JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот документ представлен метод синтеза и характеристика ориентации Моноцит пептидные Амфифильность мицелл и соответствующий assays для проверки на биосовместимость и мицеллы возможность связывать моноцитов.

Аннотация

Атеросклероз является крупный вклад сердечно-сосудистых заболеваний, ведущей причиной смерти во всем мире, который утверждает 17,3 миллиона человеческих жизней ежегодно. Атеросклероз является также основной причиной внезапной смерти и инфаркт миокарда, подстрекаемые нестабильной бляшки, которые разорвать и конторах кровеносного сосуда без предупреждения. Текущие изображения формы не может различать стабильного и нестабильного бляшки, которые разрыву. Пептидные amphiphiles мицелл (ПАМС) может преодолеть этот недостаток, как они могут быть изменены с различными ориентации постановление, которые связывают специально для пораженной ткани. Моноциты было показано, быть ранних маркеров атеросклероза, в то время как большие накопления моноцитов ассоциируется с металлическими пластинками, склонных к разрыву. Следовательно наночастицы, которые можно ориентировать моноцитов может использоваться для дискриминации различных стадиях атеросклероза. С этой целью здесь, мы описать протокол для подготовки Моноцит ориентация ПАМС (Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) ПАМС). MCP-1 ПАМС собираются самостоятельно через синтез условиях мягкая форма наночастиц 15 Нм в диаметре с рядом нейтральных поверхности заряда. В пробирке, пам были найдены быть биосовместимых и имеют высокое сродство для моноцитов. Методы, описанные здесь обещают для широкого круга приложений, атеросклероз, а также других воспалительных заболеваний.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущих причин смерти во всем мире с приблизительно117,3 миллиона случаев смерти во всем мире. Сердечно-сосудистые заболевания являются представленные атеросклероза, условие, в котором металлические пластинкы накапливаться в артерий, тем самым блокируя крови и поток кислорода в клетки тела2,3. Прогрессирование атеросклероза предполагает утолщение и твердеть артерий воспалительной реакции, нерегулярные липидного обмена и наращивания зубного налета, ведущих к доска разрыв и инфаркт миокарда4,5. Эндотелиальные клетки Экспресс цитокинов и сцепления молекул, которые включают MCP-1, который привязывает к C-C хемокиновых рецепторов (CCR2), нашли на поверхности моноциты6,,78. Окисленного холестерина преобразует моноцитов в макрофаги на ранней стадии формирования зубного налета, который усиливает воспалительный процесс в регионе и приводит к повреждения тканей и формированию нестабильных или уязвимых бляшек9, 10.

Традиционно атеросклероз оценивается путем оценки Люминал стенозом анатомических изображений с помощью ангиографии или УЗИ11,12. Однако, эти методы может только определить сужение тяжелой артериальной стенки и не на ранней стадии атеросклероза, как первоначальный налета роста вызывает артериальной ремоделирования поддерживать размер артерии и крови поток скорость12,13, 14. Таким образом ангиограмм underrepresent распространенности атеросклероза. Кроме того, неинвазивные методы визуализации таких выбросов одиночных фотонов компьютерная томография, позитронно-эмиссионная томография и магнитно-резонансной томографии, недавно были использованы характеризовать налета морфологии, как они могут обеспечить начальной детали и характеристика бляшек. Однако эти условия часто ограничивается отсутствием чувствительности, пространственное разрешение, или требуют использования ионизирующего излучения, делая изображений прогрессии налета на разных стадиях гораздо более сложной,15,16 17. Тепловизионная система доставки, которая бы конкретно определить бляшек на разных стадиях атеросклероза предстоит разработать.

Наночастицы показали быть возникающих платформы в vivo доска ориентации и диагностика18,19,20,21. В частности из-за их химического разнообразие и возможность размещения различных постановление, композиции, размеров, форм и поверхности функционализации22выгодны пам. Пептидные amphiphiles (ССА) состоят из гидрофильные, пептидный «headgroup» придают гидрофобным хвост, который обычно являются липиды; Эта структура амфифильных наделяет самостоятельной сборки возможности и позволяет многовалентных отображения пептидов на поверхности частиц22,23,24. Headgroups пептид может влиять на формы частиц путем складывания и водородных связей между пептидами25. Было показано, что пептиды, которые раз через β-лист взаимодействия форме удлиненных мицеллы, в то время как α-винтовой подтверждения могут образовываться как сферических и удлиненные мицеллы22,23,24, 25,,2627. Полиэтиленгликоль (PEG) компоновщики, щит поверхности заряд пептида могут быть размещены между гидрофильные пептида и гидрофобные хвост пам, повышение доступности наночастиц в кровообращения28, 29 , 30 , 31. СМУУ также выгодно, потому что они биосовместимых и было показано, имеют широкий спектр приложений32,33. Значения растворимости в воде мицелл предлагает преимущество перед другими системами, на основе наночастиц, например некоторых полимерных наночастиц, не растворим в воде и должны быть приостановлены в solubilizers для инъекций34. Кроме того возможность создания ПАМС которые разбирать в ответ на конкретные стимулы делает ПАМС привлекательным кандидатом для доставки контролируемых наркотиков внутриклеточных35.

Связывание с рецепторами CCR2 и накапливается в аорты, СМУУ ранее были разработаны для Моноцит ориентации для мониторинга различных этапах атеросклеротических поражений аорты9. В ароЕ мышей- / - накопление Моноцит возрастает пропорционально налета прогрессии36. Кроме того было установлено, что пациенты с подверженных разрыв, поздней стадии таблички содержат большее количество моноцитов37. Таким образом изменение ПАМС включить MCP-1 полезно, потому что она позволяет для большей нацеленности специфичность и дифференциации между ранней и поздней стадии атеросклеротических поражений. Эти доказательства в концепция исследования также подтвердили ПАМС достаточно безопасно, чтобы использоваться в pre-clinically и очищаются парентеральному38. Поскольку моноцитов и воспаление характерны для других заболеваний, СМУУ MCP-1 имеют потенциал, чтобы быть использованы для лечебных и диагностических приложений в других заболеваний за пределы атеросклероза8,,3940 , 41.

Здесь мы приводим изготовление высокомасштабируемую и собственн-собранные ПАМС MCP-1, которая продемонстрировала оптимальный размер частицы, поверхности заряд и избирательного отношения к моноциты для расширения графических приложений в атеросклероза.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Прочитайте MSDS для реагентов и следовать все меры химической безопасности, как это предусмотрено местным учреждением.

1. Подготовка ПАМС MCP-1

  1. Подготовка MCP-1 пептида
    1. Весят, 0,25 ммоль Fmoc-L-Лис (БП)-Ван в реакционный сосуд (RV). Промывайте стороне RV с 5 мл dimethylforamide (DMF) в химической зонта.
    2. Загрузите RV на автоматизированной benchtop пептид синтезатор. Загрузка предварительно упакованных аминокислоты флаконов, N «- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C», от C к N-terminus. Включить пустой флакон в конце этапа окончательного deprotection.
      Примечание: Яичница пептид с последовательностью, N «- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C», могут также быть синтезированы используя тот же протокол.
    3. По завершении синтеза передачи пептидов на смолы из RV сцинтилляционные флакона с 2-3 мл метанола до тех пор, пока все смол передаются. После того, как смола потоплены на дно, удалить супернатант метанола и испаряться, оставшееся до полного высыхания. Пылесос сухой для дополнительных 2 h, или на ночь при комнатной температуре.
    4. Сделайте расщепления 12 мл раствора содержит trifluoracetic кислоты (ТФК):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % в химической зонта. Вихрем расщепления решение чтобы убедиться, что он равномерно смешивается.
      Предупреждение: Потому что triisopropylsilane и ethanedithiol воздуха чувствительных, аргон продувки запасов флаконов triisopropylsilane и ethanedithiol за 1 мин до положить их обратно.
    5. Поместите синтеза судна (SV) на руку шейкер, закрепление в нижней половине SV. Пептид смолы можно передать SV с 2 мл раствора расщепления до тех пор, пока все пептид-смол передаются.
    6. Мыть стороны SV с 3 мл раствора расщепления. Закройте крышку SV и погрозит 300 колебания/мин на 4 ч.
    7. Весят из пустой 50 мл пластиковых пробирок. Запись массы.
    8. После 4 ч слейте рассеченного пептид решение от SV в центрифуге Тюбик 50 мл. Промойте SV несколько раз с оставшийся раствор расщепления.
    9. Испарится рассеченного пептид решение с азотом, до тех пор, пока существует менее чем 4 мл в пластиковых пробирок.
    10. Добавьте 36 мл ледяной эфира пептид расщепляется решение.
    11. Вихревой решение пока полностью белый или желтый. Центрифуга на 3000 x g 5 минут при температуре 4 ° C и сцеживаться супернатант.
    12. Добавьте 40 мл ледяной эфира в трубку. Вортекс и sonicate снова. Повторите процесс центрифугирования. Декант супернатант.
    13. Сухие сырой гранул ПА с азота газом продувки до эфира заметно испаряется.
    14. Добавить 20 мл двойной дистиллированной воды, вихрь и sonicate до тех пор, пока пептида полностью растворяют в растворе.
    15. Решение проблемы зависания и lyophilize до полного высыхания.
    16. После того, как сушеные пептида, весят из массы пластиковых пробирок, содержащие сырой пептид. Растворите сырой пептида в 5 мг/мл воды.
    17. Растворите 25 мг сырой MCP-1 пептида в 5 мл двойной дистиллированной воды, чтобы сделать общую концентрацию 5 мг/мл. Очистки сырой пептид MCP-1 на высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью 0,1% TFA в воде (растворитель A) и 0.1% TFA в ацетонитриле (растворитель B) как подвижных фазах на столбце реверс фаза C8. Inject 5 мл пептида в HPLC.
      Примечание: Первоначальный мобильный этап состоял из 100% растворителя 9.0 мл/мин со скоростью потока уменьшить растворителя A медленно до 30% в 27 мин и проводить в этой композиции на 3 мин возвращение градиента в 100% растворителем более 3 мин и удерживайте в этой композиции за 1 мин дать Общее время выполнения 34 мин держать температуру столбца при 55 ° C. Используйте режим источника положительных ионов для анализа. Муравьиная кислота может использоваться вместо TFA, если TFA слишком кислой для ВЭЖХ столбца. Рекомендуется, что органический растворитель состав рамп скорость не должна превышать 2%/min для лучшего разделения.
    18. Анализ каждой фракции с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации (MALDI) масс-спектрометрии для ожидаемого продукта m/z в 2890.
      Примечание: Растворить α-циано-4-Гидроксикоричная кислота в 1 мг/мл в ацетонитриле/воды (50: 50% vol) как Матрица решения. Пятно 0,75 мкл раствора матрица на MALDI пластину, следуют 0,75 мкл каждой фракции. Провести анализ, используя режим положительный ион Светоотражающий в массовых спектр Da 500-5000.
    19. Совместить продукт фракций, сдуть ацетонитриле, замораживания и lyophilize очищенный пептидов до полного высыхания.
  2. Подготовка MCP-1 ПА
    1. Подготовьте 1.1 Молярная избыток 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-ПЭГ (2000)-maleimide для пептида в отдельных сцинтилляционные флаконов. Растворяют оба соединения в двойной дистиллированной воды, чтобы сделать ~ 15 мг/мл. Sonicate за 15 минут или до тех пор, пока оба решения полностью ясны.
      Примечание: DSPE-ПЭГ (2000)-Cy5 синтезируется, используя тот же протокол с DSPE-ПЭГ (2000)-Амин и Cy5, Эстер функционализированных N-оксисукцинимидного (ГСЗ), за исключением шага 1.2.3, где рН раствора корректируется до 8,5.
    2. DSPE-ПЭГ (2000)-maleimide решение добавьте решение пептида. Вортекс и sonicate.
    3. Добавить 1 M NaOH прикапывают (1 мкл), в то время, до тех пор, пока pH раствора является 7.
    4. Решение очистки азота для 5 минут перемешать раствор на ночь.
    5. Решение проблемы зависания и lyophilize до полного высыхания.
    6. После того, как сырой продукт сушат, растворяют твердые в 5 мг/мл воды.
    7. Очищают с ВЭЖХ, как описано выше.
      Примечание: Неконъюгированной пептида и DSPE-PEG(2000) следует элюировать между 15-30% органических концентрации (vol %), при этом DSPE-PEG конъюгата (2000)-MCP-1 следует элюировать между органических концентрации 40-50%.
    8. Анализ каждой фракции с помощью масс-спектрометрия MALDI для соответствующего м/з DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 должен иметь широкое m/z пик в 5760.
      Примечание: 2,5-dihydroxybenzoic кислота лучше всего использовать как матрица для DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 с MALDI.
  3. Ассамблея ПАМС MCP-1
    1. Распустить 1,75 мг PAs MCP-1 с 3 мл метанола в пробирку 1-драм. Sonicate до тех пор, пока полностью не растворится MCP-1 ПА.
      Примечание: Cy5 amphiphiles могут быть включены в молярное соотношение составлявшее MCP-1 ПА для графических приложений.
    2. Испарения метанола под азота в круговом движении во время промывки оставшихся метанола у стороне флакона до тех пор, пока в нижней части флакона формируется равномерную пленку. Вакуум сухой фильм ночь.
    3. Гидрат фильм с 3 мл воды или фосфатного буфера физраствора (PBS), с тем чтобы сделать 100 мкм решения МКП-1 пам. Аккуратно водоворот и sonicate решение до ясно. Инкубируйте на 80 ° C за 30 мин.
      Примечание: При повышенной температуре было показано для ускорения самостоятельной сборки процесса и позволяет компоненту пептид сформировать наиболее стабильных вторичной структуры, при одновременном снижении мицеллы критической концентрации (CMC)42,43.
    4. Прохладно результате рассеивания до комнатной температуры.

2. характеристика ПАМС MCP-1

  1. Динамическое рассеяние света (DLS) и Зета потенциальных
    1. Место 100 мкм PAM MCP-1 или омлет PAM в кювет согласно инструкциям DLS или Зета потенциального инструмента.
      Примечание: DLS и Зета потенциальных кюветы может отличаться на основании документа инструкции.
    2. Сбалансировать инструмента до комнатной температуры. Измерьте размер и поверхности заряд PAM.
  2. Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА)
    1. 7 мкл 50 мкм PAM MCP-1 или омлет PAM на сетку ТЕА приостановлено в пределах самозакрывающиеся пинцет для 5 минут фитиль от капли салфеткой деликатную задачу.
    2. 7 мкл воды для стирки в сетке. Фитиль от капли.
    3. Мкл 7 1 wt % фосфорвольфрамовой кислоты на 2 мин фитиль от капли. Повторите шаг 2.2.2.
    4. Сухие ТЕА сетки до анализа ТЕА.
  3. Спектроскопия круговой дихроизма (CD)
    1. Включите азота для 5-10 мин до использования инструмента.
    2. Место 300 мкл заготовки (вода или PBS) в кювете.
    3. Измерение спектров на 190-265 Нм, 0,2 мм длина пути с 1 время интеграции s и пропускной способностью 1 Нм в комнатной температуре. Соберите 3 реплицирует.
    4. Мера 100 мкм MCP-1 пептида, МКП-1 PAM, кинулись пептида и кинулись PAM при том же условии, описано в шаге 2.3.3. Вычитание из пустой.
    5. Размеру данных, с использованием линейной интерполяции спектров polylysine основе.
    6. Выключите прибор. Подождите 10 минут перед выключением азота.

3. анализ в Vitro ПАМС MCP-1

  1. В vitro биосовместимость
    1. Культура и расширить WEHI 274,1 мышиных моноцитов в Дульбекко изменение орел среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллин стрептомицином и 0,05 мм 2-меркаптоэтанол в 37 ° C под 5% CO2 проезд 5.
      Примечание: WEHI 274,1, подвеска клетки. При культивировании, средства массовой информации должны быть пополнен каждые 2-3 дня.
    2. Накапайте моноцитов в СМИ в стерильных 50 мл пластиковых пробирок. Центрифуга на 300 x g 5 мин при 4 ° C.
    3. Аспирационная старые средства массовой информации и Ресуспензируйте в 10 мл свежего СМИ в пластиковых пробирок. Смесь медленно до тех пор, пока клетки равномерно распределены в средствах массовой информации. Подсчет количества ячеек, с помощью окрашивания Трипановый синий и Горяева.
    4. Разбавьте клетки, что есть 4000 моноцитов в 90 мкл СМИ за хорошо. Мкл 90 клеток в скважинах 96-луночных плиты. Проинкубируйте 24 ч.
      Примечание: Избегайте использования скважин на внешние края пластины избежать различий в испарение и температурные изменения в пластине. Заполните наружных скважин с 100 мкл PBS.
    5. Растворите 0,15 мкмоль MCP-1 пептида, МКП-1 PAM, кинулись пептид, или яичница PAM в 150 мкл PBS в отдельных, стерилизованные microcentrifuge трубы. Выполните последовательный разрежения сделать 65 мкл 1, 10 и 100 мкм каждого образца.
    6. Добавить 10 мкл PBS каждой концентрации в скважинах, содержащие WEHI 274,1 (общий объем: 100 мкл в Ну, 6 линий, 96 всего скважин). Проинкубируйте 72 ч.
    7. 10 мкл (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (МТС) в каждой скважине. Инкубируйте 1 час.
    8. Анализировать поглощения, используя читателя пластины на 490 Нм или на основании инструкции производителя.
  2. В vitro мицеллы привязки
    1. Семя 500,000 моноцитов в каждой скважине 6-ну плиты в 2 мл средства массовой информации, содержащие 100 мкм Cy5-меченых MCP-1 PAM (составлявшее молярное соотношение DSPE-ПЭГ (2000)-Cy5 и МКП-1 ПА). Инкубируйте 1 час.
    2. Сбор WEHI 274,1 центрифугированием при 300 g x 5 мин при 4 ° C. Аспирационная средств массовой информации.
    3. Ресуспензируйте и вымыть клетки в 2 мл PBS. Центрифуга на 300 x g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная PBS. Повторите процесс стирки с 2 мл PBS. Аспирационная PBS.
    4. Добавьте 2 мл холодного параформальдегида 4% исправить клетки. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
    5. Пипетки фиксированного клетки на стерильных стеклянных coverslip в пределах скважин 6-ну плиты. Центрифуга на 400 x g за 5 мин.
    6. Удаление параформальдегида. Вымойте и сполосните 2 мл PBS один раз. Ресуспензируйте с 1 мл раствора PB
      Примечание: Когда полоскания, Избегайте нарушения клетки на coverslip.
    7. Положите 10 мкл 90% глицерина в PBS на слайд. Используйте иглы и пинцет, чтобы забрать coverslip. Сухие края coverslip. Осторожно разместите coverslip на слайд лицевой стороной вниз.
    8. Слегка уплотнить coverslip с четкой лак. Поместите в холодильник, пока готовы для обработки изображений.
    9. Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) установил с лазерами для Cy5 на λвозбуждения = 650 Нм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Подготовка PAM MCP-1
CCR2-привязки мотив (остатки 13-35) МКП-1 белок [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] или омлет пептид [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] был изменен путем добавления цистеина остатков на N-terminus. MCP-1 пептида был синтезирован Fmoc опосредованной твердофазный метода с помощью автоматизированных...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ПАМС MCP-1 являются перспективным молекулярной визуализации платформа, состоящая из гидрофильного таргетинга пептида и гидрофобных хвост, что диски собственн-собранные характер наночастиц. Эта ориентация Моноцит мицеллы можно приготовить путем простой синтеза и очистки шагов MCP-1 пепт?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить финансовую поддержку от университета Южной Калифорнии, Национальный сердца, легких и крови института (NHLBI), R00HL124279, Эли Edythe Широкое Innovation Award и л.к. Уиттиер фонд Non-рак Переводческая премия предоставлено ЕЕК. Авторы благодарят центр за электронная микроскопия и микроанализ, центр повышения квалификации в NanoBiophysics, центр повышения квалификации для молекулярная характеристика и переводческая изображений центра в университете Южной Калифорнии для помощи в Инструментальная установок.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ethanedithiolVWRE0032for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipetsVWR89130-898for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropyleneVWR89401-566for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%Fisher ScientificAC165200050for MALDI
25 mL disposable serological pipetsVWR89130-900for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010for cell culture
5 mL disposable serological pipetsVWR89130-896for cell culture
50 mL centrifuge tubesVWR89039-658for various applications
75 cm2 culture flaskFisher Scientific13-680-65for cell culture
75 mL reaction vesselProtein Technologies3000005for peptide synthesis
96-wells cell culture plateVWR40101-346for MTS assay
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ScientificA998SK-4for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dramVWR66011-041for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tipsVWR14673-043for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfor confocal microscopy
Cy5 amineAbcamab146463for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS gradeFisher ScientificE138-1for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mLFisher Scientific14-817-54for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometerVWR63510-13for cell counting
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kfor conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLfor cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivatedThermoFisher Scientific10438026for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afor peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfor peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifor peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfor peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfor peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffor peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfor peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 meshNovabiochem856013for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS gradeFisher ScientificA117-50for HPLC purification
GlycerolVWRM152-1Lfor confocal microscopy
Hand tally counterFisher ScientificS90189for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shapedVWR58949-006for peptide conjugation
Methanol, ACS certifiedFisher ScientificA412-4for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kitVWR10191-104for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing gradeFisher ScientificBP1160-4for peptide synthesis
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMfor peptide synthesis
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250for fixing cells
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL Fisher ScientificCG186011for peptide synthesis
Phosphotungstic acid Fisher ScientificA248-25for TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLfor peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile VWR95128093for cell culture
Self-closing tweezerTedPella515for TEM
TEM support filmTedPella01814Ffor TEM
Trifluoroacetic acid Fisher ScientificBP618-500for peptide cleavage and HPLC purification
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlfor peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061for cell counting
Tweezer, general purpose-serratedVWR231-SA-SEfor confocal microscopy
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizerProtein TechnologiesPS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfor MALDI

Ссылки

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены