JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Роман терапевтических стратегий в сердечной регенеративной медицины требуют обширные и подробные исследования в крупных доклинических моделях животных, прежде чем они могут рассматриваться для использования в организме человека. Здесь мы продемонстрировать технику инъекций intramyocardial эхокардиография руководствуясь перкутанная контраст в кроликов, который является ценным для гипотез эффективность такой роман терапии.

Аннотация

Клеточной и генной терапии являются захватывающими и перспективных стратегий с целью регенерации сердца в параметре сердечной недостаточности с снижение фракции выброса (HFrEF). Прежде, чем они могут рассматриваться для использования и осуществляться в организме человека, обширные доклинические исследования требуются в больших животных моделей для оценки безопасности, эффективности и судьба injectate (например, стволовые клетки) раз доставлен в миокарде. Небольшой грызун модели предлагают преимущества (например, эффективность, ответственность за генетические манипуляции затрат); Однако учитывая присущие ограничения этих моделей, результаты в этих редко перевод в клинику. И наоборот, крупных животных моделей, таких как кролики, имеют преимущества (например, аналогичные сердечной электрофизиологии, по сравнению с человеком и других крупных животных), сохраняя хороший баланс экономически. Здесь мы демонстрируем как выполнить перкутанная контраст эхокардиографии руководствуясь intramyocardial инъекции (IMI) техника, которая является минимально инвазивной, безопасным, хорошо переносится и очень эффективны в целенаправленной доставки injectates, включая клетки, в нескольких местах в миокарде модели кролика. Для осуществления этой техники мы также воспользовались системы клинических эхокардиография широко доступны. После закапывания в практике протокол, описанные здесь, исследователя знания основных УЗИ станут компетентными в выполнении этой универсальный и минимально инвазивной техники для обычного использования в экспериментах, направленных на тестирование гипотезы возможностей сердечной регенеративной терапии в модели кролика. Как только достигается компетентности, вся процедура может быть выполнена в течение 25 мин после анестезировать кролика.

Введение

Клеточной и генной терапии захватывающие и когда-нибудь разработки стратегий для регенерации/ремонта потерпевшего миокарда в HFrEF. В нескольких исследованиях сравнивали эффективность (например, коэффициент удержания клеток) различных маршрутов доставки клеток, которые последовательно продемонстрировали превосходство IMI над интракоронарой или внутривенного маршрутов1,2 , 3 , 4 , 5. Таким образом, это не удивительно, что большая часть исследований по трансляционной модели терапии стволовой клетки потерпевшего миокарда, доставить injectate через IMI, под видом в открытой груди процедуры6,7 . Однако этот подход имеет ряд ограничений, в том числе захватнический характер процедуры, которая несет в себе риск смертности Пери процессуального (часто занижены)8. Кроме того IMI под видом не устраняет возможность непреднамеренного введения в полость желудочков. В клинической практике IMI во время открытой грудной хирургии может быть соответствующий метод для доставки терапевтических клеток, например, при коронарной артерии трансплантата шунтирование (АКШ); Однако этот подход не может быть подходящим для доставки клеток в глобальной кардиомиопатия-ишемического происхождения (например, HFrEF, вторичные кардиотоксичности кардиомиопатия (AICM)).

Нет сомнений в том, что ишемическая болезнь сердца (ИБС) является наиболее распространенной причиной HFrEF (~ 66%)9,10; однако, не ишемическая кардиомиопатия, включая AICM, по-прежнему затрагивает значительную долю больных с9 HFrEF (33%) . Действительно последние достижения в клинической онкологии привели к более чем 10 миллионов выживших рака в США только11, с оценками аналогичное число в Европе, в соответствии с общей тенденцией к улучшение выживаемости больных раком12 ,13. Таким образом изучение преимущества Роман терапии, такие как трансплантация стволовых клеток для не ишемическая кардиомиопатия, а также испытания той эффективной и минимально инвазивной маршрут доставки стволовых клеток имеет первостепенное значение, учитывая рост числа больных пострадавших от кардиотоксичности вторичных противоопухолевых препаратов.

Следует отметить гипотез исследования с использованием клеточной терапии, направленных на ремонт/регенерации потерпевшего миокард часто предполагает использование мелких грызунов (например, мышей и крыс). Эти модели часто требуют дорогих высокой частоты ультразвуковых систем для оценки функции миокарда, обычно оборудованы с линейного массива преобразователей, которые имеют некоторые присущие связанные ограничения (например, реверберации)14. Однако другие модели, такие как кролики, представляющие большой доклинических модели, имеют некоторые преимущества для проверки гипотез при терапии стволовой клетки в HFrEF. Таким образом в отличие от крыс и мышей, кроликов поддерживать Ca+ 2 транспортной системы и клеточной электрофизиологии, который напоминает людей и других крупных животных (например, собаки и свиньи)15,16,17 ,18,19. Еще одно преимущество, это их ответственность за сердца ультразвуковых изображений с помощью относительно недорогой и широко доступны клинических эхокардиография систем, оборудованных с относительно высокой частотой фазы массива преобразователей, например, 12 МГц, такие как те, которые часто используются в неонатальной и педиатрической кардиологии. Эти системы позволяют отличные Эхокардиографические изображений с современные технологии, и они воспользоваться превосходства гармоники20изображений. Кроме того, обширные гипотеза тестирование потенциал сердечной регенеративной терапии (например, терапия стволовой клетки), их безопасность, эффективность, cardiomyogenic потенциал, а также оценки судьбы injectate раз доставлен в миокарда, является обязательным, прежде чем они могут быть рассмотрены для использования человеком, и они требуют использования больших доклинических моделях животных, как кролик17,19. Здесь мы описываем минимально инвазивной техники для доставки клеток через перкутанная контраст эхокардиография руководствоваться IMI с помощью системы клинических эхокардиографии, которая направлена на терапии на основе трансплантации стволовых клеток для не ишемическая кардиомиопатия20 . Мы также описывают преимущества чернил Индии (InI, также известный как Китай чернил) как УЗИ контраст агента и в situ трассирующими injectate в самом сердце кролика.

протокол

Эксперименты, описанные здесь, были утверждены Комитетом этических исследований Университета Мурсии, Испания и были проведены в соответствии с директивой 2010/63/ЕС Европейской Комиссии. Описанные шаги были выполнены под стандартные оперативные протоколы, которые являются частью плана работы и не были проведены исключительно для съемок сопровождающих видео к настоящему документу.

1. Подготовка клеток и млекопитающих выражение вектор

Примечание: Здесь, мы кратко описать протокол для подготовки и transfection клетки линии (человеческих эмбриональных почки 293 (ГЭС-293)); Однако конкретные протоколы соответствующие клетки для типа ячейки интереса должны быть оптимизированный (например, стволовые клетки).

  1. Поддерживать ГЭС-293 клетки в высокой глюкозы Дульбекко модифицированная орла среднего (DMEM) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), пируват натрия 1%, 2 мм глутамина, 1% пенициллина/стрептомицина и инкубировали при 37 ° C в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO2 . После того, как клетки югу вырожденная, раскол в соотношении 1:3.
  2. Начать разделения клетки, аспирационных СМИ, то мыть раз с стерильных фосфат буфер солевой раствор (PBS), удалить излишки PBS и затем инкубации с 2,5 мл 0,5 x трипсина-Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (5 мин., 37 ° C).
    1. Добавьте один объем DMEM СМИ (дополнить, как описано выше) чтобы остановить реакции и затем отсоединить клетки, медленно и осторожно аспирационных вверх и вниз с электронных дозаторов.
  3. Затем перенесите суспензию клеток в соответствующий контейнер (например, 15-50 мл конические пластиковых пробирок). Центрифуга в ведро качели (100 x g), удалить супернатант и помыть лепешка дважды с стерильных PBS.
  4. Ресуспензируйте Пелле в свежих DMEM СМИ и семян в соответствующей ячейке плотности (например, 1 x 106 клеток в колбе2 75 см) в свежих культуры колбы или большие блюда согласно местных лабораторной практики.
    1. Замените существующие средства массовой информации с свежими СМИ каждые 2 дня.
      Примечание: Выражение вектор был производным от pIRES1hyg и используются согласно инструкциям производителя как описано21. p(EGFP) IRES1hyg порожденных subcloning EGFP cDNA как BamHI + Ноти вставить в BamHI из pEGFP-N1 + Ноти переваривается pIRES1hyg21.
  5. за 1 день до трансфекции, семян ГЭС-293 клеток на плотность 0,5 x 105 клеток/см2 в 12 - или 24-ну культуры ткани пластины.
  6. В день трансфекции Подготовьте ДНК липидов трансфекции реагент комплексов в отдельных 1,5 мл microcentrifuge трубки (1 трубка/хорошо).
    1. Начните с добавления 250 мкл сокращение сыворотке среды в каждую пробирку, а затем добавить 4 мкг ДНК (осторожно перемешать).
    2. Впоследствии, добавить 250 мкл предварительно подготовленную смесь 10 мкл липидов трансфекции реагента и 250 мкл сокращение сыворотке среды, каждая трубка (снова осторожно перемешать).
    3. Наконец перейти с transfections, по инкубации клеток ГЭС-293 с ДНК липидов трансфекции реагент комплексы для 4 ч, затем замените среде DMEM дополнить как описано выше (шаг 1.1) и инкубировать еще 48 ч. Выбор наркотиков Perform стабильного transfectants с 100 мкг/мл hygromycin б.
  7. Отсоедините ГЭС-293 клетки с трипсином, как описано выше (шаг 1.2). После мытья клетки в стерильных PBS, Ресуспензируйте надлежащим средством (например, 10% v/v InI в PBS), для достижения окончательного ячейки концентрации 5 x 10-6/мл.

2. Подготовка кролика

Примечание: Позиционирование кролика и преобразователя для IMI не является оптимальным для оценки морфологии и функции сердца животного. Таким образом рекомендуется выполнять полное ультразвуковое обследование20 до IMI (см. ниже) и в последующее время точках, как определяется экспериментальный дизайн. Это будет стремиться оценивать базовые анатомические и функциональные характеристики сердца в животном которые будет получать инъекции, а также оценить последствия, IMI в функции сердца.

  1. Выполните этот экзамен в ослепленный моды и руководящими принципами Комитета по эхокардиографии американского Колледжа ветеринарной медицины внутренних и американского общества эхокардиография/Европейской ассоциации для сердечно-сосудистой системы визуализации 22 , 23 , 24.
  2. Получите одновременно 1-ведущий Электрокардиограмма (ЭКГ) трассировки на протяжении всей Эхокардиографическое исследование.
  3. Анестезировать кролика с Кетамин 10 мг/кг, в сочетании с medetomidine 200 мкг/кг внутримышечно (и.м.).
  4. Проверьте уровень анестезии после 10-20 мин после введения анестезии.
  5. С помощью машинки для стрижки волос удаление волос грудь широко (например, ниже шеи к югу xiphoid регион) (рис. 1A).
  6. Брить дополнительные регионы2 1-2 см в внутренней лицо правом передних конечностей (mediocubital район) и оба задних конечностей (mediotibial район) (рис. 1B).
  7. Место клейкие электроды ЭКГ на бритые регионах конечностей синхронно мониторинга сердечного ритма во время процедуры (рис. 1 c).
  8. Место животного в лежачем положении пролежни на Тепловая одеяло, с конечностей, протянутой с использованием хирургическая лента, присоединенные к таблице (рис. 1 c).
    1. Убедитесь, что уши являются согнута назад за спиной/головы кролика и на позиции, что меньше, чем его передние конечности, так как это помогает поддерживать правильное позиционирование грудной клетки животного на протяжении всей процедуры.
  9. Позвольте животным дышать спонтанно, в то время как управляющие кислород, маска для лица на протяжении всей процедуры (100%, 2-3 Л/мин).

figure-protocol-6224
Рисунок 1. Подготовка кролика IMI. (A) клип волос от грудной клетки; (B) клип волос от конечностей; (C) прикрепить электроды и положение кролика с ноги вытянутыми на термоодеялом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI технику в кролика

  1. Очистить и продезинфицировать кожу грудной клетки с раствором на основе хлоргексидина.
    1. Используйте асептические технику на протяжении всей процедуры, согласно текущей наилучшей практики.
    2. Когда это возможно и практически осуществимым, выполнять полностью стерильным процедуры, включая, но не ограничиваясь этим, использование стерильных материалов, таких как платья, перчатки, хирургические раны шторы, стерильные перевязочные материалы для таблицы, а также стерильные УЗИ крышка датчика и стерильные УЗИ гель. Это позволит сократить до минимума риск введения патогенные для животных, получение IMI и является стандартной практикой в клинических условиях (например, во время пункции сердца).
      Примечание: Рекомендуется всегда действовать в соответствии с местных и национальных положений применимых к местным учреждением исследований на животных и страны практики.
  2. Нанесите гель передачи УЗИ груди и/или датчика и с датчика шнур вокруг шеи экспериментатора, выполните проверку быстро окно сердца животного, который часто полезно для визуализации анатомии и планировать IMI.
  3. Поместите датчик вручную на 4th-6й межреберное пространство, 2-3 см от правой парастернальной линии с углом падения ~ 90 ° относительно правой стороне грудной стенки (рис. 2A).
  4. Настройте расположение датчика относительно межреберное пространство, а также его переднезаднем и dorsoventral угол, чтобы оптимизировать представление изменение короткой оси на уровне папиллярных мышц. Определите в этом представлении правого желудочка (RV), левого желудочка (LV), межжелудочковой перегородки (ИВС), задней стенки (PW), а также переднебоковой (AL) и задне (PM) папиллярных мышц (Рисунок 2Б).
    1. Имеют широкое поле зрения, значительно увеличивая глубину, используя соответствующий элемент управления в системе (например, кнопка, циферблат).
    2. Обратите особое внимание на получение симметричное изображение в этот вид, а также соответствующие дифференциация эндокарда и эпикардиальной контуров и, при необходимости, скорректировать путем оптимизации рисунков (например, прибыль).
  5. После получения оптимального эхокардиографические вид (рис. 2B), сохранить эту позицию в остальной части процедуры, в то время как второй оператор выполняет IMI (см. ниже).
    1. Удерживая датчик, Избегайте сокрытия знак ориентации датчика, который должен всегда лицом вперед, таким образом позволяя его выравнивания с иглой в последующих шагах (рисунок 2A, C).
  6. С 24-G иглой прилагается к 1 мл шприц место иглы близко к коже левой hemithorax симметричный зеркального отображения положение в отношении преобразователя. Затем вручную выравнивать иглой с Марк ориентации датчика на угол ~ 90° (рис. 2 c) и медленно вперед иглу через кожу и в грудной полости.
    Примечание: Чрезкожная иглы в этой позиции и ориентации облегчает визуализацию иглы в плоскость ультразвукового луча (Рисунок 2D, E), таким образом позволяя мониторинг в реальном времени и, при необходимости, корректировка Расположение иглы относительно целевого региона миокарда (Рисунок 2 G, H).
  7. С кончика в целевом расположении, медленно доставить injectate (до 0,25 мл в месте инъекции) в течение 10-30 s (Рисунок 2E), в то время как медленно и осторожно втягивания иглы во время инъекции для увеличения степени миокарда лечение.
    1. Использовать InI 10% (v/v) разводят в PBS для стандартизации техники и как трассировщик на месте во время приобретения компетентности, а также относительно подтверждения успешного нападения на всех четырех IMI сайты в миокарде грубой патологии и гистопатологии (см. Представитель результаты). Как только достигается компетентности, InI могут быть заменены подходящих коммерческих УЗИ контрастного вещества при желании.
      Примечание: Поставка 10% (v/v) InI, разбавленных в PBS с или без клетки в миокарде результаты Трансмуральное hyperechogenicity (то есть, эхо яркой внешний вид) на целевом сайте инъекции (Рисунок 2E, F). Даже от первого контакта иглы с epicardium часто наблюдаются переходных замедление или ускорение сердечного ритма, связанных с преждевременной желудочковых сокращений (например, изолированные, куплеты и тройни), а также во время или вскоре после IMI. Однако, не угрожающих жизни аритмий разрабатываются и острых неблагоприятных эффектов редко наблюдаются с использованием до 0,25 мл (1,25 х 106 клеток) injectate на месте инъекции IMI (см. Представитель результаты и обсуждение).
  8. Выполните тонкие изменения в угол падения иглы необходимо для выполнения инъекции 0,25 мл в каждую из четырех целевых IMI сайтов (три в левого желудочка свободных стен (LVFW) и один в ИВС).
  9. После завершения процедуры эхокардиографии руководствуясь IMI перкутанная контраст, оценивать сердечного ритма (например, через последовательный ЭКГ трассировки или 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ) и выполнять ультразвуковое сканирование серийный окно для проверки отсутствия осложнения, до тех пор, пока животное полностью оправился от наркоза и только затем передачи в комнате свет цикла.
    1. Здесь мы используем 24 h холтеровское мониторирование ЭКГ для мониторинга воздействия IMI с InI на ритм сердца за 24 ч. Для этого мы сравнили группы 6 кроликов с нормального фенотипа (нормальная группа) и группа 6 кроликов, которые получили внутривенное доксорубицин (кардиотоксический кардиотоксичности препарата, обычно используется для лечения рака; Группа DOX) в дозе 2 мг/кг/неделю за 8 недель, а затем обеих когортах получил IMI с InI.

figure-protocol-12958
Рисунок 2 . Чрескожная контраст intramyocardial эхокардиография руководствуясь инъекций в кролика. (A) размещение датчика в правой hemithorax углом ~ 90 °. (B) представитель изображение парастернальной короткой оси зрения (PSSX) сердца на уровне папиллярных мышц в кролика. (C) выравнивание иглу под углом ~ 90 ° по отношению к Марк ориентации датчика. (D) расположение иглы на целевой сайт в представлении PSSX сердца (Обратите внимание, что иглы легко визуализируется в плоскость ультразвукового луча). (E и F) демонстрация hyperechogenicity на конечном сайте после инъекции intramyocardial с тушью (стрелок выделите Трансмуральное hyperechogenicity). (G) случайного расположения иглы в зале LV (стрелок выделите игольчатый вала). (H) репозиционирование иглы к стенке бесплатно LV (стрелок выделите игольчатый вала). РВ = правый желудочек; LV = левого желудочка; ИВС = межжелудочковой перегородки; PW = задняя стена; AL = переднебоковой папиллярных мышц; PM = задне папиллярных мышц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. пост IMI анализы

  1. Гистопатологические анализ образцов ткани сердца, от кроликов.
    1. Исправить ткани для 24 h в 10% формальдегида, следуют обезвоживания с увеличением концентрации этанола следующим образом:
      • 1 x 70% (60 мин)
      • 1 x в 95% метанола ethanol/5% (60 мин)
      • 1 x в 100% (60 мин)
      • 1 x в 100% (90 мин)
      • 1 x в 100% (120 мин)
      Примечание: Все выше инкубаций проводятся при комнатной температуре (RT). Затем замените дважды с 100% ксилола (1 h, RT) и наконец внедрить в парафин в два этапа (60 мин., 58 ° C)25.
    2. Выполните разделов ткани 4-5 мкм с микротом25. Смонтируйте разделы на слайдах.
    3. Выполняют окрашивание с применением окрасок гематоксилин эозином и Массон в trichrome методы25,,2627.
  2. В разделах ткани из пересаженных сердец выполняют иммуногистохимия обнаружить EGFP(+) ГЭС-293 клетки (например, с помощью метода авидин Биотин комплекс (ABC)), кратко:
    1. Де воск 4-5 микрон толщиной сердце секций в 100% ксилола (10 мин., на RT). Увлажняет ткань мыть с уменьшением растворы концентрации этанола (2 x в 100% (2 мин) 2 x в 95% (2 мин) 1 x 70% (2 min); 1 x в 50% (2 мин); 1 x на 30% (2 мин); 1 x ddH2O (2 мин)) на RT.
    2. Выполнять эндогенной пероксидазы ингибирование, охватывающих разделы с 100 µL 3% H2O2 разбавляют в метаноле (подготовленные с 5 мл 30% акций раствора H2O2, и добавление метанола до суммарный объем 50 мл) ( Инкубируйте 30 мин, RT), а затем вымыть путем погружения с трис-буфер солевой раствор (TBS; рН 7,6).
    3. Выполняют антигена разоблачения через Ферментативная обработка, покрывая разделы с 100 мкл 0,1% Проназа (подготовленных с 0,01 g Проназа, разводят в 10 мл TBS) (инкубировать 12 мин, RT), затем промыть TBS (5 мин., RT).
    4. Инкубировать в блокировании решение (нормальный козьего сыворотки на 10% в TBS) с использованием 100 мкл в слайд (30 мин., RT) и мыть с TBS (5 мин., RT).
    5. Проинкубируйте с курицей анти зеленый флуоресцентных белков (ГПУП) как первичное антитело (1: 500 в TBS) (1 час, 30 ° C) и мыть с TBS (5 мин., RT).
    6. Проинкубируйте с вторичное антитело биотинилированным коза анти курица IgG (1: 250 в TBS) (1 час, 30 ° C), а затем вымыть с TBS (5 мин., RT).
    7. Инкубировать авидин Биотин комплекс (20 мин., 30 ° C), а затем ярлык с помощью 3,30-Диаминобензидин tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 мин).
    8. Наконец обезвоживает промывкой в увеличении концентрации этанола (1 x на 30% (2 мин) 1 x в 50% (2 мин) 1 x 70% (2 min); 2 x в 95% (2 мин); 2 x в 100% (2 мин)) на RT, разделы изображение, используя метод гематоксилином эозином25, а затем смонтировать крышку слайды. Включать положительных, отрицательных, а также изотипа элементов управления.
      Примечание: Краткий протокол, описанные выше не предназначен для использования общего иммуногистохимия; Оптимизация для ткани интерес и условий является необходимым.

Результаты

Чрескожная контраст эхокардиографии руководствуясь IMI с InI:

Используя протокол описанных выше, и после того, как оптимальное расположение кончика иглы был подтвержден эхокардиографии и начало впрыска, Трансмуральное hyperechogenici...

Обсуждение

Основной целью было разработать минимально инвазивные техники, которые могут быть использованы для доставки стволовых клеток в миокарде кроликов (большого размера доклинические животных модель)17,18, наслаждаясь преимуществами использования относитель...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Шейла Monfort, бренда Мартинес, Карлос Мико, Альберто Муньос и Мануэль Молина за отличную поддержку, оказанную в ходе сбора данных и Карлос Буэно для обеспечения EGFP(+) ГЭС-293 клетки. Эта работа была поддержана частично: Фонд Séneca, научно-де-Agencia y Tecnología, регион-де-Мурсия, Испания (JT) (номер гранта: 11935/PI/09); Красный-де-Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Редес в Эль, VI PN де I + D + I 2008-2011 годы (Грант нет. RD12/0019/0001) (JMM), совместно финансируемых с структурного финансирования Европейского союза (ФЕДЕР) (JMM); и университет Рединг, Соединенное Королевство (AG, GB) (Центральный финансирование). Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HD11 XE Ultrasound SystemPhilips10670267Echocardiography system.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212 over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringeBraun9161406V
Imalgene (Ketamine)MerialRN 9767Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99India (China) Ink
Holter SyneflashEla medicalSF0003044S24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®Ambu (NUMED)VLC-00-SHolter ECG electrodes.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
MicroscopeOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibodyInvitrogenA10262Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG AntibodyVector LaboratoriesBA-9010Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Fluorescence MicroscopeCarl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% fetal calf serum (FCS)Fisher Scientific11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)Fisher Scientific11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)Fisher Scientific31985070
Hygromycin BCalbiochem (MERCK)400051
Xylene (histological)Fisher ScientificX3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU

Ссылки

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23 (2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342 (2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Vela, D., Maximilian Buja, L., Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. . Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149 (2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594 (2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566 (2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902 (2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131intramyocardial

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены