Гибкие измерение биолюминесцентных репортеров с использованием автоматизированной продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил)

Резюме

Генетически закодированный Люцифераза является популярным неинвазивные репортер экспрессии генов. Использование автоматизированных продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил) позволяет продольная запись от биолюминесцентных клетки под широкий спектр условий. Здесь мы покажем, как крокодил может использоваться в контексте исследований циркадные ритмы.

Аннотация

На основе Люцифераза Репортеры экспрессии клеточных генов широко используются для обеих продольных и концевой assays биологической активности. В исследованиях циркадные ритмы например, Будильник гена сплавливания с Светлячок Люцифераза давать надежные ритмы в клеточных биолюминесценции, которые сохраняются в течение многих дней. Технические ограничения, связанные с фотоэлектронный умножитель трубы (ПЛТ) или обычные методы, основанные на микроскопии, для количественной оценки биолюминесценции обычно потребовали сохранить клетки и ткани в довольно физиологических условиях во время запись, с компромисс между чувствительностью и пропускную способность. Здесь мы приводим уточнение предыдущих методов, позволяющий долгосрочные биолюминесценции изображений с высокой чувствительностью и пропускную способность, которая поддерживает широкий спектр условий культуры, в том числе переменной газа и контроля влажности, и который принимает много различных Культура ткани тарелки и блюда. Этот автоматизированный продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил) также позволяет наблюдать пространственные вариации в выражении Люцифераза через монослоя клеток или ткани, которая не может легко наблюдать традиционный методы. Мы подчеркиваем, как АЛЛИГАТОР обеспечивает значительно повышенную гибкость для обнаружения Люцифераза активности по сравнению с существующими методами.

Введение

Использование luciferases как журналисты экспрессии генов и белков деятельности стало популярным методом молекулярной и клеточной биологии исследований. Это верно в суточный области, где кинетика Светлячок Люцифераза синтеза и каталитического инактивации особенно хорошо подходят для продольной изменения в экспрессии генов, которые могут произойти в течение приблизительно 24 h суточного цикла отчетности. Таким образом Люцифераза работал репортером суточного в широком спектре организмов, в том числе грибов, растений, мух и млекопитающие-^1,-^2,-^3,-⁴.

При количественной оценке суточного ген выражение в пробирке, трубу фотоэлектронный умножитель (ПЛТ) обычно используется для записи биолюминесцентных сигнала. PMT-основе измерений имеют ограниченный гибкость однако обычно ограничивается размером заранее тарелку или на блюдо. Также невозможно собрать любой пространственной информации от образцов, контролируется с помощью ПЛТ, который может привести к потере информации при визуализации образцы, которые демонстрируют пространственной вариации в Люцифераза выражение. Кроме того как ПЛТ и электроника подвержены сбоям при контакте с увлажненной среде инкубатор культуры стандартной ячейки, продольные Люцифераза записи с помощью ПМЦ всегда выполняется в инкубаторы не увлажняется. В результате, клетки культуры блюда должны быть закрыты герметичным, чтобы предотвратить потерю влаги через испарение и средства массовой информации культуры поэтому должно помещаться в буфер с 3 - propanesulfonic кислоты (N- Морфолино) (МОПЫ) или 4-(2-гидроксиэтилкрахмала) -1- piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), вместо того, чтобы /bicarbonate CO₂, буферизацию системы, которая функционирует в естественных условиях и обычно используется в млекопитающих культуры ткани.

В результате этих ограничений измерения биолюминесценции в ПМЦ обычно ставит жесткие ограничения на условия, при которых клетки поддерживаются во время экспериментов. Для преодоления этих проблем, а также увеличить спектр возможных экспериментальных условиях, мы используем стандартный CO2/n₂ 170 L культуры ткани инкубатор, который был адаптирован путем добавления воды охлажденные электрон умножения зарядовой (EMCCD) Камера с оптикой анти туман и цифровой контроль температуры и газа уровнях. Это уже окрестили автоматизированной продольная газ Люцифераза Imaging и Temperature-Optimized рекордер или АЛЛИГАТОР. АЛЛИГАТОР позволяет существенно увеличить гибкость биолюминесцентных изображений, оба для высокой пропускной способности воображения стандартных тканевой культуры пластин (до 6 x 96 - или 384-ну тарелок одновременно) и также для нестандартных культуры ткани систем, такие как перфузии клеток, выращиваемых в microfluidic приборы. Этот инструмент также позволяет для изображений происходит в увлажненные условиях и с переменной управления CO₂ и O₂ парциальное давление, а также температура.

Ниже протокол описывает метод для биолюминесцентных записи mammalian клеток и тканевой культуры систем с использованием АЛЛИГАТОРА (далее «биолюминесценции инкубатор»). Следует отметить, однако, что эта система будет хорошо подходит биолюминесцентных изображений, а также, с некоторыми изменениями, флуоресцентных изображений, в ряде других биологических систем и контекстов.

протокол

1. Заполнение и температуры нейроволновой синхронизации клеток

Примечание: Этот протокол rigorously испытано с использованием первичных и увековечен мыши фибробластов, выражая протеин сплавливания PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC)⁴. Корректировка может потребоваться быть сделаны для экспериментов с использованием других клеточных линий.

1. До начала культуры клеток, место следующее в ванну воды 37 ° C тепло: фосфат буфер солевой PBS (PBS) (рН 7,4), дополнены 0,68 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота, рН 7,2 (PBS + ЭДТА), соответствующую ячейку культуры средств массовой информации, например, Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25% раствор трипсина.
2. Разбавить трипсина 1:3 с подогретым PBS + ЭДТА решения и возвращение в водяной бане.
3. Принимать настой² 125 см Люцифераза выражая клеток, которые на 70-90% вырожденная. Аспирационная средств массовой информации. Добавьте 10 мл подогретым PBS.
4. Аспирационная PBS. Добавьте 2.5 мл подогретым трипсина ЭДТА и вернуть колбу инкубатора 37 ° C за 5 мин.
5. Удаление ячеек из инкубатора и вид под микроскопом. Как только большинство клеток отделены от нижней части колбы, продолжать к следующему шагу. Если большинство клеток остаются прикрепленными к нижней части колбы, верните его в инкубатор, пока большинство клеток в суспензии.
6. Добавьте еще 7,5 мл стандартной ячейки питательной среды в колбу. При необходимости удалите 1 мл для дальнейшего прохождения клеток, как того требует этого.
7. Граф плотность оставшиеся ячейки с помощью Горяева и Трипановый синий. Разбавьте Кроме того, целесообразно для этой линии клетки клетки.
   Примечание: Для экспериментов ниже, между 6 x 10³ клеток/см² и 1 х 10⁴ клетки/см² 96-луночных тарелки, блюда 35 мм или канала слайды были посеяны PERIOD2::LUC фибробластов.
8. Семя клетки культуры ткани блюда или пластин, которые будут использоваться для записи.
   Примечание: Рекомендуется использовать черный двухсторонние, ясно дном пластин как это позволяет культуры здоровья оцениваться прежде записи во время снижения интерференции между скважин во время записи. Где биолюминесценции уровни являются крайне низкими, белый блюда/плиты следует использовать максимально легкие обнаружения, хотя пожалуйста обратите внимание, что фосфоресценция может привести к увеличение фонового сигнала, который сохраняется в течение нескольких часов.
9. Возвращение пластины в инкубаторе и позволяют монослои достичь 100% слияния (примерно 7 дней).
   Примечание: После того, как вырожденная, клеточных линий, которые тормозят контакт можно поддерживать до трех недель до экспериментов при том условии, что средства массовой информации обновляется регулярно (каждые 5-7 дней).
10. После того, как вырожденная, синхронизировать клеточных ритмов, используя прикладные температурных циклов (12 ч при температуре 32 ° C, 12 ч при 37 ° C) для как минимум 72 h непосредственно перед эксперименты^5,6 (с помощью запрограммированных Велоспорт инкубатор, контролируется компьютер подключен к инкубатор через последовательный порт RS-232).
    Примечание: Количество температурных циклов, необходимых для синхронизации клеточных ритмов может варьироваться от клеточных линий и может поэтому должны быть оптимизированы для других клеточных линий. Острой фармакологической стимуляции с помощью форсколин или дексаметазон ранее также использовались для синхронизации клеточных ритмов^7,8.

2. NS21 подготовка

Примечание: NS21 является дополнением сыворотки бесплатно для поддержания нейронов и других клеточных культур. Это уточнение аналогичные дополнения, известный как B27, который является коммерчески доступных и может использоваться как замена сыворотки во время записи суточного биолюминесценции⁹. Либо дополнение может использоваться взаимозаменяемо в носители для экспериментальных протоколов, описанные ниже. Это вполне осуществимым и экономически эффективным, чтобы сделать NS21 доме, как и Chen et al. ¹⁰и как описано здесь.

1. Сбалансировать всех компонентов, описанных в таблице 1 при комнатной температуре за 1 час до начала.
2. Растворяют 50 г альбумина bovine в 324 мл базальной среде (например, neurobasal) на льду. Перемешайте смесь как можно меньше.
3. Добавьте все остальные компоненты, помешивая минимально после каждого компонента, но все еще обеспечение тщательного перемешивания. Цель распустить все компоненты в течение 90 минут начала.
4. Алиготе окончательный смесь и хранить при температуре-20 ° C до тех пор, пока требуется. Избегайте повторного замораживания оттаивания циклов.
   Примечание: Смесь слишком вязким для фильтрации на данном этапе, но будет стерильным фильтроваться при разбавлении с СМИ перед его добавлением в клетки.

3. запись СМИ подготовка

Примечание: Основное преимущество биолюминесценции инкубатора над другое оборудование для записи продольной биолюминесценции, что, будучи состоянии увлажнить инкубатора и меняться парциальных давлений O₂ и CO₂, это можно использовать более широкий спектр средств массовой информации условия для записи биолюминесценции, включая условия, которые более тесно приблизительное физиологических нишу занимают разные ячейки видов в естественных условиях. Ниже мы рассмотрим разработку носители информации, адаптированный Гастингс et al. ⁹, который мы использовали регулярно с искусственного фибробластов и другие типы клеток. Во-первых, для условий запечатанном культуры (без газового обмена), и второй для физиологически соответствующих условий и должны использоваться с 5% CO₂увлажненные условиях.Многие другие варианты, возможно и целесообразно, в зависимости от точного применения и типа ячейки.

1. Подготовка СМИ MOPS-амортизированное высокие глюкоза
   Примечание: Stock раствор (1 Л): DMEM порошок (8,3 г/Л), 5 мг/мл глюкозы 0,35 мг/мл в бикарбонат натрия, , 0,02 М швабры, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл.
   1. Растворите порошок DMEM 8.3 g в сверхчистого 900 мл воды в цилиндре измерения 1000 мл и движение за 30 мин до тех пор, пока все частицы растворяются.
   2. Добавьте 50 мл раствора глюкозы (100 г/Л), 20 мл МОПЫ (1 М, pH 7,6), 10 мл 100 x перо/воспаление решение и перемешать еще 10 мин.
   3. Добавьте 4.7 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия и перемешать еще 5 мин.
   4. Отрегулируйте СМИ рН 7,6 (если при комнатной температуре) или 7,4 (37 ° C) с HCl/NaOH.
   5. Добавление ультрачистая вода для производства окончательный объем 1000 мл.
   6. Стерилизуют фильтрацией через 0,22 мкм фильтром и хранить при 4 ° C до тех пор, пока требуется.
   7. До экспериментов дополнение соответствующий объем Стоковый раствор 10% сыворотки, 2 мм L-аланил L-глютамин, 2% NS21 и 1 мм люциферин сделать запас рабочих. Пройти этот запас стерильного фильтра 0.22 мкм.
   8. Мера осмотического давления с помощью осмометре средств массовой информации.
      1. Включите осмометре.
      2. Калибровка осмометре, сначала с ультрачистая вода. Добавьте 50 мкл воды в нижней части измерительного сосуда. Убедитесь, что есть никаких пузырей в жидкости. Клип судна через зонд. Нажмите «Нуля» и осторожно опустите руку осмометре к самой низкой точке. Подождите, пока чтение является полным и зеленый «результат» горит до повышения руку и удаление судна.
      3. Повторите эти действия для калибровки осмометре до 300 mOsmol/кг, с использованием 50 мкл калибровочных стандарта. Нажмите «Cal» перед опусканием руку.
      4. Измерьте образца осмотического давления, добавляя 50 мкл СМИ в нижней части измерения судна и меру, как выше. Нажмите «пример» перед опусканием осмометре руку.
   9. Отрегулируйте осмотического давления до 350 mOsmol с использованием 5 M NaCl.
2. HCO₃-буферизуются низкий глюкозы СМИ (перфузии среды) подготовка
   Примечание: Stock раствор (1 Л): DMEM порошок (8,3 г/Л), бикарбонат натрия 3,7 мг/мл, 1 мг/мл, 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина.
   1. Растворите порошок DMEM 8.3 g в сверхчистого 900 мл воды в цилиндре измерения 1000 мл и движение за 30 мин до тех пор, пока все частицы растворяются.
   2. Добавьте 50 мл раствора глюкозы (100 г/Л), 10 мл раствора 100 x перо/воспаление и перемешать еще 10 мин.
   3. Добавьте 49.4 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия и перемешать еще 5 мин.
   4. Отрегулируйте СМИ рН 7,6 (при комнатной температуре) или 7,4 (37 ° C) с HCl/NaOH.
   5. Добавление ультрачистая вода дать окончательный объем 1000 мл.
   6. Передайте решение через 0,22 мкм стерильным фильтром и хранить при 4 ° C до использования.
   7. До экспериментов дополнение соответствующий объем раствора акций с 2% сыворотки, 2 мм L-аланил L-глютамином, 2% NS21 и 1 мм люциферин сделать запас рабочих. Пройти этот запас стерильного фильтра 0.22 мкм.
   8. Измерить и отрегулируйте осмотического давления до 350 mOsmol с использованием 5 М NaCl, как для швабры амортизированное СМИ.

Примечание: Концентрация люциферин следует определить эмпирически для каждого типа клеток и контекст. Для получения дополнительной информации см. Фини и др. ¹¹ сыворотки и NS21 (или B27, если используется) концентрации может изменяться в зависимости от приложения. Однако мы советуем что если эпирически тестирование показывает, в противном случае, сыворотки и NS21 (или альтернативного сыворотки бесплатные дополнения) использоваться, как они содействовать выживаемость клеток и привязанности. В клеточных линий, которые не контакт подавляют хорошо, это может быть необходимо снизить концентрацию сыворотки в носители информации для предотвращения смешанные эффекты распространения, которая способствует также сыворотки.

4. запись

1. Перед началом записи, место соответствующий запас СМИ рабочей (из шага 3.1 или 3.2 в зависимости от эксперимента) в ванну воды 37 ° C тепло.
2. Хотя средства массовой информации потепления, сфокусировать камеру в инкубаторе биолюминесценции.
   1. Открутить фильтр нейтральной плотности воды непроницаемый, подогревом и отложите в сторону.
   2. Установите программное обеспечение для записи видео с высоким приобретения стоимость. Нажмите кнопку «приобретение | Приобретение установки». Набор «Время экспозиции» 0.2 s и кинетические цикла времени до 0,3 секунды. Убедитесь, что получить EM выключен.
   3. Закройте окно «Приобретение установки» и нажмите значок «принимать видео».
   4. С помощью фокусировки цилиндр, поверните объектив камеры на полке в высоту быть записаны перечислены явно в фокусе в видео.
   5. Остановите видео, нажав на значок «Остановить видео».
   6. Винт с подогревом нейтральной плотности фильтра обратно в позицию; Неспособность сделать это приведет к повреждению EM-ПЗС-камеры или туманообразования цели из-за конденсации.
3. Установить желаемый экспериментальных условиях, с помощью панели управления на передней части биолюминесценции инкубатора CO₂, O₂и температуры.
   Примечание: Если выполнение перфузии клеточной культуры сразу перейти к разделу 5 на данном этапе.
4. Удалите ячейки из инкубатора культуры ткани и аспирата от средств массовой информации. Замените подогретым фондовой работы СМИ.
5. Если инкубатор биолюминесценции не увлажняется во время эксперимента, затем уплотнение блюда и тарелки с газ непроницаемый печатью.

Если инкубатор биолюминесценции должна быть увлажняется, то это не строго необходимо запечатать блюда, хотя это предпочтительно, чтобы запечатать блюда с небольшой объем, например, 96-луночных пластины, используя газопроницаемой печать, как небольшое количество испарения могут в противном случае по-прежнему происходят даже в увлажненные инкубаторы.
Примечание: Увлажнения достигается путем заполнения поддон на базе инкубатора.

Передача клетки в инкубатор биолюминесценции, закрыть дверь инкубатора и безопасных инкубатор покрытия в место форму свет герметичное уплотнение.

Выберите параметры записи для приложения.

1. Нажмите кнопку «приобретение | Приобретение установки».
2. В панели «Настройки камеры»: «Приобретение режим» к «Кинетической»; «Время экспозиции» для желаемого времени экспозиции, в секундах (см. Примечание ниже); «Накопления» 1; «Кинетического серии длина» количество циклов приобретения желаемого; «Кинетические цикла время» необходимый интервал обработки изображений (убедитесь, что это больше, чем время экспозиции); «Переход скорость» 4.33 µsecs; «Получить» 1; и 'EM получить ' до желаемого уровня (см. Примечание ниже)
3. В панели «Автосохранение» установите тип файла .sif или .tif. Указать имя файла и необходимости сохранения местоположение.
4. В панели «Очереди» Установите тип файла tiff. Указать имя файла и необходимости сохранения местоположение. Закройте окно Настройка приобретения.

Начните запись, нажав на кнопку «принять сигнал».
Примечание: Как биолюминесценции инкубатор может использоваться для большого числа различных клеток и тканей типов, все из которых будут иметь различные уровни биолюминесценции, выдержка, необходимые для сбора соответствующей биолюминесцентных сигнал будет варьироваться между эксперименты. Это также позволяет изменять электрон умножения (EM) получение изображений для того, чтобы увеличить масштабы сигнала собранные. Для новых приложений неизвестной яркости мы рекомендуем сначала принимая одно изображение с относительно короткое время экспозиции (около 10 минут) без EM выгоды и впоследствии регулировка времени экспозиции и EM получить до требуемой записи условия достигли. В большинстве случаев означает сигнал 10-20% от максимально возможной пиксель интенсивности для камеры является хорошим уровнем стремиться. После того, как будет достигнут соответствующий набор параметров записи, запустите продольной приобретения изображений, как описано выше.

5. перфузии тканей культура (опционально)

Примечание: Как описано во введении, инкубатор биолюминесценции подходит для визуализации систем нестандартных культуры ткани. Это проявляется в разработке системы для перфузии клеточной культуры.

1. Семя клетки на один канал слайды с Luer коннекторами с канала глубиной 0,6 и 0,8 мм, в среде DMEM с 10% FBS и пера/воспаление, как описано в разделе 1. Сделайте перфузии средства массовой информации, как описано в шаге 3.2.
2. До записи, подготовьте труб для системы требует перфузии, используя 1 мм внутренний диаметр (и.д.) ETFE труб и 1 мм и.д. Силиконовая трубка, локоть, самец и самка Luer арматура, как показано на рисунке 2А.
   Примечание: Большинство длины труб является ETFE труб, с разделами 2 см силиконовые трубки используется для подключения труб ETFE к Луер фитинги, которые впоследствии ссылку в канале слайды.
3. Стерилизация труб промывка с 70% этанола, а затем стерильной PBS.
4. Удаление клеточных культур в канал слайды из инкубатора. Аспирационная СМИ и заменить с подогретым перфузии СМИ.
5. 20 мл шприц заполняют подогретым перфузии СМИ.
6. Подключение трубки буфера слайд (см. Рисунок 2), но не содержащие клетки слайд и Очистка труб и слайд с перфузии СМИ (3-5 мл).
7. Подключите ячейки содержащих слайд и очистить всю систему с еще 1 мл средства массовой информации, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
8. Передача всей системы в инкубатор биолюминесценции.
9. Fit СМИ заполнены шприцы, шприц насос без отключения от труб и очистка еще 1 мл СМИ через всю систему, с помощью насоса для обеспечения там являются нет пузырьков воздуха в системе.
10. Задайте диаметр насоса, используемого шприца.
    Примечание: Для шприцы 20 мл, используемый здесь, диаметр-19.13 мм.
11. Установите скорость потока насоса до 50 мкл/ч и начало его работы.
12. Убедитесь, что существует никаких пузырей в любом слайды или трубы перед началом записи, как они будут влиять Люцифераза выражение, когда они проходят через монослое клеток. При необходимости, дальнейших флеш СМИ через ячейки для достижения этой цели.
13. Закройте дверцу биолюминесценции инкубатора и продолжить как шаг 4.7, чтобы начать запись.

6. лечение во время записи

Примечание: Иногда желательно лечить клетки на полпути через записи, будь то с фармакологическая или гормональными агентами. В таких случаях крайне важно, что клетки обрабатываются с осторожностью во избежание клеточной колебаний от сброса во время лечения. По этой причине это особенно важно сохранить клетки при постоянной температуре, как это основных воздухововлекающая Кий для сотовых циркадные ритмы^5,6.

1. Подготовка всех компонентов лечения до остановки записи.
2. Подготовить площадку химического изотермический при 37 ° C.
3. Остановить запись устройства, удалить блюда рассматриваться и место на площадке изотермический тепла.
4. Подарите культур как необходимые и возвращения биолюминесценции инкубатора в том же месте.
5. Вновь начните запись.

7. анализ

Примечание: Инкубатор биолюминесценции производит данные в виде серии отдельных изображений.Мы главным образом используют Фиджи¹² для управления эти изображения и затем экспортировать данные интенсивность средняя пикселей для каждого региона интересов (ROI) для дальнейшего анализа.

1. Откройте стек изображений в Фиджи и настроить яркость и контрастность, нажав «изображение | Отрегулируйте | Яркость/контраст» и регулировка скольжения баров до тех пор, пока изображения находятся в пределах соответствующего диапазона для просмотра биолюминесцентных сигнала.
2. Выберите области интереса, с помощью диспетчера ROI, доступных под «анализ | Инструменты | ROI менеджер».
3. Средний сигнал экспорта для выбранной области, нажав кнопку «Менеджер ROI | Более | Multimeasure».
4. Скопируйте полученные данные в программное обеспечение для анализа.
5. Вручную настройте время база данных для интервала времени изображений, (т.е., 15, 30 или 60 мин интервалами, описано как 0,25, 0,5 или 1 h) вместо того, чтобы номер изображения, предоставляемые Фиджи.
   Примечание: Дальнейший анализ теперь могут быть выполнены, например определение периода. Для этого следующее уравнение используется для выполнения-регрессионный анализ:
   
   где y — сигнал, x соответствующее время, m — градиент линии тренда, c является отрезок линии тренда, амплитуда-высота пика сигнала выше линии тренда, k — константа распада или скорость затухания (что 1 /k -это период полураспада), фаза является сдвиг в x косинус волны, и период является время, необходимое для полного цикла происходит¹³. Значение R² используется в качестве показателя Пригоняемые добра.  Возможны также другие методы анализа. Первые 24 ч приобретения должны быть исключены из анализа, как сотовой bioluminesence могут exhibit переходных, не суточного изменения в это время. Это в результате острой реакции на изменение средств массовой информации.

Результаты

Эта статья конспектирует протокол для биолюминесцентных изображений mammalian клеток с помощью АЛЛИГАТОРА (биолюминесценции инкубатора). Этот метод обеспечивает гибкость физической установки и внеклеточной условий при визуализации биолюминесцентных систем. Описаны методы для простых статических культуры ткани (рис. 1, дополнительное видео 1) и перфузии клеточной культуры (Рисунок 2, Дополнительные 2 видео), но много других установок может отражаться с использованием этой системы. Все данные были количественно с помощью методов, описанных в разделе 7.

Рисунок 1A показывает пример видео о биолюминесценции, запись от 6 x 96-луночных пластины, содержащие PER2::LUC фибробластов⁴. Внешний скважин не содержат клетки как это были не требуется для этого эксперимента. Клетки претерпели перепада температуры увлечения, whereby они проходят либо температуры цикл 12 ч, 32 ° c, после чего 12 h 37 ° C для 72 h или Конверс (12 ч, при 37 ° C, следуют 12 ч, при 32 ° C в течение 72 ч), прежде чем проходит в постоянной 37 ° C для записи. 60 мин воздействия были взяты каждый час. Два из этих условий являются количественно в рисунке 1B.

Рисунок 2A показана схема установки системы для перфузии культуры ткани. Это состоит из два канала слайды, связанных с трубки. Шприцевой насос по ячейкам управляется СМИ. Первый из этих слайдов действует как газа проницаемыми Пузырь ловушки (буфера слайд) и содержит не клетки, с второй содержащие клетки, от которых записывается биолюминесценции. Представитель, запись видео из этой системы показано на рисунке 2B. 15 мин воздействия были взяты каждые 15 мин. Здесь клетки поддерживаются в условиях стандартного перфузии или присутствии казеина ингибитора киназы PF670462, который ранее был показан удлинить суточного периода и уменьшить амплитуду будильник ген выражение ритмов в культурный ¹⁴mammalian клеток. Показано воздействие на PER2::LUC выражение в рисунке 2 c (Верхняя панель) против клетках, обработанных с такой же концентрации препарата в условиях культуры стандартной статической ячейки, показано на рисунке 2 c (Нижняя панель), с количественной оценки периода показано на рисунке 2D. Это ясно из этого что лечение с PF670462 влияет на выражение PER2::LUC под оба набора условий. Однако, в то время как клетки лечат PF670462 под перфузии условий шоу периода удлинение примерно 3 ч (3 ±0.9), клетки в статических условиях, получавших препарат показать существенн больше периода удлинение периода > 48 ч. Это может поместиться в затухающих косинус, как описано в разделе 7, (тест F загородный сумма квадратов по сравнению с прямой линии, p < 0.0001). Интересно, что величина удлинения периода под перфузии гораздо ближе к наблюдаемому в vivo¹⁴.

Рисунок 1: пример данных. (A) пример видео снимок биолюминесценции от увековечен PER2::LUC в 6 x 96 хорошо плиты в инкубаторе биолюминесценции. Скважин, чтобы быть количественно выделены желтым цветом в дополнительных видео 1. (B) количественная оценка биолюминесценции от а. Два комплекта 3 пластины клеток были увлекаемого с помощью температурных циклов (12 ч, при температуре 32 ° C; 12 ч при 37° C), которые были против фазовые друг к другу, производить напротив фазы экспрессии белков PER2 (n = 6, означает ± SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: перфузия с ингибиторами CK1δ. (A) схема системы перфузии. (B) пример видео снимок биолюминесценции, запись с PER2::LUC клетки под перфузии. Пример области количественной оценки выделена желтым цветом. (C) количественная оценка биолюминесценции PER2::LUC фибробластов под перфузии и в статических условиях и без 3 мкм CK1 ингибитор PF670462 (n = 3, означает ± SEM). Биолюминесценции нормализован минимальные и максимальные значения. (D) анализ периода (двусторонний ANOVA, холм-Sidak несколько сравнений тест).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Компонент	Окончательный средней концентрации (мкм)	Складе (мг/мл)	Для 400 мл NS21
Альбумина bovine	37	-	50 г
Каталаза	0.01	-	50 мг
Глутатион	3.2	-	20 мг
Инсулин	0.6	10	8 мл
Супероксиддисмутаза	0.077	-	50 мг
Холо трансферрина	0,062	-	100 мг
T3 (triiodo-L-thyronine)	0,0026	2	20 МКЛ
L-карнитин	12	-	40 мг
Этаноламина	16	Жидкости (1 g/ml)	20 МКЛ
D (+)-галактозы	83	-	300 мг
Путресцин	183	-	322 мг
Селенит натрия	0.083	1	280 МКЛ
Кортикостерона	0,058	2	0,2 мл
Линолевая кислота	3.5	100	0,2 мл
Линоленовая кислота	3.5	100	0,2 мл
Липоевая кислота	0.2	4.7	0,2 мл
Прогестерон	0.02	3.2	0,04 мл
Ретинола ацетат	0.2	20	0,1 мл
Ретинол, все транс	0,3	10	0,2 мл
D, L-альфа токоферол	2.3	100	0. 2 мл
D, L-альфа токоферола ацетат	2.1	100	0,2 мл

Таблица 1: Подготовка NS21.

Дополнительные видео 1: пример видео биолюминесценции от хорошо пластины. Пример видео снимок биолюминесценции от увековечен PER2::LUC в 6 x 96 хорошо пластины в инкубаторе биолюминесценции. Скважин, чтобы быть количественно, выделены желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные видео 2: пример видео снимок биолюминесценции, запись с PER2::LUC клетки под перфузии. Пример области количественной оценки выделена желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Протокол, описанные здесь является для культуры mammalian клетки, оба перфузии и статических условиях. Однако АЛЛИГАТОР может быть легко адаптирована к другим системам модель. Действительно это уже было показано обеспечивают отличную платформу для одновременный мониторинг передвижения, сна и периферийных ген выражение ритмы в Drosophila melanogaster под постоянной темноты¹⁵. Он также отметил, что, в зависимости от приложения, типы камер помимо упомянутых здесь могут быть уместными. Мы предполагаем, что с соответствующими фильтрами, модифицированную версию текущей настройки могут в принципе использоваться для флуоресценции количественной оценки.

Только приложения, для которых АЛЛИГАТОР может оказаться нецелесообразным являются те, для которых требуется особенно высокое пространственное разрешение, например изображений пространственно-временных Организации выражения PER2::LUC в organotypic ломтики млекопитающих Супрахиазмальное ядро, или других небольших тканей срезы.

АЛЛИГАТОР позволяет выполняться много экспериментов, которые до сих пор не были легко достижимо путем записи обычных методов. По сравнению с текущими методами для измерения биолюминесценции, АЛЛИГАТОР обеспечивает повышенную гибкость в тип клеток культуры блюдо или слайд, который может быть использован, условий внешних средств массовой информации, чувствительность и processivity.

Это особенно актуально в то время, когда есть отход от стандартные 2D клетки культуры моделей на 3D систем культуры органоид и потока. Таким образом предполагается, что АЛЛИГАТОР обеспечит адаптации метод, по которому биолюминесценции может быть измерена в течение многих дней и недель под широкий спектр условий.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021
Hyclone FetalClone III Serum	GE Healthcare	SH30109.03
Neurobasal medium	Thermofisher	21103049	basal medium
Bovine Serum Albumin	Sigma	A4919
Catalase	Sigma	C40
Glutathione	Sigma	G6013
Insulin	Sigma	I1882
Superoxide Dismutase	Sigma	S5395
Holo-transferrin	Calbiochem	616424
T3 (triiodo-L-thyronine	Sigma	T6397
L-Carnitine	Sigma	C7518
Ethanolamine	Sigma	E9508
D (+)-Galactose	Sigma	G0625
Putrescine	Sigma	P5780
Sodium Selenite	Sigma	S9133
Corticosterone	Sigma	C2505
Linoleic Acid	Sigma	L1012
Linolenic Acid	Sigma	L2376
Lipoic Acid	Sigma	T1395
Progesterone	Sigma	P8783
Retinol Acetate	Sigma	R7882
Retinol, all trans	Sigma	95144
D,L-alpha-Tocopherol	Sigma	95240
D,L-alpha-Tocopherol acetate	Sigma	T3001
Sodium Bicarbonate Solution	Sigma	S8761-100ML
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-038
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Galaxy 170R incubator	Eppendorf	CO17301001
Luciferin	Biosynth	L-8220
D -(+)-Glucose solution	Sigma	G8644-100ML
DMEM powder	Sigma	D5030
MOPS	Sigma	PHG0007
1 mm I.D. silicone tubing	GE Healthcare	19-4692-01
Elbow luer connector	Ibidi	10802
Male luer fittings	Ibidi	10826
Female luer fittings	Ibidi	10825
µ-slide luer I 0.6	Ibidi	80196
BD plastipak 20ml syringe	Becton Dickinson	300613
1mm I.D. ETFE tubing	GE Healthcare	18-1142-38
PF670462	Sigma	SML0795
B27 Supplement (50x)	ThermoFisher	17504044
iXon Ultra EMCCD camera	Andor	iXon 888
Fiji	ImageJ	N/A
Prism 7.0	Graphpad Software	N/A
Trypan blue	Sigma	T8154
Deltaphase Isothermal Pad	Braintree Scientific	39DP
Heated neutral density filter	Cairn Research	Custom item
Osmomat 030	Gonotech	Discontinued
300 mOsmol/kg calibration standard	Gonotech	30.9.0020
Measuring vessel	Gonotech	30.9.0010
Focusing cylinder	Cairn Research	Custom item
NE-1600 programmable syringe pump	Pump Systems inc.	NE-1600
Andor Solis Software	Andor	N/A