Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

Резюме

Этот протокол описывает тепла шок индуцированного белка выражение (система pDHsp/V5-его/sf9 клеток), который может использоваться для выражения инородные белки или оценке анти apoptotic деятельность потенциальных иностранных белков и их усеченного аминокислот кислоты в клетках насекомых.

Аннотация

Переходных ген выражение системы является одним из наиболее важных технологий для выполнения функционального анализа белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Эта система была разработана для Экспресс чужеродные гены под контролем промотора baculoviral в переходных выражение плазмид. Кроме того эта система может применяться для функционального анализа бакуловирусы сам или инородные белки. Наиболее широко и коммерчески доступных временных ген выражение системы является разработана на основе незамедлительного начала гена (IE) промоутер Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Однако наблюдается низкий уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых. Таким образом выражение системы переходных ген был построен для улучшения выражения протеина. В этой системе были построены рекомбинантных плазмид содержат последовательности целевых объектов под контролем промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Этот протокол представляет применение этого тепла на основе шок pDHsp/V5-его (V5 epitope с 6 гистидина) /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы; Эта система доступна не только для экспрессии генов, но и для оценки активности анти apoptotic кандидата белков в клетках насекомых. Кроме того эта система либо transfected с одной рекомбинантных плазмид или совместно transfected два потенциально функционально антагонистических рекомбинантных плазмид в клетках насекомых. Протокол демонстрирует эффективность этой системы и обеспечивает практический случай этой техники.

Введение

Две системах выражения протеина широко использовались для производства белков: системах выражения протеина прокариот (кишечная палочка ген выражение системы) и эукариоты системах выражения протеина. Один из популярных эукариоты системе выражения протеина является бакуловирусы выражение вектор системы (BEVS)¹. Baculoviruses впервые были использованы как во всем мире биоконтролирующих агентов сельскохозяйственных и лесных вредителей. В последние несколько десятилетий как биотехнологические инструменты для векторов выражения протеина также были разработаны baculoviruses. Геномы baculoviruses состоят из круговой двуцепочечной ДНК и запечатанная nucleocapsids². На сегодняшний день, более чем семьдесят бакуловирусы изолятов были виртуализированного³. На основании временной Каскад выражения гена baculoviral в клетки хозяина насекомых, транскрипции гена могут быть разделены на четыре временных каскады, включая немедленное ранний, задержка начале, конце и очень поздно гены⁴.

BEVSs были определены таким образом, что очень поздно генным стимуляторам (то есть, многогранник или p10 промоутер) были использованы для привода целевых генов, в то время как рекомбинантной бакуловирусы была порождена гомологичная рекомбинация. Выражение иностранных белков в клетках насекомых, рекомбинантных бакуловирусы похож на млекопитающих белков в столб-поступательные изменения (подходит для производства гликопротеин). Таким образом бакуловирусы был широко используется^5,6,7. Однако одно ограничение является наличие различных путей N-гликозилирования насекомых клетки⁷.

Таким образом была разработана новая система бакуловирусы выражение, выражение системы переходных гена. Эта система выражает чужеродные гены под диск baculoviral немедленного начале промоутеров (ie-1 промоутер) в клетках насекомых. С помощью этой системы, целевого белка может быть сразу же выражена под контролем промотора ie-1 во время изменения N-гликозилирования путь в клетках насекомых, что приводит к лучшей олигосахариды, связанный с N⁷. Кроме того baculoviral немедленно ранняя гены транскрибируются РНК полимеразой II клетки-хозяина и не требуют какой-либо вирусной фактор для активации⁴. Таким образом иностранные белков может быть выражено в клетках насекомых в течение короткого времени. На сегодняшний день, переходные системы выражения гена является одним из наиболее важных технологий для выполнения функциональных анализов белка в бакуловирусы в vitro клетки культуры системы. Система может применяться для анализа функции бакуловирусы или инородные белки. Один из коммерчески доступных временных ген выражение систем основана на промоутеров немедленного начала гена (IE) Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 и OpIE1 промоутеров).

Однако ниже уровень экспрессии чужеродных генов в клетках насекомых еще была проблема, когда система выражение на основе промоутер переходных гена OpIE была используется^8,9,10. Таким образом другой переходных ген выражение системы была построена на основе промоутер дрозофилы тепловой шок белка 70 (БТШ70) ген^8,9. Промоутер hsp70 работает более эффективно, чем промоутер baculoviral IE когда индуцированных теплового шока на насекомых клетки¹⁰. В этой системе были высказаны генов-мишеней под диск промотора дрозофилы теплового шока 70 (Dhsp70). Чужеродные гены можно легко клонировать в плазмиду выражение переходных генов клонирования методами на основе ПЦР. Кроме того контроль сроков для экспрессии генов может осуществляться тепловой шок индукция.

В настоящем докладе, мы следовать подходу и выразить три различных усечений гена baculoviral (Ингибитор апоптоза 3, iap3 от Lymantria xylina MNPV) с помощью системы выражения на основе шок переходных белка тепла и Далее примените эти выраженной белки на анти apoptotic анализ деятельности. Эта система может либо Экспресс инородные белки быстро или применяться для оценки деятельности анти apoptotic белка в клетках sf9, а также может применяться для других анализов активность белка.

протокол

1. Подготовка

1. Культура клеток насекомых
   1. Подготовка 50 мл среды культуры клеток. Чтобы сделать это, добавьте 500 мкл антибиотиков (амфотерицин B = 0,25 мкг/мл, пенициллин = 100 единицы/мл, стрептомицина = 100 мкг/мл) и 5 мл сыворотки тепла инактивированная плода говядину в среде культуры клеток сыворотки бесплатно (без FBS или антибиотики).
      Примечание: Тепла плода бычьим сывороточным при 65 ° C за 30 минут на водяной бане перед использованием.
   2. Сохранить Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: совок), sf9 насекомых клеток. Отсоединить ОК. 80% клеток от 25 см² клетки культуры колбу, встряхивая колбу и проверить под световой микроскопии. Затем передать новый флакон культуры клеток² 25 см 50% суспензию клеток и позволяют клеткам прикрепить 15 мин при комнатной температуре. Заменить средство с 5 мл свежего клеток питательной среды и расти в инкубаторе на 28 ° C. Клетки проход каждые 2 до 3 дней в зависимости от роста клеток.
2. Подготовка плазмиды для transfection клетки
   1. Вставьте фрагменты ДНК целевого объекта (например, непарный xylina гена iap3 в MNPV (LyxyMNPV) и его удаление конструкций) в pDHsp/V5-его на основе ПЦР клонирования метод¹¹. Проверьте роста колоний превращается в колонии PCR с помощью ПЦР Мастер микс (2 X) и pDhsp-F2/Op-IE2R грунтовка набор. Подтвердите плазмида последовательности службой коммерческих последовательности.
      Примечание: В таблице 1 перечислены Праймеры для ПЦР и соответствующей конструкции.
   2. Культура единого виртуализированного колонии бактерий, которые содержат вышеупомянутые плазмида конструкций (шаг 1.2) в 200 мл LB средних содержащие выбранные антибиотики (50 мкг/мл), соответственно.
   3. Извлечь плазмид из искусственного E. coli с помощью Midi плазмида комплекта согласно инструкции производителя¹².
3. Подготовка среднего покрытие путем смешивания 1,5 мл среды культуры клеток и 8,5 мл сыворотки свободных клеток питательной среды.
4. Подготовить актиномицин Д (АСРТ) клеток питательной среды, добавив 1.5 мкл АСРТ акций (1 мг/мл) в 10 мл среды культуры клеток (конечная концентрация = 150 нг/мл). Хранить при 4 ° C.

2. Переходные белков

1. Заполнение ячеек
   1. Урожай sf9 клетки, встряхивая колбу культуры, свергнуть осенью суспензии клеток с 50 мл трубки и передать Горяева 10 мкл на P10 пипетки. Подсчет клеток под микроскопом света.
   2. Пластина 3 × 10⁵ sf9 клеток в каждой скважине в 24-ну пластине 15 мин при комнатной температуре. Замените носитель 0,5 мл обшивка среднего.
2. Трансфекция плазмиды
   1. Разбавить клеток трансфекции реагента: развести 8 мкл Реагента transfection клетки в 100 мкл сыворотки свободных клеток питательной среды и микс от vortexing для 1 s.
   2. Добавить 2 мкг плазмидной ДНК (pDHsp70-Ac-P35/V5-его pDHsp70-лы-IAP3/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его) в 100 мкл сыворотки свободных клеток питательной среды и микс, vortexing для 1 s (Рисунок 2).
   3. Объединить разреженных плазмида ДНК и разбавленных клеток трансфекции реагента (210 мкл) и смесь vortexing для 1 s. инкубировать 30 мин при комнатной температуре.
   4. Мкл 210 ДНК трансфекции реагент смеси каплям на клетки, P1000 пипетки. Инкубируйте на 28 ° C за 5 ч.
   5. Замените средство покрытия 0,5 мл среды культуры клеток с помощью пипетки P1000. Печать 24-ну пластины с лентой и инкубировать клетки на 28 ° C на 16 h.
3. Тепловой шок transfected клеток: Положите пластину в ванну воды 42 ° C (плавающие на поверхности воды). Тепло в течение 30 мин и вернуть инкубатор 28 ° C 24-ну пластины.
4. Определение выражения протеина
   1. После 1 час или 5 h теплового шока Вымойте клетки с 0,5 мл 1 x PBS буфера кратко три раза.
      Примечание: Развести 10 x буфер PBS 1 x PBS буфера путем добавления 1 мл буфера PBS 10 x 9 мл стерилизованное ddH₂O
   2. Лизируйте клетки с 40 мкл 1 x SDS загрузки краситель, закупорить вверх и вниз.
      Примечание: Разбавляют 4 x SDS загрузки краситель, смешивая 30 мкл 1 x PBS буфера и 10 мкл 4 x буфер образца SDS.
   3. Тепла образцы протеина в 98 ° C в течение 10 мин в блоке тепла, уменьшается на 1 мин и положить на льду для западной помарки assay.
   4. Западной помарке пробирного
      Следуйте процедуре иммуноблоттинга пробирного эслами и Лухан-¹³. Запуск Гели SDS-PAGE¹⁴: один гель, подвергается Кумасси синий окрашивание (контроль погрузки для проверки, что количество образцов белка, загруженной в каждый хорошо равно в сумме) и другие подвергаются Западной пятно пробирного, согласно эслами и Лухан¹³ .
   5. Обнаружить V5-тегами синтез белков с кролик антитела анти V5 (5 мг/мл) (1: 5000 разрежения в TBST буфер для рабочей концентрации 1 мкг/мл) и коз анти кролик IgG хрен пероксидазы (ПХ) конъюгата (0,8 мг/мл) (1: 10000 разрежения в TBST буфер для рабочей концентрация 0,08 мкг/мл).
      Примечание: Отрегулируйте процент полиакриламида до 17,5% когда низкомолекулярных белков быть < 17 кДа.

3. анти apoptotic деятельности пробирного

1. Джин индуцированной клеток апоптоз: повторите вышеупомянутые процедуры от 2.1 до 2.3. Совместное transfect 1 мкг pDHsp/D-rpr/флаг-его плазмидной ДНК (содержащий апоптоз индуктором ген) с 1 мкг плазмидной ДНК [pDHsp70/V5-его вектор (отрицательный контроль), pDHsp70-Ac-P35/V5-его (положительный контроль), pDHsp70-лы-IAP3/V5-его, pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно.]. В 5 ч после термообработки шок проведения пробирного жизнеспособности клеток (рис. 2).
2. Апоптоз клеток химико индуцированной: повторите вышеупомянутые процедуры от 2.1 до 2.3. В шаге 2.1.2 пластина 1 x 10-⁶ sf9 клеток в каждой скважине в пластине 6-хорошо. Transfect 4 мкг плазмидной ДНК [pDHsp70/V5-его вектор (отрицательный контроль), pDHsp70-Ac-P35/V5-его (положительный контроль), pDHsp70-лы-IAP3/V5-его, pDHsp70-Ly-IAP3-Бир/V5-его или pDHsp70-Ly-IAP3-кольца/V5-его, соответственно.]. В 5 ч после теплового шока лечить sf9 клетки с 2 мл АСРТ клеток питательной среды для 16 h и проведения пробирного жизнеспособности клеток (рис. 2).
   Примечание: Минимальный объем для покрытия одной скважиной 6-ну плиты-1 мл.
3. Выполните выше анти apoptotic деятельности пробирного экспериментов, включая 3.1 и 3.2 в triplicates.

4. клетки жизнеспособности пробирного

1. Промойте обработанные клетки, добавив 1 мл 1 x PBS буфера 1 мин 3 раза. Ресуспензируйте клетки, закупорить 1 мл 1 x PBS буфер, содержащий 0,04% Трипановый синий и пятен на 3 мин при комнатной температуре. Перенесите суспензию клеток в 1,5 мл микропробирок.
   Примечание: Разбавьте раствор 0,4% Трипановый синий, смешивая 9 мл раствора 1 x PBS буфер и 1 мл 0,4% Трипановый синий.
2. Передача 10 мкл Трипановый синий окрашенных клеток подвеска Горяева с пипеткой P10 и подсчет жизнеспособных нетронутым клеток под микроскопом света.
3. Статистический анализ
   1. Рассчитать записанные данные и представить в качестве средства ± с.д. для всех счетчиков.
   2. Анализировать данные с помощью студента двустороннее t тест, с помощью Microsoft Excel. Определить статистически значимые данные как P-значение < 0,05.

Результаты

Полная длина и другие два усечения (Бир и кольцо домены) Ly-IAP3 из LyxyMNPV были оверэкспрессировали в sf9 клетках, основанный на теплового шока на основе pDHsp/V5-его /Spodoptera frugiperda клетки (клетки sf9) системы. PDHsp/V5-его содержится дрозофилы тепловой шок белка промоутер, котор...

Обсуждение

Концепция системы тепла на основе шок клеток pDHsp/V5-его/sf9 был впервые описан Клем et al. 1994⁸. Сравнение baculoviral гена промоутер (IE1) и дрозофилы hsp70 показали, что что hsp70 имели более высокую эффективность в клетках комаров¹⁰. Кроме того из-за тепловой ш?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)