JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта рукопись обеспечивает протокол для анализа двухнитевые разрывы ДНК, иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.

Аннотация

Двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются серьезные повреждения ДНК. Анализ формирования и ремонт DSB актуальна в широком спектре областей исследований, включая целостности генома, генотоксичности, радиационной биологии, старение, рак и разработки лекарственных средств. В ответ на DSB гистон H2AX фосфорилированных 139 Серина в регионе несколько пар megabase, образуя дискретных ядерной очагов обнаружено в иммунофлуоресценции. Кроме того, 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другим важным DSB-отзывчивым белком, поощрение ремонт DSB nonhomologous конце-присоединиться к предотвращая гомологичная рекомбинация. Согласно конкретных функций γH2AX и 53BP1 совокупный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть разумный подход для детального анализа DSB. Эта рукопись предоставляет пошаговые протокол дополнена Методические заметки для выполнения метода. В частности влияние клеточный цикл на γH2AX очагов модели проявляется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF. Кроме того значение очагов γH2AX качестве биомаркера изображен в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека. Наконец генетическая нестабильность в CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемии расследуется иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1.

Введение

ДНК постоянно разрушен эндогенных (например, стресс репликации, реактивнооксигенных видов, внутренняя нестабильность ДНК) и внешних (например, химических радикалов, облучение) источников (рис. 1)1,2 ,3,4. Среди повреждения ДНК двухнитевые разрывы ДНК (DSB) являются особенно серьезных поражений и может вызвать смерть клетки или канцерогенеза. Около 50 ОУС могут возникнуть за5клеток и клеточного цикла. В клетках млекопитающих гомологичная рекомбинация (HR) и nonhomologous конце присоединение (NHEJ) разработан как основных путей для ремонта ДГЖД (рис. 2). HR происходит в конце S/G2 фазе и использует нетронутыми сестра хроматиды как шаблон для ремонта потенциально без ошибок. В сравнении NHEJ активным на протяжении клеточного цикла и потенциально мутагенных как пар могут быть добавлены или резецируется перед лигирование сломанной заканчивается. Кроме того альтернативные присоединения конца могут привлекаться в качестве механизма медленно мутагенных резервного восстановления в случае NHEJ дефицит6,7.

DSB побудить фосфорилирование гистон H2AX 139 Серина в регионе несколько пар megabase вокруг каждого DSB. Формируя ядерной очагов названы γH2AX очагов и поддаются обнаружению с помощью микроскопии иммунофлуоресценции8. ΓH2AX способствует набору далее DSB-отзывчивым белков и участвует в chromatin remodeling, репарации ДНК и трансдукции сигнала9. Как считается, что каждый γH2AX фокус представляют единый DSB, количественная оценка DSB, иммунофлуоресценции возможно, которая была продемонстрирована в рак клеточных линий и пациентов образцов10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (белок p53 привязки 1) является другой ключевой белок в посредничестве DSB ремонт. Он участвует в наборе DSB-отзывчивым белков, контрольно-пропускной пункт сигнализации и Синапсис DSB заканчивается15. Кроме того 53BP1 играет решающую роль в выборе пути ремонт DSB. Это вызывает ремонт DSB к NHEJ время HR16. С учетом подлинных функций γH2AX и 53BP1 в ремонт DSB одновременный анализ γH2AX и 53BP1, иммунофлуоресценции может быть полезным методом для точного анализа формирования и ремонт DSB.

Эта рукопись содержит пошаговые протокол для выполнения иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 в клеточных ядер. В частности техника применяется в нормальной фибробласты клетки линии NHDF, в рентгеновских облученных лимфоцитах здорового человека и CD34 + клеток у пациентов с острой миелоидной лейкемией. Подробности метода указано в контексте представленных результатов.

протокол

все методы, описанные здесь были одобрены II Комитет этики медицинского факультета Мангейма Гейдельбергского университета. Написанных информированное согласие было получено от всех лиц.

1. Подготовка материалов

  1. Стоковый раствор антикоагулянта: подготовить антикоагулянт Стоковый раствор 200 И.Ю гепарина на мл 0,9% хлорида натрия. Заполните каждый из коллекции трубок (рисовать объём 9 мл) с 2 мл антикоагулянт Стоковый раствор до вывода образцов крови или костного.
  2. Лизис решение для красных клеток: подготовка 10 x лизис решение для красных клеток с 82.91 г, аммония хлорида, бикарбонат аммония 7,91 g и 2 мл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота раствора для рН 8,0, растворяя агентов в Двухместный дистиллированной воды для общим объемом 1 л
  3. Фиксации решение: добавить 8.3 мкл раствором гидроксида калия 1 M параформальдегида (PFA) 360 мг в микротитровальных трубке. Заполните трубу с фосфатный буфер (PBS) до отметки 1 мл трубки и тепловых труб в блоке Отопление на 95 ° C для получения 1 мл раствора PFA 36%. Передать решение PFA 36% 1 мл трубку с объемом 15 мл. Добавьте 8 мл PBS в 1 мл 36% PFA решение, чтобы получить 9 мл 4% раствора запасов PFA. Алиготе, 4% раствор PFA и хранить при температуре-18 ° C до использовать для фиксации клеток.
    Предупреждение: 1) калия гидроксида раствор обладает коррозионными свойствами. Помните о защиты глаз и кожи. 2) PFA канцерогенами. Избегайте контакта с кожей и ингаляции. Приготовляют раствор фиксации под капотом.
  4. Permeabilization решение: добавьте 50 мкл Octoxinol 9 до 50 мл PBS для получения решения приблизительно 0,1% Octoxinol-9.
  5. Преграждая разрешение: подготовить 5% и 2%, блокирование решений путем смешивания агент блокирования белка с PBS и хранить в 6 – 8 ° с.

2. Подготовка образцов

  1. фибробластов в культуре клеток: культивировать фибробластов клетки линии NHDF в увлажненные 5% CO 2 атмосфера при 37 ° C в среде RPMI 1640 с 10% плода телячьей сыворотки, 4 мм глютамин и 1% пенициллина/стрептомицина.
    1. Подготовка микроскопа с сторонником фибробласты
      1. удалить носитель из колбу (район рост 75 см 2) с экспоненциально растет NHDF фибробластов. PBS на 10мл флакон. Мыть нежно адэрентных фибробластов, вручную встряхивая колбу за 1 мин
      2. Удаление PBS и добавьте 1 mL трипсина в колбу. Встряхните флакон осторожно, чтобы обеспечить охват всех адэрентных клеток трипсином. Удаление трипсина из колбы. Поставьте колбу в инкубатор для 5 минут при 37 ° с.
      3. Принимают настой из инкубатора и добавляют 10 мл RPMI 1640 среднего в колбу. Пипетка средних вверх и вниз несколько раз, чтобы разогнать фибробласты.
      4. Пипетка 0,3 мл дисперсной фибробластов на каждой из двух полей микроскопа и поставить слайд в инкубатор на 24 часа, так что фибробласты присоединиться к слайду. Для иммуноокрашивания γH2AX и 53BP1 в ядрах фибробластов, переходите к шагу 3.1.
  2. Пациентов образцов
    1. кровь образцов: использовать коллекции трубок, которые были заполнены с 2 мл раствора антикоагулянт запасов и добавить 7 мл крови в трубы. Храните образцы на ночь при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C). Следующий день, изолировать G0/G1 фазе покоя мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности (шаг 2.2.3).
    2. Образцы костного мозга: использовать коллекции трубок, которые были заполнены с 2 мл раствора антикоагулянт штока (шаг 1.1) и добавить 7 мл костного мозга в трубы. Храните образцы на ночь при комнатной температуре (т.е., 18-20 ° C). Следующий день, изолируйте G0/G1 фазе покоя мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности (шаг 2.2.3). Использование CD34 микрошарики и клеточной разделения столбцов для изоляции CD34 + клеток.
    3. Изоляции мононуклеарных клеток центрифугированием градиента плотности
      Примечание: Мононуклеаров изолированы от крови и костного образцы по плотности градиентного центрифугирования 17 , 18 , 19.
      1. Развести гепаринизированным крови в соотношении 1:1 с PBS и образца гепаринизированным костного мозга в соотношении 1:3 с PBS. Осторожно приостановить клетки путем их рисования и из пипетки в два раза.
      2. Добавить объем среднего градиента плотности свежего трубки. Аккуратно слой разбавленной крови или костного мозга на вершине средний градиент плотности. Будьте осторожны, чтобы не смешивать два слоя.
      3. Центрифуга трубки для 30 мин при комнатной температуре и 400 x g. снимать верхний плазменный слой с пипеткой. Затем тщательно урожай мононуклеарных клеток в слое над средний градиент плотности. Передача мононуклеарных клеток в свежий трубку.
      4. Добавить по крайней мере три тома PBS мононуклеарных клеток в трубе. Осторожно приостановите клетки путем их рисования и из пипетки в два раза. Центрифуга для трубки для 10 мин при комнатной температуре и 400 x г.
      5. После отжима удалить супернатант и добавляют 10 мл 4 ° C, 1 x лизис решение для красных клеток. Нежно ресуспензируйте клетки путем их рисования и из пипетки в два раза и поместить трубку на льду на 5 мин. Затем добавьте 30 мл PBS на 4 ° C и центрифуги трубки для 10 мин при комнатной температуре и 400 x г.
    4. Подготовка cytospins
      1. подготовить два cytospins с мононуклеарных клеток пациента образцов (то есть, один из cytospin для γH2AX иммунофлюоресценции окрашивания и один cytospin для γH2AX и 53BP1 комбинированный пятнать иммунофлюоресценции) центрифугированием (300 x g, 10 мин) 1,0 x 10 5 клетки для каждого приготовления ( рис. 3 и 4).

3. γH2AX и 53BP1 иммунофлюоресценции окрашивание

  1. фиксации и permeabilization: исправить клетки с 200 мкл 4% ПФА за 10 мин. После фиксации Вымойте клетки мягко три раза с 30 мл PBS для 5 мин на шейкере лаборатории. Затем разрушения клеток с 200 мкл 0,1% Octoxinol 9 10 мин мыть клетки мягко три раза за 5 мин на лаборатории шейкер с 30 мл 5% раствора и блокировки. Заблокировать ячейки в 30 мл свежего 5%, преграждая разрешение для 1 ч.
  2. Инкубации с антител
    1. инкубировать один подготовки клетки с моноклонального анти γH2AX антитела мыши (1: 500) и другой подготовки клетки с моноклонального анти γH2AX антитела мыши (1: 500) и кролика polyclonal антитела анти 53BP1 (1: 500) на ночь в отеле 4 ° C.
    2. После инкубации вымыть клетки мягко 3 раза с 30 мл 2% раствора и блокировки для каждого 5 мин на лаборатории шейкер.
    3. Удалить блокирующий решение и инкубировать первый подготовки клетки с анти мыши вторичное антитело проспряганное Alexa488 коза (1: 500) и второй подготовки клетки с (анти мыши вторичное антитело проспряганное Alexa488 коза 1: 500) и анти кролик вторичные антитела конъюгированных Alexa555 осла (1: 500) за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Среднего монтажа: слайд с клетками в миску и вымыть клетки мягко три раза для каждого 5 мин на лаборатории шейкер с PBS по 30 мл. Удаление PBS и смонтировать клетки с монтажа носитель, содержащий 4,6-diamidino-2-phenylindole. Осторожно положите coverslip поверх средства монтажа, так что нет пузырьков воздуха Встроенный. Подождите, по крайней мере 3 h для упрочнения среды монтажа до анализа клеток по микроскопии флуоресцирования.

4. Анализ γH2AX и 53BP1 очагов

  1. микроскопии флуоресцирования: анализ γH2AX и 53BP1 центрами в ядрах клеток с флуоресцентным микроскопом оснащены фильтрами для DAPI, Alexa 488 и Cy3 во время визуализации на объектив 100 X увеличение. Запись изображения с камеры и обрабатывать изображения с соответствующим программным обеспечением обработки изображений.

Результаты

Анализ γH2AX очагов в клетках является наиболее точным в фазе G0/G1 и G2 фазе, когда γH2AX очаги появляются как собственный люминесцентные точки (Рисунок 5A). В отличие от анализа очагов γH2AX клеток в S фазе осложняется дисперсной Пан ядерных γH2AX крапинками, вызва...

Обсуждение

Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 является полезным методом для анализа формирования и ремонт ДГЖД в широком спектре областей исследований. Критические параметры, которые влияют на результаты экспериментов являются фазы клеточного цикла, агенты, используемые для фиксации и permeabilization клет...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Проект был поддержан фондом немецкого Хосе Каррерас лейкемии (DJCLS 14 R/2017).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI mediumSigma-AldrichR0883Medium for cell culture
Heparin sodiumratiopharmPZN 3029843 Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%B. BraunPZN 1957154Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10XSigma-Aldrich59427CEnzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slidesThermo ScientificER-203B-CE24Microscope slides
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060 Tabletop centrifuge 
Cytospin device
LidHeraeus76003422Lid for working without micro-tubes
Cyto containerHeraeus75003416Cyto container with 2 conical bores
Clip carrierHeraeus75003414Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insertHeraeus75003417Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)Thermo Scientific85112Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1MMerck Millipore109107Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Fixation agent
Phosphate buffered salineSigma-AldrichD8537Balanced salt solution
ChemiblockerMerck Millipore2170Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)Merck Millipore05-636Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-304Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibodyInvitrogenA-11001Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibodyInvitrogenA-31572Secondary antibody
Vectashield mounting mediumVector LaboratoriesH-1200Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1Zeiss490035Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD cameraMetasystemsH-0310-010-MSCamera system for digital recording
Isis softwareMetasystemsNot applicableMicroscope software

Ссылки

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. . Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994)
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129H2AX53BP1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены