Assay Imaging Люцифераза дополнения в листьях Nicotiana benthamiana временно определения динамики взаимодействия протеин протеина

Резюме

Эта рукопись описывает простой и быстрый экспериментальной процедуры для определения белок белковых взаимодействий на основе измерения Люцифераза деятельности.

Аннотация

Белок белковых взаимодействий являются основополагающие механизмы для передачи сигнала в наиболее клеточных процессов; Таким образом идентификация мониторинга динамики взаимодействия белков и Роман протеин взаимодействия пары представляют особый интерес для выявления как растения реагируют на факторы окружающей среды и/или развития сигналов. Множество подходов были разработаны для изучения взаимодействия протеин протеина, в vitro или в естественных условиях. Среди них недавно созданной Люцифераза комплементарности изображений (LCI) пробирного является простой и быстрый метод для демонстрации в естественных условиях белок белковых взаимодействий. В этот assay белок или белков B сливается с амино терминал или карбоксильных терминал половины Люцифераза, соответственно. Когда белок взаимодействует с белком B, две половинки Люцифераза будет преобразован для формирования функциональных и активных Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть записаны с помощью люминометра или ПЗС камеры. По сравнению с другими подходами, LCI assay показывает белок белковых взаимодействий, как качественно, так и количественно. Agrobacterium инфильтрации в листьях Nicotiana benthamiana является широко используемой системой для переходных белков. С сочетание LCI и переходных выражения эти подходы показывают, что физическое взаимодействие между КС1 и SPA1 было постепенно сокращено после Жасмонат лечения.

Введение

Для того, чтобы координировать роста с окружающей средой, растения эволюционировали элегантный сигнальные пути чувство, передают и реагировать сигнализации сигналы. Как бегунов в эстафете белки являются необходимыми игроков в сигнальной трансдукции растений. Было широко признано, что взаимодействия протеин протеина (PPI) играет важную роль для сотовой связи. Все зависит от физического взаимодействия между целевого белка и его модификация ферментов фосфорилирование белков, ацетилирования и деградации. Например Жасмонат зим домен белка (JAZ) семьи белки взаимодействуют с транскрипционным фактором MYC2 и подавить его транскрипционный анализ активности^1,2. Учитывая важное значение PPI крупномасштабные белков, которые были interactomes в растениях изучить недавно^3,4,5. Эти interactome результаты далее свидетельствуют о сложных регулирования сети, которая координирует различные клеточные функции.

Есть некоторые установленные подходы для наблюдения за PPI. Assay дрожжей два гибридных (Y2H) является наиболее широко используемым методом для обнаружения PPI. Y2H легко выполнить и подходит для быстрой проверки для изучения взаимодействия протеина. Y2H также широко используется для скрининга неизвестные взаимодействия партнеров для определенного протеина интереса. Однако потому что Y2H полностью осуществляется в дрожжи, он не может отражать реальный сценарий в заводе клетки и приносит высокий уровень ложных положительных. Еще одна аналогичная стратегия является выпадающее assay. В общем две белки являются выразил и очищенного от клеток Escherichia coli и затем смешанные и прикол для обнаружения взаимодействия протеина. Хотя этот метод не требует много времени, он не может получить в естественных условиях результаты взаимодействия либо. Для целей взаимодействия в естественных условиях co иммунопреципитация (co-IP) является наиболее популярным assay, которое требует высокого качества антитела к immunoprecipitate протеин интереса и нельзя исключать возможность косвенного ИЦП. Кроме того из-за сложных экспериментальных процедур в co-IP, результаты обычно зависит от индивидуального опыта.

Журналистом воссоздание анализов сильно заранее обнаружения в vivo PPI. Эти методы включают в себя флуоресценции резонанс энергии передачи (ЛАДА)⁶, bimolecular флуоресценции комплементарности (БМФЦ)⁷и Светлячок Люцифераза дополнения изображений (LCI) пробирного⁸. Хотя эти три подхода являются лучше, чем co-IP отразить непосредственно в vivo PPI, ладу и БМФЦ нужны конкретные микроскопы для обнаружения сигналов флуоресценции и не может легко количественно интенсивности взаимодействия. В отличие от LCI использует Светлячок Люцифераза, которая будет светиться после реакцию с его люциферин субстрата. Что еще более важно PPI интенсивности может быть определена из значения Люцифераза деятельности. Таким образом LCI не только указывает ли две белки взаимодействовать или нет, но также предоставляет информацию о динамике взаимодействия после лечения. Хотя есть некоторые установленные методы для контроля взаимодействия динамики (на основе поверхностного плазмон резонанса или термо стабильность смены)^9,10, эти подходы требуют чувствительные инструменты или конкретных маркировки. В отличие от LCI легче выполнить и обнаружить.

Принцип для LCI это амино- и карбоксильной терминал половинки Люцифераза (называется N-Люк или C-люк, соответственно) были слиты с протеин A и B и эти два синтез белков одновременно были выражены в клетках растений. Если протеин A взаимодействует с белком B, затем две половинки Люцифераза будет преобразован для активного Люцифераза фермента. Люцифераза активности могут быть обнаружены с помощью люминометра или ПЗС камеры. Это не является необходимым для получения стабильной трансформантов для LCI; переходных выражение является достаточно, чтобы получить результат высокого качества взаимодействия.

КОЛЬЦО типа E3 убиквитин лигаза учредительного photomorphogenic 1 (КС1) взаимодействует с множеством факторов транскрипции и способствует их деградации через 26S протеасом¹¹. Некоторые из этих факторов транскрипции, ориентированные на КС1 являются положительные регуляторы для photomorphogenesis. В темноте КС1 взаимодействует с супрессорной фитохрома A-105 1 (SPA1), который повышает КС1 E3 деятельности⁸. После восприятие света фоторецепторов будет отменить взаимодействие КС1-SPA1 ингибируют активность КС1 и затем стабилизировать КС1 субстратов^12,,1314. Этот пример иллюстрирует биологическое значение изучения ИЦП и определение динамики PPI.

протокол

1. Подготовка растений (8 недель)

1. Положите 50 Nicotiana benthamiana семян в одной из труб microcentrifuge 1,5 мл, содержащих 1 мл 5% NaClO и 0,1% раствор Тритон X-100 (V/V) и оставить на 5 минут, чтобы стерилизовать семена.
2. Сполосните семена с стерильной водой 5 раз и приостановить семена в 200 мкл стерильной воды.
3. Тщательно место отдельных семена на поверхность среды (1 L: 1 x фотосинтетическую & Скуг соли, 10 г сахарозы, pH 5,8 (KOH), 1% агар) MS-агар с тонкой советы и магазин среднего пластин в 4 ° C для 3 дней для синхронизации прорастания.
   Примечание: Во избежание микробного загрязнения, выполните этот шаг на лавочке чистой. Это не необходимо встряхнуть трубку во время стерилизации.
4. Место среднего пластин при условиях нормального роста (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 белый интенсивности света) на 10 дней, а затем перенесите проросшие рассады в почву.
   Примечание: Не забудьте вставить корней рассады в почву и не повреждают корни. Крышка лотка с прозрачной пластиковой крышкой на ночь для поддержания влажности.
5. Растут растения в комнате контролируемого роста на 16/8 ч свет/темно цикла и 70% влажности. 7-недельных растений N. benthamiana готовы к Agrobacteriumtumefaciens инфильтрат (рис. 1А).
   Примечание: Водных растений и контроля вредителей, как необходимо сохранить здоровые растения.

2. Переходное выражение в листьях N. Benthamiana (7-10 дней)

1. Доставить 150 нг плазмид (пробирного управления pEGAD ха-Люк плазмида, пустой вектор и построенных плазмиду для LCI, в данном случае мы использовали pCAMBIA1300-Nluc и pCAMBIA1300-Cluc для плазмида строительства) в A. tumefaciens компетентных клеток штамма GV3101 с стандартные электропорации метод.
2. A. tumefaciens культуры на Бертани Лурия (LB) агар среднего (1 L: 10 г NaCl, экстракт дрожжей 5 g, 10 g Триптон, 1,5% агар) содержащий 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицин на 28 ° C в течение 4 дней.
   Примечание: Выбор антибиотиков зависит от вектора и A. tumefaciens штамм используется.
3. Прививать один сингл A. tumefaciens колонии от каждой плиты в 3 мл LB жидкой среды, содержащей 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицина и погрозит 220 об/мин на 28 ° C в течение 24 ч для распространения культуры клеток.
4. Перевести 75 мкл бактериальной культуры в 15 мл свежего LB жидкой среде содержащие 50 мкг/мл канамицин и 50 мкг/мл рифампицина, разбавляя его на коэффициент 200. Культура бактерий на 220 об/мин при 30 ° C для около 8 часов, до тех пор, пока ОД₆₀₀ составляет от 0.5 до 1.0.
5. Передача A. tumefaciens жидкого культуры в 15 мл пробирок и центрифуги на 4000 x g и 4 ° C на 15 мин удалить супернатант и приостановить гранулы в 15 мл раствора преобразования мыть Пелле.
6. Спина трубки на 4000 x g и 4 ° C на 15 минут и удалить супернатант. Стиральная Повторите еще раз.
7. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл раствора трансформации и держать в течение 2 ч при комнатной температуре. Регулировка плотности A. tumefaciens Пелле клеток с решения преобразования до конечной концентрации ОД₆₀₀ 0,5, или смесь двух выборок с равным объемом для тестирования парных белковых взаимодействий.
8. Клеток инфильтрата приостановлено в 4^й до 7^th листья с 1 мл шприц безыгольной (Рисунок 1-B-C). После проникновения немедленно накройте растения черную пластмассовую крышку и установите лоток в темноте в течение 12 ч. После этого растут растения как обычно за 2-4 дня до обнаружения Люк деятельности.
   Примечание: Выберите здоровые листья аналогичного размера. Проникновение в четырех различных зон в один лист является штраф.

3. Определение активности Люцифераза (один день)

Примечание: Существует два способа для мониторинга активности Люцифераза. Один основан на визуализации, и другой — количественно измерить Люцифераза активности.

1. Метод обработки изображений
   1. Отсоединить проникли листьев и поставить весь буклет на носителе MS-агар.
   2. Спрей люциферин рабочего буфера на adaxial поверхность листьев с 50 мл спрей бутылку. Храните материалы в темноте на 5 минут, чтобы утолить auto флуоресценции хлорофилла.
   3. Используйте мычать свет Охлаждаемый ПЗС imaging аппарат (охлаждение до-30 ° C) для захвата изображения (рис. 2). Свет подала Выдержка составляет 50 мс, и время свечения обнаружения составляет 1 мин.
      Примечание: Настройте параметры согласно руководству машины. Более низкие температуры позволит повысить соотношение сигнал шум для улучшения качества изображения.
2. Кроме того измерения люминесценции непосредственно с коммерческой люминометра.
   1. Тщательно вырезать фрагменты листа (около 0,25 см²) из области инфильтрата N. benthamiana листьев и погрузит листа диска в 100 мкл обессоленной воды в 96-луночных белые пластины (рис. 3).
   2. 10 мкл буфера рабочей люциферин и оставить на 5 мин. Затем выполните конкретные процедуры для изучения динамики взаимодействия протеина.
      Примечание: Обнаружить люминесценции с Люминометр в разное время точек для получения Люцифераза деятельности динамики, которые представляют кинетика белок белковых взаимодействий при определенных лечения. Этот метод имеет преимущества для тестирования большое количество белка пар одновременно. Для тех, кто без коммерческой Люминометр изучить распространённость белка Люцифераза, Западная помарка, поэтому обратитесь к quantitively деятельности люк. Если свет не обязательно требуется, просто держать пластину в Люминометр и измерения люминесценции в разное время точках. В противном случае переместите пластины в камере роста во время обнаружения разрыва. Для получения статистически значимых результатов, используйте по крайней мере три биологических реплицирует. Хотя деятельность люк от проникновения различных зон будет варьироваться, их меняющихся моделей согласуются после нормализации.

Результаты

В этом протоколе Люцифераза дополнения для изучения белок белковых взаимодействий в естественных условиях, в том числе рост растений, проникновения табака и пробирного Люцифераза можно выделить три основных этапа. Наиболее важным шагом в этом протоколе проникн?...

Обсуждение

Протокол, описанные здесь простой и воспроизводимый для изучения в естественных условиях белок белковых взаимодействий и особенно подходит для выявления динамики взаимодействия белков под экзогенными лечения. Ключевым шагом в этот assay является проникновение N. benthamiana . Для о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transformation solution
10 mM Morpholineethanesulfonic acid	VETEC	V900336
27.8 mM Glucose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5.7
Luciferin working buffer
5 mM Luciferin potassium salt	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml