JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Низкий поле (L-band, 1,2 ГГц) электронного парамагнитного резонанса с использованием растворимых нитроксильных и trityl зондов продемонстрировала для оценки физиологически важных параметров в микроокружения опухоли в моделях мыши рака молочной железы.

Аннотация

Этот протокол демонстрирует возможности низкой поля электронного парамагнитного резонанса (EPR)-на основе методов в сочетании с функциональной парамагнитных зонды для обеспечения количественной информации о химической опухоли микроокружения (ТМЕ), включая p O2, pH, redox статус, концентрации интерстициальный неорганического фосфата (Pi) и внутриклеточных глутатиона (GSH). В частности, применение недавно разработанных растворимых многофункциональный trityl зонд обеспечивает непревзойденную возможность для в vivo параллельных измерений pH,2 pOи Pв E пространство xtracellular (Надежда зонд). Измерения трех параметров с помощью одного зонда позволяют их анализ корреляцию независимо от расположения датчика и время измерений.

Введение

Ключевую роль TME в прогрессии рака и терапии является все более высокую оценку1. Среди важных физиологических параметров TME в солидных опухолей, гипоксия тканей2, ацидоз3,4, высокое сокращение потенциала5, повышенные концентрации внутриклеточного GSH6,7, и интерстициальный Pi8 хорошо документированы. Неинвазивный в естественных условиях pO2, рН, Pi, GSH, редокс оценок и обеспечивают уникальное понимание биологических процессов в TME и помочь заранее инструменты для доклинических скрининга противораковых препаратов и TME-целевых терапевтических стратегий. Глубина проникновения разумные радиочастот в тканях, магнитно-резонансная томография (МРТ) и низкой поле ЭПР-методы на основе делает их наиболее подходящие подходы для неинвазивной оценки этих параметров TME. МРТ опирается главным образом на визуализации протонов воды и широко используется в клинических условиях предоставлять анатомические резолюции, но не хватает функциональной резолюции. Фосфор-31 ядерного магнитного резонанса (31P-NMR) измерения внеклеточной концентрации Pi и рН, основанные на сигнал от эндогенных фосфат потенциально привлекательным для характеризации TME, но обычно замаскированы несколько раз выше внутриклеточной Pi концентрации9,10. В отличие от этого ЭПР измерения полагаются на спектроскопии и изображений из специально разработан парамагнитных зонды для обеспечения функционального разрешения. Обратите внимание, что экзогенные ОРЭД зонды имеют преимущество перед экзогенных ЯМР зонды гораздо выше внутренняя чувствительность ОРЭД и отсутствия эндогенного фон ОРЭД сигналов. Недавнее развитие двойной функции pH и редокс нитроксильных зонда11 и многофункциональный trityl зонд12 обеспечивает непревзойденные возможности для в vivo параллельных измерений нескольких параметров TME и их анализ корреляции независимых датчика распределения и время измерения. Насколько нам известно существует без других методов, доступных для одновременно оценить в vivo физиологически важных химических TME параметров в живых субъектов, таких как pO2, рНe, Pi, окислительно-восстановительные и ГШ.

Датчики для В естественных условиях Функциональных измерения:

Рисунок 1 показывает химической структуры парамагнитные ПЭП, используется для доступа к параметрам TME, которые включают твердых частиц и растворимых зонды. Несколько преимуществ, которые делают частиц зонды, предпочтение растворимых зонды для в vivo оксиметрии ОРЭД являются высокая функциональная чувствительность, стабильности в живой ткани и минимальной токсичностью. Например твердых зонды увеличились раз удержания на месте ткани имплантантов по сравнению с растворимых зонды, позволяя для продольной измерения ткани pO2 в течение нескольких недель. С другой стороны, растворимые зонды превосходят частиц зонды, предоставляя пространственного разрешения измерений с помощью на основе ОРЭД методы визуализации, а также позволяя сочетанной анализов из нескольких функций (pO2, pH, Pi, редокс, и GSH).

figure-introduction-3625
Рисунок 1. Химические структуры парамагнитных преобразователей, которые собирают TME оценки пробирного. Это включает в себя частиц pO2 зонд, линк-BuO (R = - O (2CH)3CH3) и растворимых зондов: двойной функции pH и редокс зонд, NR; GSH-чувствительных зондов, RSSR; Многофункциональный pO2, рН и зонд Pi внеклеточного микроокружения, Надежда зонд. В условии ссылки 11,12был описан синтез этих датчиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

протокол

Все животные работа была выполнена в соответствии с протоколом WVU IACUC утверждения.

1. зонд синтеза и калибровка

  1. Твердых pO2-чувствительных линк-BuO зонд
    Примечание: Линк-BuO микрокристаллов синтезируется и подготовлен как описано в ссылка13. Они очень стабильна и может храниться при комнатной температуре на протяжении лет. ЭПР linewidth линк-BuO пробоотборника твердых частиц является pO2-чувствительных параметр. Линк-BuO микрокристаллов продемонстрировать идеальное линейную зависимость linewidth на концентрацию кислорода в диапазоне от анаэробных условий pO2 парциальное давление13, с ценностями внутренней линией в отсутствие до 760 мм рт.ст. кислорода и наклон зависимость кислорода (измеряется в мг/мм рт.ст.) слегка различные для различных пакетов микрокристаллита подготовки. Таким образом для каждого конкретного пакета требуется калибровка.
    1. Вешу 60 мг линк-BuO микрокристаллов.
    2. Для калибровки чувствительность кислорода приостановить микрокристаллы в 3 мл Дульбекко изменение орел СМИ (DMEM) среды (в концентрации 20 мг/мл) и sonicate за 5 минут на льду с зонда sonicator на 20 кГц с использованием 7 Вт мощности в 5-мл стеклянной трубки раунд снизу.
    3. Место 1 мл sonicated микрокристаллы в стеклянной трубки в резонаторе поверхности катушки L-диапазона (1,2 ГГц) ЭПР спектрометр и приобрести спектрам ЭПР непрерывной волны (CW) при физиологических температуре 37 ° C и кислорода концентрации 0, 1, 2, 4, 8 и 20,9%. Поддерживать концентрацию кислорода, восходящей решение с газовой смеси, доставлен из контроллера газ и поддержания температуры, с помощью водяной бане прилагается к термостату. Используйте следующие параметры приобретения ЭПР спектрометр: амплитуда модуляции, 100 мг; частота модуляции, 100 кГц; развертки ширина, 5 Г; развертки время, 60 s.
    4. Для достижения лучшего соотношения сигнал шум (SNR), используйте значение амплитудной модуляции 60% linewidth (например, использовать модуляции амплитуды 0.6 G для linewidth 1 G).
    5. Альтернатива упрощена процедура калибровки: запись спектров ЭПР в воздух пропускается и аноксии решения14. В последнем случае поддерживать аноксии в образцах с добавлением глюкозы 10 мм и 100 глюкозооксидаза ед/мл 1 мл зонд решения согласно ссылка14.
    6. Соответствовать спектрам ЭПР с функцией псевдоримановом найти ширину линии, дв. Оценивать чувствительность микрокристаллов pO2 как склоне зависимость LW pO2, а именно как значение (LWвоздуха−LWаноксии) /pO2Воздушный, где LWвоздуха и LWаноксии linewidth спектры в условиях воздуха и гипоксия, соответственно; p O2Воздушный = 152 мм рт.ст..
  2. Двойная функция pH и редокс зонд, NR
    Примечание: Зонд NR синтезируется, как описано в ссылку11. Он устойчив при комнатной температуре и как твердых, так и в водных растворах. Синтезированный зонд NR хранится при 4 ° C. Расщепление дескриптивное азота,Nи скорость распада амплитуда сигнала являются спектральных параметров датчика NR, которые чувствительны к рН (зонд pK = 6.6 при 37 ° C, диапазон чувствительности рН от 5.6 до 7,6) и снижения способности зонд микроокружения, соответственно.
    1. Удаление NR из морозильника и позволяют контейнеру нагреться до комнатной температуры (10-15 мин). Весят, 6.34 мг №, растворяют в 1 мл физиологического раствора и скорректировать рН 7,2 с небольшой аликвоты HCl или NaOH с помощью рН метр. Используйте приготовленный раствор NR (10 мм) как Стоковый раствор.
    2. Выполните калибровку рН зонд NR следующим (см. ссылку11). Во-первых добавьте 0,1 мл NR Стоковый раствор 0,9 мл 2 мм Na фосфатного буфера, 150 мм NaCl. Титруйте полученные 1 мм NR решение с аликвоты HCl или NaOH до требуемых pH с помощью рН метр. Контроль температуры с помощью водяной бане прилагается к термостату.
    3. Запись спектрам ЭПР образцов в 1,5 мл microcentrifuge труб с использованием L-band ЭПР спектрометр. Используйте следующие параметры приобретения ЭПР спектрометр: амплитуда модуляции, 2,5 Г; частота модуляции, 100 кГц; развертки ширина, 60 Г; развертки время, 20 s.
    4. Измерить сверхтонкая, разделение на постоянной (N) как половину расстояния между низким и высоким поля компоненты по спектрам ЭПР и заговор против рН, предоставлять Калибровочная кривая для ОРЭД L-диапазона измерения рН.
  3. GSH-чувствительных RSSR зонд
    Примечание: RSSR зонд синтезируется, как описано в ссылка15. Хранить синтезированный зонд NR при 4 ° C. Липофильных RSSR дисульфида biradical соединения легко диффундирует через клеточную мембрану реагировать с внутриклеточного GSH и обеспечить надежный подход для определения GSH в естественных условиях с помощью ОРЭД16,17. Этот метод основан на высокой реакции ставки преобладающим внутриклеточного пула GSH тиолов с RSSR зонда. Реакция RSSR biradical с GSH разбивает его дисульфидными облигаций (см. Схема 1) привело к отмене спин обмену между двух радикальных фрагментов и проявляется в уменьшении biradical спектральных составляющих и соответствующий увеличение monoradical компонентов. Для biradical RSSR зонд увеличение амплитуды компонента monoradical пропорциональна к концентрации GSH и является удобным спектральный параметр GSH-чувствительных ОРЭД. Для оценки концентрации GSH ОРЭД в естественных условиях измерений, предыдущей калибровки скорости реакции RSSR с GSH при соответствующей температуре и рН должна выполняться следующим образом.
    1. Удалить RSSR из морозильника и позволяют контейнеру нагреться до комнатной температуры (10-15 мин). Весят, 4.05 мг № и растворяют в 1 мл раствора ДМСО. Используйте приготовленный раствор RSSR (10 мм) как Стоковый раствор.
    2. Определите значение скорость постоянной, kobs, реакции RSSR с GSH желательно температуры и рН следующим образом.
    3. Во-первых, добавить 20 мкл раствора RSSR акций (10 мм) 0,98 мл 1 мм Na фосфатного буфера, рН 7,2, 150 мм NaCl, чтобы получить 0,2 мм RSSR зонд решение.
    4. Подготовка решений 1, 2 и 5 мм концентрации GSH в 0,1 М Na фосфатного буфера при рН 7,2. Для точной оценки концентрации GSH в клетках целевого органа в естественных условиях измерений, калибровки в пробирке должна выполняться при рН близок к значению внутриклеточный pH.
    5. Смесь равных объемов раствора RSSR 0,2 мм и одним из решений GSH, подготовленную на этапе 1.3.4. для окончательного концентрация зонда на 0,1 мм и GSH: 0,5, 1 или 2,5 мм.
    6. Сразу же после RSSR и ГШ решение смешивания Поместите образец в резонаторе ОРЭД и записывать спектрам ЭПР каждые 12 секунд на 10 минут. Затем вычислите Кинетика роста амплитуды спектральных monoradical. Используйте следующие параметры приобретения ЭПР спектрометр: амплитуда модуляции, 1 Г; частота модуляции, 100 кГц; развертки ширина, 60 Г; время развертки, 10-60 сек.
    7. Соответствовать Измеренная кинетика ОРЭД в monoexponents и рассчитать постоянная времени экспоненциального кинетики, τ. Линейная регрессия (1/τ = kobs × [ГШ]) обеспечивает постоянное значение Наблюдаемая скорость реакции между ГШ и RSSR (например, в 34 ° C и pH 7.2, kobs = 2,8 ± 0,2 М-1s-1)11.
  4. Многофункциональный Надежда зонд для pO2, рН и оценки Pi
    Примечание: Trityl monophosphonated, которую Надежда зонд синтезируется, как описано в разделе ссылки12 и хранится при 4 ° C. Спектрам ЭПР CW надежды на pH << pKa (- форма) и рН >> pKa (B - основная форма) представлены Дуплеты благодаря дескриптивное фосфора, колки,P. Типичный инструмент параметры заключаются в следующем: амплитуда модуляции, 37,5 мг; частота модуляции, 100 кГц; развертки ширина, 0,9 Г; время развертки, 20-60 s. При промежуточных значениях рН (5 < рН < 8) спектра ЭПР надежды зонда характеризуется квартет когда оба A и B государства присутствуют. Индивидуальный ОРЭД linewidth надежды является маркером2 pO (точность, ≈ 1 мм рт.ст.; p O2 диапазон 1-100 мм рт.ст.). Фракция протонированных Надежда (форма) является маркером pH в диапазоне от 6 до 8.0 (точность, ± 0,05). Протон обменного курса (выражается в мг) с Pi, добытых моделирование спектров значение Pi маркер (точность, ± 0,1 мм, диапазон, 0,1-20 мм). Калибровочные процедуры выполняются на физиологические температура (37 ° C), ионной силы раствора (NaCl, 150 мм) и надежда зонд концентрации 0,2 мм, как описано ранее в ссылки на12,18и подробно излагаются ниже.
    1. Удаление Надежда зонд из морозильника и позволяют контейнера, чтобы нагреть до комнатной температуры (10-15 мин).
    2. Весят, мг 10.7 надежды зонда, растворяют в 1 мл физиологического раствора и скорректировать рН 7,4. Добавить 20 мкл подготовленный раствор надежды (10 мм) до 0,98 мл физраствора получить 0,2 мм Надежда зонд решение.
    3. Для калибровки датчика рН Титруйте 0,2 мм Надежда зонд решения путем добавления небольшого количества NaOH или HCl, с окончательной разбавления образца менее 1%. Измерение pH с рН электрод, калиброванные при 37 ° C, с использованием значения рН для эталонного решения, рекомендованные, Национальное бюро стандартов (США). Используйте стакан с рубашкой реакции придают термостат тщательно поддерживать температуру ведения и титруемая решения во время измерения рН. Поддерживать бескислородные условия добавлением глюкозы 10 мм и 100 ед/мл глюкозооксидаза зонд решения.
    4. Приобрести спектрам ЭПР A и B форм при рН ≤ 5 и pH ≥ 8, соответственно, в анаэробных условиях при отсутствии фосфата.
    5. Используйте соответствующий спектры для получения внутренней спектральных параметров. А именно имитировать спектральной линии как свертка псевдоримановом функции с функцией Гаусса, моделирующей неразрешенные супер сверхтонкая структура Надежда зонда. Фитинга рассчитанных спектров ЭПР для экспериментальных спектров дает значенияP и псевдоримановом linewidth (ΔLpp), определяется уровень поперечной релаксации, 1/T2 (где 1/T2 = pp (√3/2) L для измеренных производной линии поглощения РФ в CW EPR) и linewidth распределения Гаусса, G.
      Примечание: Ниже перечислены параметры, полученные из спектры измерялись на условиях, указанных в шаге 1.4.2:P(A) = 3.63 G,P(B) = 3,37 Г; 1/Т2(A) = 23,6 мг; 1/Т2(B) = 9 мг; G(A) = 40 мг; G(B) = 45 мг (см. ссылку8).
    6. Приобрести спектрам ЭПР надежды при промежуточных значениях рН (5 < рН < 8). Имитировать поданной в высокий компонент приобретенных спектров ЭПР, с использованием теории обмена между несколькими сайтами в-сочетании или слабосвязанных системах адаптировано из19 ссылку как ранее описанных18. Использовать встроенные параметры, полученные для A и B государствам (см. шаг 1.4.5) для уменьшения числа переменных. Соответствовать расчетные спектры экспериментальными найти значения дроби (pA) и сюжет зависимость pA значение рН. Используйте зависимость pA на pH в дальнейших исследованиях как рН калибровочной кривой.
      Примечание: Фитинг рН зависимость pA с кривой титрования стандартных предоставляет значение диссоциации постоянной, pK (надеюсь) = 6,98. В в vivo исследований приобретения полной спектрам ЭПР Надежда зонда нецелесообразно из-за дополнительное время, необходимое для приобретения разрыв между низкой и высокой области компонентов дескриптивное фосфора, разделение спектра ЭПР. Таким образом в дальнейших исследованиях, свидетельствует только поданной в Верховный компонент спектра ЭПР были измерены и проанализированы.
    7. Для калибровки датчика pO2приобрести спектрам ЭПР Надежда зонда в различных концентрациях кислорода.
    8. Значения элементов управления pO2 решений по восходящей с газовой смеси доставлены из контроллера газ. Контроль температуры раствора (37 ° C) с помощью водяной бане прилагается к термостату.
    9. Моделировать спектрам ЭПР и подогнать их экспериментальными, как описано в шаге 1.4.6 для определения значений ставок кислорода индуцированной релаксации.
      Примечание: Значения кислорода индуцированной релаксации ставки были 0,49 мг/мм рт.ст и для A и B формы надежды зонд, как измеряется при 37 ° C8.
    10. Для калибровки датчика [п] приобрести спектрам ЭПР Надежда зонда в различных концентрациях фосфата. Используйте Надежда радикального решения с рН около pK (pK = 6,9 при 37 ° C)18 и титровать с различных концентраций фосфатов. Поддержания температуры и состава газа, как описано в выше шаги.
    11. Моделировать спектрам ЭПР и подогнать их экспериментальными, как описано в шаге 1.4.6 для определения значений Pi индуцированной обменного курса.
      Примечание: Зависимость [Pi] Pi индуцированной обменный курс используется как калибровки в дальнейших исследованиях.

2. мыши модели рака молочной железы

  1. MMTV-PyMT спонтанные опухоли модель
    1. Используйте 4-8 недели-старая женщина друг вирус типа B восприимчивость/низ (FVB/N) мыши молочной железы опухоль вируса промоутер (MMTV) polyoma среднего T антигена (PyMT +) мышей с спонтанно сформированных опухолях молочной в vivo исследований ОРЭД.
    2. Для сравнения микросреды ткани нормальный молочные железы и опухолей используйте соответствует возрасту помёте самки дефицит в PyMT онкогенов (PyMT−, «дикий»)20.
    3. Тема мышей для L-band ЭПР спектроскопии один раз в неделю в течение четырех недель во время анестезии изофлюрановая (см. зонд поставка ниже).
    4. Анестезировать мыши, используя смесь воздуха изофлюрановая (3% изофлюрановая) и поместите указатель мыши на регулируемый стол в правой, боковые позиции с опухолью (молочных желез) близко к поверхности катушки резонатора.
    5. После размещения мыши администрирование зонда путем инъекций intratissual (и.т.), настроить ЭПР спектрометр и приобрести спектрам ЭПР для 5-10 мин.
    6. Мера 2-3 опухоли молочных желез (от MMTV-PyMT + мышь), или не опухоли молочных желез (от PyMT− мышей) в ходе той же сессии ОРЭД.
  2. Модель ортотопическая MET-1 опухоли
    1. Расти FVB/N фон Met-1 мышиных груди раковые клетки при 37 ° C, 5% CO2и 95% относительной влажности в среде DMEM, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 10 мкг/мл инсулина, rhEGF 5 нг/мл и 1% СРП (пенициллин G натрия, Стрептомицина сульфат и амфотерицин B) ~ 80% слияния в T175 колбу.
    2. Аспирационная СМИ и промойте адэрентных клеток с 10 мл PBS (1.54 mM х2PO4, 155 мм NaCl и 2.71 мм Na2HPO4-7 H2O без хлорида кальция или магния хлорид, pH = 7,4).
    3. Отсоедините клетки, добавив 5 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА и тряся колбу. Когда клетки отсоединены, добавляют 10 мл DMEM, содержащие 10% FBS в колбу и собирать клетки.
    4. Центрифуга суспензию клеток в 132 x g 10 мин при 4 ° C. Подсчитать ячейки, используя Горяева и Ресуспензируйте 1 х 106 клеток / 100 µL минимальным DMEM.
    5. С помощью шприца инсулина (игла сметы 1/2), медленно придать 100 мкл суспензии клеток опухоли молочной железы жировых отложений номер 4 8-недельных женские мышей дикого типа FVB/N.
    6. Контролировать опухоль начала при пальпации (появляются после приблизительно 2-3 недели), рост (визуальные) и мышь хит (визуально) каждый день.
    7. Измерение размеров опухоли один раз в неделю, при помощи штангенциркуля и определить объемы опухоли с помощью уравнения:
      figure-protocol-16531

3. зонд поставка в естественных условиях функциональных измерений

  1. Использование твердых линк-BuO зонд (протокол I) для ро2 измерений в модели ортотопическая опухоли путем имплантации опухолевых клеток с внутренним линк-BuO микрокристаллов ранее описанных14,21 и подробно ниже.
    1. В случае опухоли модель MET-1, для интернализации линк-BuO микрокристаллы в МЕТРОПОЛИТЭН-1 клетки приостановить линк-BuO микрокристаллы в среде DMEM в концентрации 20 мг/мл и sonicate с sonicator зонд на 20 кГц с использованием 7 Вт мощности в 5-мл стеклянной трубки раунд снизу за 5 минут на льду.
    2. Добавьте 100 мкл (2 мг линк-BuO) подвески T75 флакон с 10 мл культуральных сред, содержащих MET-1 клетки (около 30% притока). Все процедуры проходят в кабинете биобезопасности и средства массовой информации содержит пенициллина и стрептомицина для сведения к минимуму потенциальной инфекции.
    3. Инкубировать клетки при 37 ° C за 72 ч или до тех пор, пока они достигают ~ 80% confluency.
    4. Аспирационная средств массовой информации. Вымойте клетки пять раз с 10 мл PBS. Отсоедините клетки с 5 мл трипсина ЭДТА. Соберите клетки. Центрифуги, как описано выше в шаге 2.2.4. Пятно образец клеток с красителем исключения для определения жизнеспособности клеток и количество.
    5. Приостановить клетки в концентрации 1 x 10-6 на 100 мкл минимальный DMEM.
    6. С помощью шприца инсулина, медленно вводить 100 мкл суспензии клеток, содержащих внутреннюю линк-BuO микрокристаллы в число 4 молочной жировых отложений из 8-week-old мышей дикого типа женского FVB/N как описано в шаге 2.2.5.
    7. Контролировать опухоль Воникновение и распространение, как описано в шагах 2.2.6 и 2.2.7.
  2. Использование твердых линк-BuO зонд (Протокол II) либо спонтанным или ортотопическая модели. Inject линк-OBu микрокристаллов на сайте интереса, например, в нормальных молочных желез или опухолях молочной, используя шприц инсулина.
  3. Растворимые зонды
    1. Анестезировать мышей при вдыхании воздуха изофлюрановая смеси (доставки 1,0 Л/мин и 2-3% изофлюрановая) с использованием анестезии машины и поместите их в разрыв ЭПР спектрометр.
    2. Настраивать инструмент, а затем придать NR (10-30 мкл, 10 мм), Надежда зонд (10−30 мкл, 0,5-2 мм) в солевой раствор, рН 7,2 или RSSR зонд в ДМСО (10 мкл, 10 мм) решения (и.т.).

4. в естественных условиях функциональных измерений

  1. Для ОРЭД Спектроскопические измерения, анестезировать мышей при вдыхании воздух изофлюрановая смеси с помощью анестезия машины, как описано в шаге 3.3.1.
  2. Выполнение функциональных измерений с использованием L-диапазона (1,2 ГГц) ЭПР спектрометр следующим образом.
    1. Поместите резонатор поверхности катушки на нормальной молочной железы или опухоль молочной железы и настраивать спектрометр.
    2. Приобрести спектрам ЭПР от имплантированных частиц зонд для 5−10 мин в течение нескольких недель после имплантации. В случае растворимых зонды приобрести спектрам ЭПР сразу же после введения зонда для 5-10 мин.
    3. Анализ спектров ЭПР NR зонда найти сверхтонкая, колки,Nи амплитуда сигнала, I(t). Преобразуйте значениеN в значение пэ-аша с помощью калибровочной кривой, полученной на шаге 1.2.4. Проанализировать скорость распада амплитуды сигнала I(t) как относительное изменение от первоначального амплитуды, I(t = 0), рассчитанного в произвольных единицах в секунду (s-1).
    4. Установите увеличение компонента monoradical спектра ЭПР GSH-чувствительных RSSR зонда для monoexponents для получения постоянной времени экспоненциального кинетики для расчета концентрации GSH.
    5. Соответствовать спектрам ЭПР высокой поле компонента многофункциональный Надежда зонда к экспериментальной, как описано в (шаг 1.4.5) для получения значений рН, pO2 и Пи.

5. Статистический анализ

  1. Выполните обработку данных и статистического анализа. Используйте тест корреляции r Пирсон (для нормально распределенных данных) и Спирмена в ранг порядок корреляции (для наборов данных с отклоненных нормальности распределения данных) для анализом корреляции.

Результаты

Ткани p O 2 Оценка с использованием линк BuO зондов:

С помощью процедуры, описанной в разделе Шаг 1.1, мы провели калибровка свежеприготовленные линк-BuO микрокристаллов подвеска.

Обсуждение

Представленные методы позволяют для неинвазивной в естественных условиях оценки критических параметров химического ТМЕ, а именно pO2, рН, окислительно-восстановительного состояния и концентрации интерстициальных Pi и внутриклеточного GSH. Магнитный резонанс методы, таки...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа частично поддерживается NIH предоставляет CA194013, CA192064 и U54GM104942. WVCTSI признается для запуска ВВК, AB, и TDE. Авторы благодарят за помощь с иллюстративным экспериментов доктор м. Gencheva и K. Steinberger. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения NIH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
L-band EPR spectrometerMagnettech, GermanyL-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
 Temperature & Gas Controller Noxygen, GermanyTemperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition  
SonicatorFisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced)Sigma-AldrichG4251
MMTV-PyMT  miceIn house
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Met-1 murine breast cancer cellsIn house
C57Bl/6 wild type mice Jackson Laboratory
TrypsinThermo Fisher Scientific25200056
Trypan Blue Exclusion Dye Thermo Fisher ScientificT10282
Ohmeda Fluotec 3 
Isoflurane (IsoFlo)Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasicSigma-AldrichS9763
Sodium phosphate monobasicsigma-AldrichS07051
Sodium Chloridesigma-AldrichS7653
Hydrochloric acidsigma-Aldrich320331
Sodium Hydroxidesigma-AldrichS8045
Glucosesigma-Aldrich
Glucose oxydasesigma-Aldrich
Lauda Circulator E100Lauda-Brikmann
pH meter OrionThermo Scientific 
LiNc-BuO probeIn houseThe Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probeIn houseThe Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probeIn houseThe di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probeIn houseThe monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12

Ссылки

  1. Siemann, D. W. . Tumor Microenvironment. , (2011).
  2. Tatum, J. L., et al. Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy. Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).
  3. Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. Hypoxia signalling controls metabolic demand. Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).
  4. Haulica, A., Ababei, L. Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours. Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).
  5. Matsumoto, K., et al. High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).
  6. Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. Glutathione in cancer biology and therapy. Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).
  7. Voegtlin, C., Thompson, J. W. Glutathione content of tumor animals. J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).
  8. Bobko, A. A., et al. Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression. Sci Rep. 7, 41233 (2017).
  9. Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers. IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).
  10. Gade, T. P., et al. Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors. Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).
  11. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).
  12. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques. JACS. 135, 5904-5910 (2013).
  13. Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. Free Radic Biol Med. 35 (9), 1138-1148 (2003).
  14. Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models. Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).
  15. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  16. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe. Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).
  17. Khramtsov, V. V., Zweier, J. L., Hicks, R. . Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds. , 537-566 (2010).
  18. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment). Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).
  19. Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. . Practical NMR spectroscopy. , (1980).
  20. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  21. Eubank, T. D., et al. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages. Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).
  22. Khramtsov, V. V., et al. Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method. Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).
  23. Komarov, D. A., et al. Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes. Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).
  24. Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin. Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).
  25. Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment. Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).
  26. Samouilov, A., et al. In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe. Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).
  27. Goodwin, J., et al. In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation. NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133nitroxidetrityl

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены