Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Резюме

Этот протокол описывает пробирного Перевернутый вертикальных вторжения, которые могут использоваться для количественного определения миграции и вторжения возможности клеток в трехмерное обстановке при сохранении микроокружения клеток. Этот assay подходит для редких и/или чувствительных клеток.

Аннотация

Хотя были разработаны 3D вторжения анализов, задача по-прежнему изучать клетки без ущерба целостности их микроокружения. Традиционные 3D assays, такие как Бойден камеры требуют что клетки являются перемещенными лицами из исходного местоположения культуры и переехал в новую среду. Не только делает это нарушить клеточные процессы, которые являются неотъемлемыми для микроокружения, но это часто приводит к потере клеток. Эти проблемы особенно сложным, при работе с ячейками, которые являются редкими, либо чрезвычайно чувствительны к их микроокружения. Здесь мы описывают развитие assay 3D вторжения, который избегает обеих проблем. В этот assay клетки покрыты в рамках небольшой хорошо и ECM матрицы, содержащие хемотаксического укладывается поверх клетки. Это требует перемещения не ячейки и позволяет клеткам вверх вторгнуться в матрицу. В этот assay клетки вторжения, а также морфология клеток может быть оценена внутри гель коллагена. С помощью этого анализа, мы характеризуют инвазивного потенциала редких и чувствительных клеток; гибридных клеток результате сплавливание между клетками рака молочной железы MCF7 и мезенхимальных/Multipotent с стволовых/стромы клеток (Майкрософт) (MSCs).

Введение

Подвижности клеток это нормальный процесс развития и физиологических клеток. Однако изменения в структуре и способность клеток к миграции и вторгнуться связаны с патологических состояний, включая воспалительных заболеваний и рака метастазы^1,2,3. Метастазирование является вероятно наиболее плохо понимали аспектом в рак. Метастазировать, раковые клетки должны ухудшить дополнительных клеточных матриц (ECM), вторгнуться местные ткани и intravasate. Однажды в обращении раковые клетки будет распространять на дальних сайт, extravasate и формируют вторичные опухоли. Таким образом, способность клеток к разложению ECM, мигрировать и вторгнуться связано с их метастатическим потенциалом. Были разработаны различные подходы для анализа и количественной оценки миграции и вторжения возможности клеток. Наиболее часто используемые подходы включают ранозаживляющее пробирного, покадровой микроскопии и Бойден Пробирной палаты. Рану исцеления пробирного⁴ и время перерыва микроскопии являются простой и удобный анализов, которые дали бы предварительное представление о миграции клеток. Однако оба являются 2D анализов, которые не отражают 3D окружающей среды, в которой клетки существуют в естественных условиях. Исследования показали, что клетки реагируют по-разному в 3D среде, по сравнению с 2D^5,6. Кроме того трудно воспроизвести и давать количественные результаты^7,8,9анализов заживления раны. Assay клетки запретной зоны, который является 3D модификация ранозаживляющее пробирного, является более физиологически соответствующим методом, но это не подходит для ячеек низкого числа таких гибридных клеток результате клетки фьюжн события^10,11 .

Пробирная палата Бойден является 3-мерной assay, который предоставляет соответствующие микросреды для сотовых исследования. Однако он требует клетки быть удалены от их первоначального микроокружения и зачислены на верхней палаты Бойден пробирного системы для миграции и вторгнуться вниз к хемотаксического содержащие среднего. Этот 3D подход не подходит для анализа миграции и вторжения способность клеток подвержены их микроокружения и/или ограниченные в число^11,10,12. Новые подход для анализа миграции клеток и вторжение является microfluidic градиента палате пробирного¹³. Хотя подходящих и надежных исследований в миграции и вторжения, этот assay является более дорогостоящим и может быть технически сложных для типичной лаборатории. Мы опишем здесь простой Перевернутый вертикальных вторжения assay, который совместим со многими типами клеток, включая клетки, чувствительные к их микроокружения и/или ограниченного числа. Этот assay был адаптирован от протокола, предложенный Hooper et al. ¹⁴. в этот assay клетки остаются в их оригинальной микроокружения и их миграции и вторжения контролируется как они перемещаются вверх в гель коллагена, содержащий хемотаксического¹¹. Этот assay воспроизводимость и был оптимизирован и проверены в 35-мм культуры блюдо. Это могут быть адаптированы к условиям различных пробирного, включая различные клетки культуры размеров, различные матрицы или прочность адгезии и различные chemoattractants. Этот assay может служить в качестве платформы в пробирке для первоначальной проверки в процессе обнаружения наркотиков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Этот Протокол описан в Макардл и др. ¹¹. График приводится на рисунке 1.

1. Подготовка пластину культуры

1. Вымойте 35-мм культуры блюдо, содержащий 10-мм стекло дно с 1 мл раствора 1 М соляной кислоты (HCl) за 15 мин до снижения гидрофобность стекло дно.
2. Вымойте пластину культуры дважды с 1 мл фосфатный буфер (PBS) избавиться от всех HCl.
3. Вымойте пластину культуры дважды с 1 мл 70% этанола.
4. Промойте пластины культуры с 1 мл среды конкретной культуры клеток (здесь, использование α-MEM дополнена 10% тепла инактивированная FBS и несущественные аминокислот, 1%).
   Примечание: Пластину обработанных культуры, содержащий питательной среды могут храниться в CO₂ инкубатора с увлажнитель при 37 ° C до следующего дня.
5. Вырасти клетки (MSCs и MCF-7 совместно культура) обработанного стекла-внизу хорошо 35-мм культуры блюдо до 100% confluency. Совместное культуры 35000 MSC клетки и 75000 клеток MCF7 за 24 часа.

2. Подготовка гель коллагена

1. Храните микропипеткой советы, используется для пипетирования гель коллагена в морозильник, чтобы предотвратить полимеризации коллагена при контакте.
   Примечание: Это наиболее важный шаг.
2. Определить объем крысы хвост коллагена я использоваться основанные на концентрации запас коллагена. Подготовка 100 мкл гель коллагена для этот assay.
   Примечание: Высокая концентрация крысы хвост коллагена, который я фондовых работает лучше. Определите объем 10 x Дульбекко изменение орла средних и использоваться для разбавления коллаген соответственно.
3. Объединить на льду крысы хвост коллаген I (3.8 акций мкг/мл), 10 x Дульбекко изменение орла среднего и 1 x клетки культуры средних дополнена плода бычьим сывороточным 2% и соответствующие хемотаксического до конечной концентрации коллагена 2,4 мг/мл.
4. Добавьте в смесь 4,5% раствора бикарбоната натрия для нейтрализации гель коллагена.
   Примечание: Объем раствора бикарбоната натрия добавил может меняться в зависимости от точного pH других реагентов. Лучше всего проверить в смеси с рН полоски для обеспечения нейтрального раствора, или использовать показатель рН в среде культуры.
5. Положите 80 мкл коллаген смеси над клеток в стекло дно хорошо культуре тарелки.
6. Разрешить гель коллагена для полимеризации 30 мин в CO₂ инкубатор с увлажнитель при 37 ° C.
7. Покрытие гель коллагена с 2 мл среды клеток с сокращение сыворотке (2%) и инкубации клеток при 37 ° C в CO₂ инкубатора с увлажнителем, 24, 48 или 72 ч.
   Осторожностью: Пластины должны рассматриваться с осторожностью для предотвращения отсоединения от дна стекло гель коллагена.

3. пример составления коллагена гель с помощью запас коллагена хвост крысы 3.8 мкг/мл

1. На льду объединить 114.5 мкл крысы хвост коллагена, 16.6 мкл 10 x DMEM и 33,1 мкл питательной среды, содержащие хемотаксического.
2. Нейтрализовать коллаген смесь с 14.0 мкл бикарбоната натрия.
3. Продолжить как шаг 2,5.

4. imaging клеток

1. Осторожно извлеките из блюдо.
2. Аккуратно промойте гель с 1 мл раствора PBS.
3. Исправьте клетки с 1 мл раствора параформальдегида 4% за 15 мин.
4. Вымойте клетки дважды с 1 мл раствора PBS.
5. Пятно клетки с DAPI решение (100 нг/мл) для 20 мин при комнатной температуре.
6. Изображение клетки с помощью конфокального микроскопа в разных местах и принимая 400 мкм z стек изображений каждого местоположения в 16 мкм шагов. Микроскоп используется имеет диск сканирование блок, который позволяет конфокальная томография с использованием белый свет, источник возбуждения дуги. Используйте 20 X объектив используется с числовой апертуры 0,75.
7. Преобразовать изображения.
   1. Откройте изображения для данного геля (примерно 25 изображений) и создать стек изображений, щелкнув изображение → стеки → изображения в стек. Первое изображение соответствует нижней части геля (z = 0 мкм), второе изображение соответствует первый шаг в направлении оси z (z = 16 мкм), третье изображение соответствует второй шаг в направлении оси z (z = 32 мкм). Оценивать каждое ядро на каждой глубине изображение и определить глубину, на которой ядро был в наиболее резкого фокуса как глубина вторжения для этой конкретной ячейки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы использовали 35-мм культуры блюдо с стекла дно и крысы хвост коллаген я развивать и оптимизировать в пробирке с 3D вторжения анализа протокола. С помощью этого анализа, мы показали, что груди раковые клетки MCF7 и MSC клетки могут вторгнуться в гель коллагена в средне...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы описываем пробирного простой Перевернутый вертикальных вторжения, который удобен для различных типов клеток, включая клетки, которые являются редкими и/или зависит от их микроокружения. В этой 3D вторжения assay клетки остаются в их оригинальной микроокружения и покрыты гель кол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective