении изображений для набора n = x клетки из n = y животных, параметры, такие как TIRF глубина проникновения, порог обнаружения и количество кадров приобрела должен быть неизменным.

13. Анализ изображений

  1. для количественного определения белка размер кластера, используйте ' анализ частиц ' особенность ImageJ.
    Примечание: Дальнейший анализ может выполняться с помощью стохастических оптических реконструкции относительной локализации на основе микроскопии анализ (шторм-НПА) или аналогичных 13.
    1. Анализ кластера ( Рисунок 3) с помощью ImageJ следующим:
    2. Открыть файл изображения для анализа. Это должно быть 10 Нм гистограммы одной молекулы локализации карта, как генерация изображений программного обеспечения, описанные выше (раздел 12).
    3. Настроить яркость и контрастность для визуализации изображения: нажмите на изображение меню, выберите настройки, затем яркости и контрастности. Выберите параметр авто.
    4. Изменить тип изображения в 8-разрядный: выберите меню изображения, а затем выберите тип и выберите 8-битный.
    5. Установить масштаб изображения: Откройте меню analyze, щелкните Задать масштаб и введите следующие параметры: расстояние = 1, известный расстояние = 10, 1 пиксел = 10 Нм.
    6. Для выбора измерения, которые могут быть получены, откройте меню analyze, выберите набор измерений и установите флажок рядом с параметром области.
    7. Отрегулировать порог изображения. Открыть меню изображения, выберите Настройка, а затем выберите порог, выберите над/под. Перемещают указатель максимальное значение 255, а минимальное значение 1 и нажмите кнопку Применить.
    8. Для анализа частиц, откройте меню analyze, выберите анализ частиц. Установите флажок для выбора пиксельных единицах, отображения результатов и обобщения. Задайте размер в 4-бесконечность (поскольку резолюция ~ 20 Нм), выберите параметр голые контуры и нажмите кнопку ОК. Резюме файл будет создан, который будет содержать анализ детали, такие как средний размер кластера и количество кластеров на изображении.
      Примечание: Следует проявлять осторожность при делать выводы о количество белков в рамках конкретного кластера, как количество локализованных точек не коррелируется линейно с количество белков. GSD локализует красители, которые являются конъюгированных антител, привело связь ошибка, которая вытесняет флуоресцентные метки от эпитоп, > 10 Нм в любом направлении. Кроме того если используются Поликлональные антитела, более чем одного антитела можно связать один антиген и чтобы посрамить вопрос еще дальше, коммерческих среднего антитела являются спрягаются, в среднем, 3-6 молекулы красителя так один Флюорофор не всегда равны один белок. Связь ошибка может уменьшиться спрягать краска непосредственно на основное антитело (ликвидация вторичного) или с помощью маркировки на основе наночастицы схема 14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Как описано во введении, есть много различных суперразрешением микроскопии изображений условий. Этот протокол, фокусируется на GSD суперразрешением изображений. На рисунке 2 и на рисунке 3показаны представителя изображения и карты лока?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Недавний взрыв технологий, которые позволяют изображений за дифракционный предел предложили новые окна в сложности mammalian клетки сигналов в пространстве и времени. Эти технологии включают в себя буря, интереса, PALM, ГСД, SIM и их словоформы (например, dSTORM, FPALM). Изобретательность ученых ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы имеют не конкурирующие интересы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от AHA на R.E.D. (15SDG25560035). Авторы хотели бы признать д-р Фернандо Сантана для использования его 3D микроскоп Leica SR ГСД и доктор Йоханнес ада за любезно предоставление FP1 антитела.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
KOHThermo ScientificP250-500To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mmMarienfeld Superior0107032)To grow/process/image cells
10x PBSThermo ScientificBP3994Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-LysineSigmaP4832Aids with cell adhesion to cover glass
lamininSigma114956-81-9Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199Thermo Scientific11150-059Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995Gibco11995Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS)Thermo Scientific10437028Media supplement
Penicillin/streptomycinSigmaP4333Media supplement
0.05% trypsin-EDTACorning25-052-CLCell culture solution
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Transient transfection reagent
Ca2+-free PBSGibco1419-144Cell culture
100 % MethanolThermo Fisher ScientificA414-4Cell Fixation
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Cell Fixation
GlutaraldehydeSigma AldrichSLBR6504VCell Fixation
SEAblockThermo Scientific37527BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100SigmaT8787Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)GiftN/ACommercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFPRockland Inc.200-301-379Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)Invitrogen (Thermo Scientific)A31573Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen (Thermo Scientific)A11031Secondary antibody
Sodium azideSigmaS2002Prevents microbial growth for long term storage of samples
CatalaseSigmaC40Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidaseSigmaG2133Photoswitching buffer ingredient
TrisSigmaT6066Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochlorideFisherBP2664100Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanolSigma63689Photoswitching buffer ingredient
NaClFisherS271-3Photoswitching buffer ingredient
DextroseFisherD14-212Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slidesNeolab1 – 6293To mount samples
TwinsilPicodent13001000To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmidAddgene49155
Leica SR GSD 3D microscopeLeica
ImageJ
Washing block solution20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution1:1000 in PBS

Ссылки

  1. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
  2. Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  3. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  4. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  5. Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).
  6. Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302(2011).
  7. Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
  8. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  9. Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
  10. Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
  11. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).
  12. Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  13. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  14. Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
  15. Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
  16. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  17. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  18. Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129CaV1 2ERTIRFGSDIM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены