Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Резюме

Амилоидоподобные осаждения является отличительной чертой различных заболеваний и затрагивает множество различных органов. Этот документ описывает применение люминесцентных конъюгированных oligothiophene флуоресценции пятнать в сочетании с методами микроскопии флуоресцирования. Этот метод окрашивания представляет собой мощный инструмент для обнаружения и исследования белков агрегатов в клинических и научных установок.

Аннотация

Белки, которые депозит как амилоида в тканях по всему телу может быть причиной или следствием большого числа заболеваний. Среди них мы находим нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона болезнь, страдает прежде всего центральной нервной системы и системных амилоидоза, где амилоид A сыворотки, Транстиретин и легкие цепи IgG депозит как амилоида в печени, Кистевой туннель, селезенки, почек, сердца и других периферических тканей. Амилоид известны и изучены для более чем столетие, часто с использованием амилоида конкретных красителей, например красный Конго и Тиофлавин Т (ThT) или Тиофлавин (ThS). В этой статье мы представляем гептамер формил Тиофен уксусной кислоты (hFTAA) в качестве примера недавно разработанных дополняет эти красители, называется светящиеся конъюгированных oligothiophenes (LCOs). hFTAA проста в использовании и совместима с совместно окрашивание иммунофлюоресценции или других клеточных маркеров. Обширные исследования доказали, что hFTAA обнаруживает более широкий спектр болезни связанные белком агрегатов, чем обычные амилоида красители. Кроме того hFTAA также может применяться для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы разрешить исследования амилоида фибриллярных полиморфизма. В то время как изображений методология не является обязательным, мы здесь продемонстрировать гиперспектральных изображений (HIS), лазерная сканирующая конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений (FLIM). Эти примеры показывают некоторые методы обработки изображений, где LCOs может использоваться как инструменты, чтобы получить более подробные сведения о формировании и структурные свойства Амилоиды. Является важным ограничением в технику, для всех обычных оптической микроскопии методы, требование для микроскопические размеры агрегатов разрешить обнаружение. Кроме того агрегат должен состоять из повторяющихся β-лист структуры для привязки hFTAA. Чрезмерной фиксации и/или эпитоп экспозиции, что изменить статистическую структуру или конформации можно сделать бедных hFTAA привязки и таким образом создают ограничения для точных изображений.

Введение

Отложение амилоида в ткани является патологическим отличительной в число заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз системный и прионы заболеваний. Несмотря на распространенность заболеваний, связанных с амилоид и тот факт, что почти 40 различных белков до настоящего времени были классифицированы как амилоида прекурсоров в человека¹мало что известно о связи между амилоида осаждения и болезни фенотип. Гистология образцов от человека пациентов был использован как для диагностики и научных целях. Большое количество животных модели были созданы для изучения корреляции между амилоида бремя и поведение, продолжительность жизни и ряда других фенотипические чтения выходы болезнь прогрессии^2,3. Большие усилия предпринимаются также в лекарственных препаратах и дизайн в бой некоторых из наших наиболее опасается широко распространенных заболеваний. Однако оценка связи между генотипом, фенотип, амилоида налета нагрузки и медикаментов является не прямо вперед. Средства для окраски и обработки изображений из амилоида в ткани часто тупым и представить низким разрешением информацию о амилоида формирования и структуру.

Двойное лучепреломление Конго красный, ThT и тыс флуоресценции являются примеры классических методов для обнаружения и анализа амилоида бремя в образцах тканей от пациента биопсии и post mortem образцы и Животные модели болезни⁴. Эти методы были использованы на протяжении нескольких десятилетий (красный Конго с 1920 года и ThT и производных с 1960 года), и хотя инструментария был уточнен и позволяет для детального анализа, окрашивание процедуры анализа по-прежнему выполняются и так же, как почти полвека назад.

В настоящем документе мы описываем использование высокочувствительных Роман амилоида краситель, hFTAA⁵, что позволяет обнаружение малых незрелых белка месторождений с высокой точностью, а также обнаружения зрелых амилоид. По сравнению с обычными красками, hFTAA доказана обнаружить широкий спектр болезней связанных белков агрегаты^5,6,7. Кроме того hFTAA также может применяться для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы⁸. Здесь мы описываем, hFTAA окрашивание и анализ ткани от установленных животных моделей прионных болезни и амилоид β прекурсоров протеина (APP) трансгенных мышей предназначен для имитации развития зубного налета в болезнь Альцгеймера^9,10 . Мы также показать анализ диагностических и post mortem образцов от пациентов, страдающих от системного амилоидоз. LCOs имеют внутренние свойства, которые позволяет им сообщить о конформационных различия в рамках одного налета; и путем объединения двух LCOs с различными свойствами относительно привязки и флуоресценции, разница становится еще более очевидной¹¹. Помощью эпифлуоресцентного микроскопа оснащены фильтрами длинный пас и голова гиперспектральных камеры используется для включения объективной классификации спектральных свойств и записи микроскопии для спектрального анализа. Конфокальный флуоресцентной микроскопии с Перестраиваемый лазер в качестве источника возбуждения используется для оценки трехмерные свойства амилоидных бляшек в более подробно. Перестраиваемый лазер позволяет коллекции возбуждения спектра и шаг меньше выбор выбросов длин волн на микроскопе позволяет совместно изображений LCO флуоресценции и иммунофлюоресценции для определения совместного локализации целевого белка и амилоида. FLIM предлагает беспрецедентные чувствительность к конформационные различия навязаны LCOs и показывает различия, которые не могут быть обнаружены на спектры флуоресценции выбросов.

Основными целями с помощью описанных окрашивание метода являются для облегчения чувствительных обнаружения небольших амилоидоподобные залеми и характеризуют конформационного полиморфизма в пределах амилоидоподобные залеми. Это знание имеет важное значение для понимания основных заболеваний агрегации белков.

протокол

Примечание: синтез LCO выполнена в наших лабораториях для более чем десяти лет. По существу применяя протоколы для ароматического электрофильного замещения, палладий катализировано кросс муфта, амид сцепления и Эстер гидролиза, мы синтетически настроить зонды для различных целей ^{5 , 12}. после синтеза, характеристика и очистки, продукт LCO лиофилизированные и хранятся при комнатной температуре. Некоторые из зондов (среди них hFTAA) в настоящее время коммерчески доступных (см. Таблицу материалы).

1. LCO окрашивание раствора

Примечание: Если hFTAA приобретается у поставщика коммерческих, пожалуйста, следуйте поставщика ' s инструкции вместо раздела 1.

1. Ресуспензируйте лиофилизированные hFTAA в 2 мм NaOH подготовить раствор 1 мг/мл. Хранить запас в стеклянный флакон при 4 ° C. Акции могут быть сохранены на один год.
2. В день окрашивания, подготовить рабочее решение путем разбавления запасов мэм в фосфат амортизированное saline (PBS).

2. Подготовка образцов ткани

Примечание: многие типы тканей могут отражаться с использованием hFTAA как маркер амилоида. Смотрите Рисунок 1 примеры. hFTAA чувствительна к совокупных конформации. Окрашивание следует поэтому предпочтительно выполнять на бесперебойность агрегатов без выдержки epitope. Оптимального спектрального качества достигается, если фиксация ткани сведены к минимуму. Поэтому свежий замороженные материал, нежно фиксированной в этиловом спирте во время окрашивания, является предпочтительным. Однако это можно обнаружить амилоидные отложения также в ткани, которая была исправлена с например, формалин. hFTAA обычно проникает в ткань хорошо. Выберите толщину образца, который совместим с предполагаемой изображений техники.

1. Если формалин, parafinembedded, которые используются разделы, deparafinize в ксилоле на ночь. Окунитесь в разделах подряд бани 99% этанола, 70% этанол, dH ₂ O и PBS, 10 мин в каждой. Разрешить разделов ткани высохнуть атмосферных условиях.
   Предупреждение: Всегда ксилол обрабатывается в химической зонта. Ксилол и другие органические растворители вредны.
   1. Cryosections разморозить при комнатной температуре. Исправьте разделов ткани в формалина 10% на ночь и увлажняет путем погружения их в последовательных ванны 99% этанола, 70% этанол, dH ₂ O и PBS, 10 мин в каждой. Разрешить разделов ткани высохнуть атмосферных условиях.
2. Добавить капель hFTAA рабочего раствора (около 200 мкл) в разделах ткани для покрытия ее. Капелька должен оставаться на месте, поверхностного натяжения. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре для пятнать.
3. Промыть от окрашивания раствора с 500 мкл PBS с помощью пипетки и затем погрузите слайд в ванне PBS на 10 мин разрешить секции для просушки атмосферных условиях.
4. Крепление с помощью среднего монтажа флуоресценции. Разрешить монтажа средних поселиться на ночь.
   Примечание: hFTAA окрашивание может выполняться в сочетании с другими пятная методы, такие как иммунофлюоресценции, клетки или органеллы конкретных маркеры и т.д. Для выполнения совместно окрашивание, запустите полное окрашивание протокол выбора и добавить hFTAA окрашивание в конце, начиная с шага 2.2. Смотрите Рисунок 2 примеры. Для иммунофлюоресценции, желательно выбрать вторичное антитело, которое возбуждается на 640 Нм или выше. В этом диапазоне длин волн hFTAA не поглощают и следовательно не могут быть возбуждены и не будет флуоресцировать. Это гарантирует, что через кровь не видно между hFTAA и антитело.

3. Микроскопия

Примечание: используйте флуоресцентным микроскопом оснащены фильтрами длинный пас. Все параметры ниже были использованы для создания изображений на рисунке 4. Корректировка может потребоваться в зависимости от амилоидных образца типа и тканей. Хотя hFTAA привязан к амилоиду устойчив к отбеливанию, рекомендуется выключить источник света, когда образец не рассмотрены или отображаемого.

1. Его
   Примечание: эксперимент проводился с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с длинный пас выбросов фильтры и головка камеры для его (см. Таблицу материалы).
   1. Использовать стандартный флуоресцентным микроскопом оснащены длинный пас фильтры и гиперспектральных камеры. Убедитесь, что спектральные камеры откалиброван.
   2. В программном обеспечении, имя проекта, выберите " изображения спектральным " и начать приобретение.
   3. Выберите объект интереса через окуляр с помощью возбуждения 436-нм фильтра и сдвиг легкий путь к камере.
   4. В случае данных диспетчера (МЧР), выберите образец типа спектральных, Метки образца, и нажмите приобрести. Откроется окно приобретение.
   5. В окне приобретение " спектральных изображений ", откройте меню настройки, выберите свойства приобретения и спектральный диапазон равным 460-700, скорость-качество при максимальной скорости и измерения типа на газ/лазерная/узкие фильтры. Закройте диалоговое окно.
   6. В меню Изображение выберите живут полной. В баре иконы выключите полос. Выберите или размер региона изображение, которое имеет максимальное значение памяти ниже 800 МБ. Время экспозиции присвоено значение, которое дает яркость всего изображения между 1000 и 3000. В баре значки нажмите цветные камеры. Приобретение будут начало. После завершения загрузки изображений, нажмите сохранить в " приобретать спектральных изображений " диалоговое окно и " новой ячейки " в диалоговом окне Диспетчер данных варианта.
   7. От МЧР, откройте собранных изображение, используя кнопку начать анализ. Откроется окно данных анализа.
   8. Спектральные данные могут быть собраны из каждого пикселя изображения, выбрав с помощью диалогового окна спектральный дисплей ROIs. Выбрать " определить " и выберите команду трансформирования из соответствующих областей изображения,.
   9. Сохранить спектральные данные в текстовый файл, используя кнопку Lib. Сохраненный txt-файл можно импортировать любой анализ программного обеспечения по выбору. Файл .slb может использоваться для анализа в рамках программное обеспечение для анализа данных. Гиперспектральных данных куба из всего изображения могут быть также экспортированы как raw файла, как " слои как tif ", или как " слои в текстовом формате " для приложений анализа данных и изображения, с помощью внешнего программного обеспечения.
2. Конфокальная микроскопия
   Примечание: Конфокальный микроскоп оснащен Перестраиваемый лазер в качестве источника возбуждения. Для всех экспериментов выбросов флуоресценции, установите интенсивность лазера до 0,2% (соответствует средней мощности 3 мкВт), обскуры 1 блок Эйри, размер кадра до 1024 px x 1,024 px, скорость сканирования 7 и в среднем свыше 16 сканов и битовую глубину как 8 бит (см < s trong > таблица материалов). Эти параметры должны быть скорректированы для каждого индивидуального конфокальный системы, лазерный источник и образец типа.
   1. Для спектра излучения, собирать данные с помощью лямбда режим и возбуждения, с использованием аргона лазерные равным 488 нм. Соберите выбросов между 503 и 687 Нм, используя 22 каналов в детектор ВЗДОХ 32 канала. Установить коэффициент усиления до 755.
   2. Для достижения одного канала изображения, используйте смарт, настроить параметр. FITC (зеленый фильтр), установить коэффициент усиления до 750 и для Alexa 535 (красный фильтр) значение усиления 845.
   3. Для сбора спектра возбуждения с Перестраиваемый лазер, используйте возбуждения с 1 Нм шаги от 490 до 545 Нм при сборе выбросов между 551 и 586 Нм. Установка интенсивности лазера до 2% (соответствует средней мощности 30 мкВт) и выгода для 774.
   4. Для сбора Z-стека в спектральных режиме сканировать через глубина секции в шагах 0,96 мкм. Же параметры возбуждения и выбросов как шаг 3.2.1 может быть использованы, но установить коэффициент усиления до 730.
3. FLIM
   Примечание: Конфокальный микроскоп оснащен FLIM единица (см. Таблицу материалы).
   1. Настроить следующие параметры для confocal микроскопа: обскуры, 20; длина волны возбуждения, 490 Нм; лазерной интенсивности, 0,5% (соответствующий средняя мощность 7,5 мкВт). Используйте импульсных лазеров на 40 MHz.
   2. В FLIM программного обеспечения, Настройка фотон, считая более 550 Нм. В окне Параметры отображения выполните фотон, считая до Макс Кол около 4000 Фотон графов.
   3. Сохранить файл и экспортировать его как изображение SPC.
   4. Размещения данных 2-компонентные экспоненциального распада в FLIM программного обеспечения. Fit, которая дает χ ² < 2 это хорошо. Значение по оси y — количество счетчиков для данного жизни.
   5. Выберите порог для рассчитывает включить, например, 100. Цветовой код, T1 и выберите диапазон жизни. Распад зависит структура амилоида где hFTAA привязан. Наблюдались флуоресценции продолжительностей жизни между 300 и 1000 л.с. Сохранить файл.
   6. Экспорт необработанных данных, используя параметры экспорта и сохранить необходимые данные в новой папке.

Результаты

Чувствительных и селективного окрашивания амилоидоподобные залеми от большое количество белков во многих типах различных тканей из подопытных животных и человека пациентов жизненно важное значение для клинической диагностики, а также научных исследований. В этой статье, мы показываем, каким образом это может быть достигнуто с помощью LCOs, подтверждается hFTAA, для окрашивания и смешанных изображений амилоид от выбора типов тканей. С момента первой публикации на основе Тиофен амилоида лигандов более десяти лет назад¹³, амилоидных отложений, состоящий из ряда белков в различных тканях были образы с помощью LCOs^{6,7,11, 14,,1516} (рис. 1). В сочетании с антителами или других гистологические маркеров LCOs обеспечивают отличные инструменты для диагностики и научных целей (рис. 1a, рис. 2). С соответствующим выбором флуоресцентных маркеров несколько флуорофоров может быть imaged же разделе (рис. 1a, hFTAA и DAPI, Рисунок 2a hFTAA в иммунофлуоресценции установки). Это также можно использовать подряд разделы для окрашивания с использованием brightfield и флуоресценции (Рисунок 2Б, hFTAA и DAB Пятнать антитела). Недавно hFTAA было доказано быть весьма перспективным дополнением к Конго красное окрашивание в клинической диагностике^7,15 (рис. 3).

Разработка методы визуализации в последние десятилетия увеличилась потребность амилоида красителей, которые могут дискриминацию между минуту, но на же время глубокие различия в амилоидоподобные залеми в количественном выражении. Конъюгированные система в пределах LCO обеспечивает это с уникальной возможностью сообщить о вариации в режиме привязки. Скручивания молекулы может привести к искажению в углы привязки в системе конъюгированных и препятствуют транспорта электронов (рис. 4a). Это в свою очередь отражается на флуоресцентные свойства LCO волны возбуждения и выбросов и выбросов жизни. Мы используем его в вертикальном положении флуоресценции Микроскоп, оснащенных фильтрами длинный пас для выбросов. Для возбуждения и выбросов спектров в конфокальной микроскопии и FLIM мы используем LSM780 с импульсного лазера. Чтобы проиллюстрировать различные методы, мы образы один объект (бета амилоида (значения) доски в APP трансгенные мыши) (рис. 4В–e). Гиперспектральные спектры флуоресценции (рис. 4b) позволяет для оценки спектральной сдвигов и вариации интенсивности в различных регионах памятного знака. Спектра возбуждения в конфокальной микроскопии (рис. 4 c) может использоваться для определения оптимального возбуждения волны вниз по течению эксперименты, например, комбинация окрашивание с несколькими флуорофоров. Этот метод также может оказаться полезным для обнаружения конформационные различия в режиме привязки LCO. Спектр излучения в режиме конфокального может использоваться для определения свойства флуоресценции выбросов от hFTAA или сочетание нескольких флуорофоров для оценки colocalization в комбинации экспериментов с несколькими LCOs или LCO и иммунофлюоресценции комбинации. Флуоресценции жизни hFTAA очень повлияло на небольшие вариации в режиме привязки hFTAA. Таким образом FLIM является мощным инструментом в различении различия, навязанные hFTAA цели привязки (рис. 4 d). Это может использоваться для примера в дискриминации между различными прионных штаммов⁸. Конфокальный изображений и обработки Z-стеки в трехмерные изображения является полезным инструментом для изучения общей форме агрегатную амилоида (Рисунок 4e). Опять же использование дополнительных флуорофоров может помочь в понимании состав депозита.

Рисунок 1: различные типы и белки агрегатов ткани, показаны h ЗСТСЮА окрашивание: () Мэллори-Денк органы, состоящий из кератина агрегатов в печени (counterstained с DAPI), (b) r p62-позитивных включений в спорадических Включение тела миозит (s-IBM) мышечной ткани, (c) амилоида островка амилоида полипептид человека поджелудочной железы, мозга (d) лёгкие цепи амилоид иммуноглобулинов в кишечнике человека, почесуха (прионы) (e) овец в мыши, (f ) Тратить заболеваний (прионы) в мыши мозга, (g) значения бляшек в APP23 мыши мозга, хронические патологии (h) значения в APP/PS1 мыши мозга и (я) жира биопсии мазки из диагностических образцов Транстиретин амилоида в человека пациентов Градуированные 1-4 согласно стандартным Конго красный (CR) забил. Желтая области показывают hFTAA окрашенных амилоидоподобные залеми и синий аутофлюоресценция из жировой ткани. Длина шкалы бар указывается в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: примеры совместного окрашивания с антителами к. () совместно пятнать с амилоида белка сыворотки (AA) иммунофлюоресценции и hFTAA человека AA амилоид на том же разделе. Вверху слева: AA антитела выбросов 640 Нм; верхний правый hFTAA в 488 нм; Нижняя панель наложения изображения показаны colocalization в желтый цвет. (b) антитело пятная и hFTAA флуоресцирования на последовательных участках. Верхняя панель: AA Пятнать антитела DAB, Нижняя панель: hFTAA, отображаемого с помощью фильтра выбросов longpass. Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Сравнивая флуоресценции с фильтрами короткий пас на Транстиретин амилоида в сердце человека, окрашенных с Мейера гематоксилином/Конго красный (–d) и Мейера гематоксилином/hFTAA (e). () Brightfield изображение, (b) Brightfield + флуоресценции, (c) Brightfield + скрещенными поляризаторами, (d) Brightfield скрещенные поляризаторы, (e) hFTAA флуоресценции в 405 + флуоресцированияНм + 480 Нм возбуждения (подряд разделы –d). Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: свидетельствует тот же объект окрашивали hFTAA и образы с несколькими методами с использованием одного значения зубного налета в возрасте мыши APP23. () флюоресценция свойства hFTAA это продиктовано ее конформационного состояния. Показана структура hFTAA в состоянии плоские и витой. (b) гиперспектральных изображений для оценки непрерывного спектра излучения. Спектры в нижней панели имеют цветовую кодировку по штучной регионы интереса в изображении. (c) (i) Confocal изображений для возбуждения изображений и спектра (ii и iii) и выбросов изображений в режиме фильтра или (iv) спектральных. (d) флуоресценции жизни изображений для обнаружения конформационные различий в амилоида, где коротких продолжительностей жизни находятся на периферии значения зубного налета и жизни раз больше в центре доски. Гистограмма в нижней панели показано распределение времени жизни для всего налета. Изображения окрашен по шкале под гистограммой. (e) конфокальный Z-стек собраны в режиме фильтрации для отображения трехмерной структуры объектов. Длина шкалы бар указывается в каждой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Осаждения белков, они сложить в амилоид является ключевым событием многих процессов болезни. Внеклеточные амилоидных бляшек состоит из значения пептидов и внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, образованный hyperphosphorylated Тау находятся в головном мозге больных болезнью Альцгеймера. Спектр различных белков, например, Транстиретин (TTR), сыворотка амилоид A компонента (САА) и лёгкие цепи misfold IgG и манифест как амилоидоподобные залеми в тканях за пределами центральной нервной системы. Хотя амилоидных отложений были известны и изучал в течение более чем столетия, мы все еще не имеют детальное знание как амилоида осаждения инициируется на молекулярном уровне и что можно сделать, чтобы предотвратить этот процесс. Для болезни Альцгеймера это необходимо для подтверждения как процесс амилоидоз связан с нейродегенеративные. Один из ключевых квест на миссии для лечения амилоидоза является развивать Роман доработать инструменты для мониторинга амилоида посвящения, прогрессии и регрессии; Поэтому целевой амилоида обнаружения является ключевым. В долгосрочной перспективе клиническая диагностика выиграют от увеличения чувствительности и избирательности амилоида пятная методы^7,15. Текущие проблемы в этом отношении огромные и очень активные исследования области. Прогностическая диагностика один главный вопрос для клинической разработки и испытания. Эти болезни могут начать задолго до появления симптомов, но начать с лечения там должно быть выявление заболевания. Здесь чувствительность является ключевым аспектом для новых методологий. Кроме того эта проблема является еще более сложным, потому что некоторые агрегаты белка являются токсичными, некоторые защитные и некоторые нейтральные. Поэтому способность контролировать конкретные агрегированных Морфотипы важно, поскольку существование различных агрегированных видов было предложено объяснить гетерогенных фенотип, сообщил для разнообразия нейродегенеративных заболеваний агрегации белков. К примеру прионных белков является классическим примером того, как можно misfold идентичные первичной последовательности аминокислот в собственный совокупных Морфотипы, которые порождают конкретные прионных штаммов. Поступили также аналогичные полиморфизм для значения пептид, α-synuclein и Тау. В этой связи LCOs показали выдающиеся инструментами для оптического назначения различных агрегированных Морфотипы. Агрегатов китовая птичка штамм определенного белка, белка месторождений в нескольких типов системных амилоидоза, а также полиморфные значения и Тау агрегатов отличились благодаря конформационно индуцированных оптическое явление наблюдается от LCOs.

Амилоидоподобные осаждения является событием, которое происходит в тканях, которые трудно проникнуть с биохимические и биофизические методы молекулярной точностью. Возможность зонда события ex vivo, в естественных условияхи в пробирке с использованием же молекулы LCO почву для разгадке события, которые происходят в естественных условиях с использованием методов, которые только можно применять на ex vivo или в in vitro образцы^11,17. Структурная модель недавно сообщили высокой резолюции показывает, что LCO pentameric ЗСТСЮА (pFTAA) связывает в полости, образованные унифицированных боковых цепей параллельно оси волосики, охватывающих 6 в регистре параллельных бета стренги¹⁸, демонстрируя, что это можно получить атомной резолюции знаний о сущности LCO цели. В сущности режима привязки полости и привязки pFTAA похож на красный Конго¹⁹, продиктовано паз выстроились с повторяющиеся позитивные заряженных Lys боковой цепи. Сродство LCOs, как представляется, быть лучше по сравнению с Конго красный, вероятно, благодаря гибкости цепи и сильным ван-дер-Ваальса взаимодействия атомов серы Тиофен колец к полости гидрофобным. Обнаружение prefibrillar видов (до реагирует ThT)^5,20 появляется зависит от повторяющихся β листы, состоящий из-регистр параллель бета нити, которые для hFTAA, будучи два Тиофен единиц больше, чем pFTAA бы диапазона пересечения до 8 бета пряди.

Окрашивание протокол требует внимания к неисправности на следующие шаги: (i) фиксации: обширные фиксации образцов тканей может нарушить структуру амилоида и ограничить возможность обнаружить различия в спектры флуоресценции, вызванных конформационные искажения молекулы hFTAA. Мягкой фиксации cryosections от свежемороженые материал предпочтителен для достижения оптимального спектрального разрешения. Однако hFTAA пятен и флуоресцировать амилоида в фиксированных тканей, но с ограниченной эффективности и менее спектральных вариации. (ii) Epitope экспозиции: Предварительная обработка для достижения epitope воздействия для антитела связывая иногда может уменьшить способность для hFTAA для привязки из ткани нарушается структура амилоида. Если это является проблемой, и epitope воздействия представляет собой решающий шаг в антитело пятная протокол, с помощью последовательных секций для антитела и hFTAA, соответственно может рассматриваться. (iii) overstaining: hFTAA является чрезвычайно чувствительным. Рабочие решения должны храниться при низкой Нм концентрации. Уменьшение концентрации hFTAA, если фон окраски является проблемой. Если элементы, которые связывают hFTAA разреженные в ткани, избыток hFTAA можно агрегировать и накапливаются в средне-и монтажа. Это признается в качестве флуоресценции, которая не находится в фокальной плоскости самой ткани. Если это, как представляется, погрузите слайд монтируется в PBS до тех пор, пока крышка выскальзования может быть скользнул секции, мыть с PBS и ремонта с свежими монтажа средних и новое покрытие скольжения. (iv) фильтр на основе изображений: этот документ описывает основном спектрально решена флуоресценции изображений с помощью фильтров длинный пас или несколько обнаружения каналов. hFTAA также может контролироваться с помощью фильтров короткий пас. Имейте в виду, что это будет уменьшить контраст и упразднить возможности для обнаружения нескольких цветов.

За последние годы стало очевидным, что как исследовательские инструменты, флуоресцентный LCOs, и в частности hFTAA Показать весьма перспективным свойства. Результаты продемонстрировали для разнообразных белков и болезненных состояний, начиная от обнаружения hFTAA агрегатов внутри клетки (Тау, включение тела миозит), системных амилоид сыворотки амилоид A, Транстиретин, легкие цепи иммуноглобулинов (Каппа и лямбда) seminogelin 1, прионных белков (включая клинические образцы)²¹, полипептид амилоида островка и инсулина^7,15. Ограничивающим фактором для осуществления hFTAA как диагностический инструмент является что микроскопии флуоресцирования не широко используется в лабораториях рутинной амилоида патологии. Кроме того его не легко доступны в клинике. Однако hFTAA амилоида окрашивание и микроскопии флуоресцирования были использованы в клинических лабораториях в Микроскоп на основе флуоресценции фильтра и долженрассматриваться как бесплатный диагностический метод. Это недавно было продемонстрировано на запястья биопсии с Транстиретин амилоидоза, используя основные настройки для флуоресценции в автоматическом режиме²².

Кроме того помимо различных белков, hFTAA флуоресценции признает огромное разнообразие типов волосики и предварительно фибриллярного амилоида агрегатов, например, путь фибриллярного видов были обнаружены и характеризуется. В этом издании мы продемонстрировали один LCO на различных типах образца с помощью трех методов микроскопии. Использование контролируемых синтеза позволило также для развития LCOs для универсальный обнаружения биомолекулярных целей, например, записи взаимодействий поверхностного плазмон резонанс (СРП)²³ и radiolabeling Позитрон выбросов томография (ПЭТ)²⁴.

На сегодняшний день, были опубликованы более чем 25 различных LCOs с. Расширение использования LCOs для визуализации амилоидоподобные залеми увеличит знание и понимание как эти болезни связанные агрегатов собрать, разобрать и вмешиваться с органами и отдельными лицами, в которых они проживают.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako fluorescene mounting medium	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging
Spectraview software	ASI spectral imaging
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
FLIM system	Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514	Zeiss
Tunable Laser In Tune	Zeiss