JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целевых генов редактирования с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 значительно облегчило понимание биологических функций генов. Здесь мы используем методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 модель calreticulin мутации в cytokine зависимых гемопоэтических клеток с целью изучения их онкогенного действия.

Аннотация

Кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-это система адаптивного иммунитета в прокариотах, был многоцелевых учеными для создания РНК руководствуясь nucleases, таких как связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) 9 для конкретных участков генома эукариот редактирования. Геном инженерии, Cas9 используется для эффективно, легко и надежно изменения эндогенного гены во многих линий обеспечить соответствующие mammalian клетки и организмы. Здесь мы покажем пример как использовать методологию ТРИФОСФАТЫ/Cas9 чтобы понять биологические функции специфических генетических мутаций. Мы модель calreticulin (CALR) мутации мышиных интерлейкина-3 (mIL-3) зависит от pro-B клеток (Ba/F3) путем доставки одного руководство РНК (sgRNAs) ориентация эндогенный Локус Calr в конкретном регионе, где вставки или удаления (indel ) CALR мутации происходят в больных с миелопролиферативных новообразования (MPN), тип рака крови. SgRNAs создать двойной нити перерывы (DSBs) в регионе целевых, которые ремонтируются к концу номера гомологичных присоединения (NHEJ) дать indels различных размеров. Затем мы используем стандартного анализа Сотовый трансформации Ba/F3 чтобы понять эффект физиологического уровня выражения Calr перегласовок на кроветворную Сотовый трансформации. Этот подход может быть применен к другим генам для изучения их биологические функции в различных линий клеток млекопитающих.

Введение

Технология ТРИФОСФАТЫ/Cas9 недавно революцию, изменения целевых генома в живых клеток и организмов. Она стала чрезвычайно мощный инструмент для биомедицинских исследований и в настоящее время используются в качестве возможности для лечения генетических заболеваний1. Основой для всех инструментов редактирования генома опирается на создание нуклеиназы индуцированной ДНК двойной мель перерыв (DSB) в геномной локусе изменение. DSBs могут быть отремонтированы, не гомологичных конец присоединение (NHEJ) или ориентированные на гомологии ремонт (HDR)2,3. Преимущество Cas9 Нуклеаза над другими генома, инженерных nucleases, таких как цинк палец nucleases (ZFNs) и транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) является его зависимость от РНК для ориентации нуклеиназы к желаемой последовательности ДНК, по сравнению для взаимодействий протеин дна, в ZFNs и Таленс2,3.

После открытия ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Нуклеаза путь как адаптивной иммунной системы в прокариотических клеток4,5много усилий прошла в адаптации путь для использования в mammalian клетки линии и модель организмов2, 3. как инструмент для редактирования гена, путь ТРИФОСФАТЫ/Cas9 использует два основных компонента: Streptococcus pyogenes (Sp), полученных Cas9 Нуклеаза и sgRNAs ориентации гена интереса2,3. SgRNA состоит из 20 нуклеотидов, прямые Cas9 для определенного сайта на геном через РНК-ДНК пары взаимодополняемости2,3. Целевой сайт sgRNA должны лежать рядом прилегающих мотив (PAM) сайт protospacer в виде 5' NGG, который признан SpCas9 нуклеиназы. С помощью этих инструментов Cas9 могут быть направлены в любой последовательности ДНК, разработав sgRNAs этой целевой области интереса. В дополнение к Sp производным Cas9, есть дополнительные варианты для Cas9 с различными функциями в зависимости от конкретного приложения. К примеру есть варианты Cas9 с более высокой специфичности для редактирования на цель или потенциала сингл нить расщепления ДНК, уменьшение поперечного сечения6,7. Кроме того каталитически неактивных Cas9 недавно была разработана для регуляцию8. Теперь ученые использовали ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для различных приложений, таких как ген knockin и нокаут для изучения биологических функций и генов9, функция потерь и усиления функции библиотеки экраны10 Разработка модели организмов11.

В этом протоколе мы сочетаем методологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 с Пробирной Сотовый трансформации Ба/F3 чтобы понять биологические функции CALR перегласовок. BA/F3 клеток являются мышиных Ил-3 зависимых гемопоэтических клеток линии, которая может быть оказана Ил-3 независимых выражение определенных онкогенов как BCR-ABL12. Для того чтобы понять ли мутантов calreticulin может превратить Ba/F3 клеток цитокина независимого роста, мы ориентированы Эксон 9 эндогенного Calr локус, используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 представить indel мутации и затем удалились Ил-3 от клетки, чтобы применить положительный выбор давление, с целью изложив получить из функция CALR мутации в MPN пациентов. Протокол включает в себя дизайн, клонирование и доставки sgRNAs, развитие стабильных Cas9 выражая клеток и скрининга для ТРИФОСФАТЫ на цель гена редактирования. Этот протокол может применяться для различных генов и различных цитокинов зависимых клеток линии интерес и является особенно ценным в области моделирования и изучение биологической функции генов, участвующих в рак.

протокол

1. sgRNA дизайн с использованием онлайн инструменты13

  1. Дизайн sgRNAs ориентации гена интереса, с помощью бесплатных онлайн инструментов.
    1. Скопируйте и вставьте NCBI ссылка последовательности гена интереса в широкой институт sgRNA дизайнер веб-инструмент: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Примечание: Этот инструмент идентифицирует sgRNA последовательности с расщепления сайтов в пределах экзонов и те, которые охватывают границы Интрон/экзона но все же прилепится в пределах экзона.
    2. Скачать и открыть выходной текстовый файл в excel.
    3. Фокус на столбцы заполняются sgRNA последовательностей и контекст sgRNA последовательности. Обратите внимание, что не содержат последовательности sgRNA protospacer рядом мотив (PAM), но в контексте последовательности делать.
    4. Обратите внимание, что показатель эффективности на цели перечислены Оценка эффективности предсказал расщепление в масштабе от 0 до 1, где показатель 1 обозначает более высокой эффективности расщепления.
    5. Используйте функцию «вид» excel либо заказать целей, оценка эффективности или расположение внутри ген целевого объекта через колонку «% целевой Cut».
      Примечание: Сортировка по расположению в пределах ген полезен для выявления sgRNAs, определенного домена или экзона интерес.
    6. Выберите 3-6 sgRNAs, которые целевые области интересов с высокой (> 0,6) на цели оценки эффективности. Это может быть полезно знать, какие виды мутации могут быть ответственны за фенотипа желаемого (см. рис. 1 , объясняя нацеленности стратегия, используемая для calreticulin).
      Примечание: sgRNAs ниже предлагается оценка порога 0.6 эффективность следует рассматривать при недостатке других хороших кандидатов.
    7. Используйте средство web анализ gRNA MIT экран для потенциальных эффектов пробить (http://crispr.mit.edu/). Для каждого sgRNA выбран выполните последовательности целевых объектов (включая PAM).
      Примечание: Институт широкой sgRNA дизайнер веб-инструмент может также использоваться экран-целевого воздействия (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Обратите внимание, что средство анализа MIT sgRNA забил каждый sgRNA по шкале от 1-100, где 100 баллов обозначает выше специфика. Оценка более чем 70 идеален и представляет sgRNA с минимальными последствиями пробить. Этот сайт также генерирует список хитов пробить с их расположения в геноме и сколько не соответствует каждый из них с руководством кандидата.
        Примечание: Пробить хиты с четырьмя несоответствия или более, считаются безопасной14. Пробить хиты с менее чем четырьмя несоответствия может быть проблематичным, если они попадают в экзонов14.
    8. Выберите 2-3 sgRNAs который целевой различных местах в пределах региона интерес для целевых генов, и которые имеют самые высокие оценки эффективности и пробить парных расщепления (см. таблицу 1 для sgRNA последовательностей, ориентация Эксон 9 Calr).
      Примечание: В зависимости от экспериментальных целей, больший акцент могут быть возложены разные значения, полученные от упомянутых инструментов.

2. клонирование sgRNA Oligos13

  1. Генерировать вперед oligo
    1. Создайте список последовательностей sgRNA без сайта PAM.
    2. Добавление G к 5' концу последовательности, если к 5' концу последовательности sgRNA не G.
      Примечание: Этот G необходим для максимального уровня транскрипции U6-управляемый sgRNA. Добавление G является необходимой для m1 sgRNA (Таблица 1).
    3. Добавить последовательность «CACC» ' конец 5 G-оптимизированный руководство последовательности (не PAM) (Таблица 2) для того, чтобы генерировать свесы, необходимые для перевязки отожженная oligos в BsmBI усваивается lentiGuide вектор (см. шаг 3).
  2. Генерировать обратную oligo
    1. Реверс дополняют G-оптимизированный руководство последовательности (не PAM).
    2. Добавление последовательности «AAAC» к 5' концу обратный дополняет Руководство G-оптимизированные последовательности (Таблица 2).
    3. Порядок разработан oligos от компании синтез праймера.
  3. Отжиг и фосфорилировать oligos
    1. 1 мкл вперед oligo (100 мкм), 1 мкл обратного oligo (100 мкм), 1 мкл 10 x T4 лигирование буфера, 0.5 мкл T4 полинуклеотид киназы (ПНК) и 6,5 мкл H2O для ПЦР-пробирку (всего = 10 мкл).
    2. Запустите следующую программу в Термоциклер: 37 градусов за 30 мин., 95 ° c за 5 мин, Нагрейте от 95 до 25 на 0,1 ° C/сек.
    3. Разбавить продукт реакции на 1: 250 H2O.

3. пищеварение lentiGuide-Puro вектор13

  1. Дайджест lentiGuide-Puro вектор
    1. Соберите 50 мкл пищеварение реакции со следующими компонентами: 5 мкг круговой плазмида, 2 мкл (30 единиц) энзима ограничения BsmBI, 5 мкл буфера энзима ограничения и до 50 мкл H2O.
    2. Запуск реакции втечение 2 ч при температуре 55 ° C. После первого часа добавьте 1 мкл больше энзима ограничения BsmBI.
  2. Dephosphorylate вырезать позвоночник
    1. Добавление 7 мкл буфера реакции фосфатазы и 2 мкл фермента фосфатазы переваривается вектор.
    2. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
  3. ПЦР очистить, вырезать и dephosphorylated позвоночника с использованием коммерческих комплект.
    Примечание: Заменить предоставленного розовый цветные столбцы с комплектом алкалический синий цветные столбцы так, как они лучше могут разместиться большой плазмида размеров. Доходность может быть увеличен путем нагревать Элюирующий буфер в блоке 90 градусов тепла до элюции и элюирующие ДНК из столбца дважды в конце (запустить eluted дна от первого элюции обратно через во второй раз).

4. Перевязка ofAnnealed Oligos в переваривается позвоночника-13

  1. Добавьте 50 нг переваривается позвоночника, 1 мкл отожженных oligo разрежения, 1 мкл 10 x T4 лигирование буфера, 1 мкл лигаза T4 и до 10 мкл H2O для ПЦР-пробирку. Инкубировать 1 час при комнатной температуре
  2. Преобразование Stbl3 клетки с 2 мкл реакции перешнуровки. Пластины на пластину агар бульон (LB) lysogeny с 100 мкг/мл Ампициллин и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
  3. Выберите 3 колоний и инокуляции в мини-prep культуру.
  4. Проверка правильного oligo вставки
    1. Выполните алкалический для каждой культуры и последовательности через oligo вставки сайте, начиная с грунтовки в промоутер U6, с использованием коммерческих комплект.
    2. Выполните midi-prep или макси prep проверить последовательность культуры.

5. поколения клетки lLines стабильно выражая SpCas9

Примечание: Этот протокол включает поставку плазмида pLX_TRC311-Cas9, лентивирусные инфекции. Этот Протокол описан в деталях для мышиных интерлейкина-3 (mIL-3) зависимых pro-B (Ba/F3) клеток, клеток линии подвеска и могут быть адаптированы для других типов клеток, используя предпочитаемый культуры условий для каждого типа клеток. Питательной среды для Ба/F3 клеток состоит из RPMI дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина/L-глютамина и 10 нг/мл мышиных Интерлейкин 3.

  1. Transfect ГЭС 293T клетки
    1. Заполнение ячеек6 ГЭС 293T 3 x 10 на 10 см ткани культуры блюдо. Держите посеян клетки на ночь перед transfection.
      Примечание: ГЭС 293T клетки линию адэрентных клеток и обычно используются для производства вирус. Клетки поддерживаются в DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина/L-глютамина. Во время transfection клетки должно быть 80% притока.
    2. Предварительно теплой сокращение сыворотке СМИ (Opti-MEM) и среднего роста.
    3. Добавьте 500 мкл сокращение сыворотке СМИ, 7 мкг конструкцию pLX_TRC311-Cas9, 4 мкг плазмида pCMV-VSV-G лентивирусные упаковки и 4 мкг лентивирусные упаковки плазмида psPAX2 в трубку
      Примечание: Общая ДНК за 10 см блюдо 293T клеток — 15 мкг.
    4. Хорошо перемешайте ДНК и 45 мкл Реагента transfection. Осторожно перемешать и дать постоять 20 минут.
      Примечание: Важно использовать сокращение сыворотке СМИ, потому что сыворотка будет тормозить комплекс формирования между трансфекции реагента и плазмидной ДНК.
    5. Аспирационная старой среды в 293T пластины и добавьте 5 мл нового среднего роста.
    6. Добавьте смесь реагент ДНК и трансфекции мудрым образом падение на 293T пластину. Вихревой мягко и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
    7. Урожай вирусный supernatants на 24 и 48 h пост transfection. Проходят через 0,22 мкм фильтром и Алиготе в cryovial трубу (1.6/мл и 1,5 мл будет использоваться для инфекции).
    8. Хранить вирусный супернатант-80 ° c.
      Примечание: лентивирусные супернатант может использоваться в течение 6 месяцев. Если возможно, spinfection transductions должны быть выполнены с свежий вирус).
  2. Лентивирусные инфекции Ba/F3 клеток
    1. Оттепель вирусный супернатант на льду, если заморожен.
    2. Центрифуга клетки на 300 x g на 4 мин.
    3. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в концентрации 3 х 106 клеток/мл.
    4. Ресуспензированы клетки, 1,5 мл вирусных супернатанта, 4 мкл Полибрен 500 мкл (фондовой: 2 мг/мл) и 10 нг/мл m-уровня IL3 в пластине 6-ну тканевые культуры. Убедитесь в том включить неинфицированных хорошо с 1,5 мл СМИ вместо вирусных супернатанта как элемент управления.
      Примечание: Количество вирусных супернатант добавил должна соответствовать кратности инфекции (МВД) < 1.
    5. Центрифуга пластину на 440 x g для 120 минут при 37 ° C.
    6. Возьмите пластину из центрифуги и место в 37 ° C и 5% CO2 инкубатора и позволяют выращивать на ночь.
    7. Спин вниз клетки после 24 часов и Ресуспензируйте с 5 мл свежей теплой СМИ в пластине 6-хорошо.
  3. Выбор Cas9 инфицированных клеток
    1. Спин вниз клетки и Ресуспензируйте с свежий теплый СМИ с 5 мкг/мл blasticidin, 48 h пост spinfection.
    2. Выделите ячейки, на 9 дней с blasticidin или до тех пор, пока клетки неинфицированных (отрицательный) управления мертвы.
    3. После завершения выбора передачи устойчивостью клеток к средству с низкой концентрации blasticidin.

6. репортер Assay для Cas9 деятельности15

  1. Передают родительской клетки и клетки, стабильно выражая Cas9 с pXPR-011 лентивирусные инфекции (см. шаги 5.1-5.2).
    Примечание: Этот вектор содержит GFP и руководство ориентации GFP. Ячейки, содержащие активные Cas9 приведет к сокращению GFP (рис. 2).
  2. Выделите ячейки для 3 дней с 2 мкг/мл puromycin, 48 h пост spinfection.
  3. Анализировать образцы для экспрессия гена GFP в проточной цитометрии.
    Примечание: GFP сокращение 50% или более представляет оптимальное Cas9 активность. Более высокую концентрацию blasticidin выбора могут быть использованы для повышения активности Cas9, если меньше, чем наблюдается снижение на 50%. Не все клеточные линии может терпеть blasticidin отбора. В этом случае использование Cas9 векторов с другими выбор кассеты могут быть необходимы. Кроме того не все клеточные линии может терпеть стабильной выражение Cas9. В этом случае может использоваться переходные transfection Cas9.

7. Spinfection sgRNAs в Cas9 выразить клетки

  1. Выполните шаги 5.1-5.2 лентивирусные инфекции sgRNAs в клетки интереса.
    Примечание: На шаге 5.1.3, замените конструкцию pLX_TRC311-Cas9 lentiGuide-Puro конструкции, проверки из раздела 4.
  2. 48 ч пост spinfection, выделите ячейки в течение 3 дней с 2 мкг/мл puromycin.
  3. Передача устойчивостью клеток к средству с низкой концентрации антибиотиков и продолжить выбор еще 4 дней для редактирования достаточно.

8. Ba/F3 Сотовый трансформации и позитивного выбора с помощью m-уровня IL3 вывода

Примечание: Этот assay описан для зависимых ячеек Ba/F3 mIL-3, но может быть применен к любой линии цитокина зависимые ячейки.

  1. Уменьшается экспоненциально растущей ба/F3 клеток выразить ectopically Cas9 и sgRNA интерес.
  2. Аспирационная супернатант и вымыть клетки с 5 мл из фосфата буфер солевой (PBS).
  3. Спин вниз клетки и повторите шаг мыть в 8.2 четыре раза (этот шаг гарантирует, что средства массовой информации является бесплатным Ил-3).
  4. Аспирационная PBS и Ресуспензируйте клетки в 5 мл свежего СМИ без Ил-3.
  5. Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или анализатор жизнеспособность клеток.
  6. Семя ячеек в трех экземплярах в пластине 6-ну тканевой культуры в концентрации 1 х 105 клеток/мл в общем объеме 2 мл свежего СМИ без Ил-3.
  7. Мониторинг и подсчитать количество ячеек каждые 2 дня в общей сложности 8 дней.
    Примечание: Ba/F3 клеток не хватает Ил-3 обычно умирают 2 дней поста Ил-3 голода. Важно включить отрицательный контроль в assay (обычно ненацеливания руководство используется как элемент управления).

9. Скрининг для редактирования ТРИФОСФАТЫ на цель

  1. Дизайн ТРИФОСФАТЫ скрининг грунтовки вверх и вниз по течению от расщепления сайта sgRNA
    Примечание: используйте грунты по крайней мере 100 bp с сайта предсказал расщепление чтобы убедиться, что обнаружение не быть затронуты большой вставки или удаления (indel) на целевом сайте sgRNA.
  2. Изолируйте genomic дна (геномная ДНК) от трансформированных клеток (в конце кривой роста) и клетки pre цитокинов вывода.
    Примечание: Всегда включайте клеток, экспрессирующих ненацеливания руководство как элемент управления для редактирования ген. Изоляция геномная ДНК от клеток до и после преобразования будут идентифицировать клоны, которые положительно были выбраны для и пролиферативной преимущество.
  3. Соберите 50 мкл ПЦР со следующими компонентами: 25 мкл 2 x PCR микс, 1 мкл вперед грунтовка (10 мкм), 1 мкл обратного праймера (10 мкм), 50-100 нг геномная ДНК, и H2O до 50 мкл.
    Примечание: Многочисленные высококачественные полимеразы могут использоваться на шаге 9.3.
  4. Запуск образцов в Термоциклер, используя следующие параметры: 95° C в течение 1 мин, 30 циклов (94 ° C в течение 1 мин, 52 ° C за 30 сек, 72 ° C за 30 s) и 72 ° C в течение 10 мин. Этот ПЦР оптимизирован для грунтовки Calr , перечисленных в таблице 3. Оптимизация условий PCR для пары праймера, разработан в шаге 9.1, основанный на тестирование на геномная ДНК.
  5. Запуск 5 мкл образцов на 2% агарозном геле на 10 V/см с помощью 1 x буфера Tris ацетат ЭДТА (ТЭ). Изучение образцов на наличие / отсутствие усиливается группы соответствующий размер для гена интереса.
  6. Используйте оставшуюся часть реакции PCR (45 мкл) для выполнения очистки ПЦР.
  7. Клон ампликонов с PCR клонирования комплект в вектор плазмиды. К примеру pGEM T-легко векторов обычно используются.
  8. Превратите плазмида Stbl3 клетки или другие совместимые клетки и пластину на плиты агара LB с соответствующими антибиотиками. Выберите 10-20 колоний, Мини-prep, каждый из них и при условии каждый клон Сэнгер последовательности характеризовать indels, созданный из ТРИФОСФАТЫ/Cas9 редактирования.
    Примечание: При желании, активированных флуоресцированием одной ячейке, сортировки (FACS) могут быть выполнены на основную редактировать населения изолировать клон с конкретным indel. Кроме того может использоваться следующее поколение виртуализации (НГС) методы более надежно определить целевые редактирования с помощью глубокую секвенирование ампликонов ПЦР, охватывающих sgRNA целевого региона. Например отслеживание Indels разложения или ПРИЛИВА может использоваться вместо subcloning для точного определения спектра и частота целевых мутаций, созданные в пуле клеток (https://tide.nki.nl/#about)16.

Результаты

С помощью метода, описанного здесь, Цель этого эксперимента является изучение функциональных последствий внедрения indel мутации на эндогенный Локус Calr на преобразование гемопоэтических клеток. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система используется в качестве инструмента для созда?...

Обсуждение

Здесь мы продемонстрировать использование ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования для изучения биологической функции CALR перегласовок в гемопоэтических клеток. Успех этого протокола сильно зависит от нескольких факторов. Во-первых важно знать, какие виды мутации могут быть ответствен...

Раскрытие информации

У нас нет конфликтов интересов, связанных к настоящему докладу.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH (R01HL131835), премии клинический исследователь Damon Раньон и Старр рака консорциума.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BsmBINew England BiolabsR0580L
BlasticidinSigma Aldrich15025
PuromycinLife TechnologiesA1113803
Stbl3 cellsLife TechnologiesC737303
TransIT-LT1Thermo Fisher ScientificMIR2300
Opti-MEMLife Technologies51985034
RPMIThermo Fisher ScientificMT10040CV
DMEMThermo Fisher Scientific10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Omega ScientificFB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamineLife Technologies10378016
mIL-3Peprotech213-13
psPAX2AddgeneN/A
pCMV-VSV-GAddgeneN/A
pLX_TRC311-Cas9AddgeneN/A
polybreneSigma AldrichH9268
pXPR-011AddgeneN/A
Phosphate Buffered Saline (PBS)Genessee Scientific25-507
TAE bufferThermo Fisher ScientificFERB49
LentiGuide-PuroAddgenePlasmid #52963
PNKNew England BiolabsM0201S
T4 ligaseNew England BiolabsM0202S
PCR purification kitQiagen28104
Miniprep kitQiagen27104

Ссылки

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131Cas9sgRNAcalreticulin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены