JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод для достижения стабильной интеграции гена интереса в геноме человека транскрипционно регулируемой системой Спящая красавица . Как сообщается, подготовка интеграции дефектных лентивирусные векторы, трансдукция в пробирке клеток человека и молекулярного анализа на transduced клетки.

Аннотация

Спящая красавица (SB) transposon система-вирусных интеграции с доказанной эффективностью для переноса генов и функциональной геномики. Для оптимизации механизма transposon SB, заняты транскрипционно регулируемых гиперактивный Транспозаза (SB100X) и на основе T2 transposon. Как правило Транспозаза и transposon плазмиды transfection временно предоставляются и SB100X выражение определяется учредительными промоутер. Здесь мы описываем эффективный метод для доставки компонентов SB для клеток человека, которые устойчивы к несколько методов трансфекции физические и химические, контролировать выражение SB100X и стабильно интегрировать ген интереса (ГОИ) через «вырезать и вставить» SB механизма. Выражение гиперактивный Транспозаза жестко контролируется системой тет-ON, широко используется для управления экспрессии генов с 1992 года. Гена интереса в окружении Перевернутый повторяется (IR) T2 transposon. Оба компонента SB упакованы в интеграции дефектных лентивирусные векторы временно производится в HEK293T клетках. Клетки человека, линии клетки или клетки первичной из тканей человека, находятся в vitro временно преобразованы с вирусных векторов. После добавления доксициклин (dox, тетрациклин аналоговый) в питательной среды доработки Транспозаза выражение измеряется и приводит длинный длительный интеграции гена интереса в геноме клеток лечение. Этот метод является эффективным и применимым к клеточной линии (например, клетки HeLa) и главные ячейки (например, человека первичной кератиноцитов) и таким образом представляет собой ценный инструмент для генной инженерии и передача терапевтических генов.

Введение

Гиперактивный SB100X Транспозаза, в сочетании с transposon на основе T2 уже используется в доклинических гена терапии приложения1,2,3, геном модификации4,5, и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) перепрограммирования6,7. Как правило компоненты SB временно предоставляемые плазмида transfection и сильный промоутер учредительный диски выражение Транспозаза. Однако несмотря на улучшение новых методов трансфекции, поставка системы 2 компонентных остается проблемой для многих приложений. Таким образом разработка нового протокола доставки имеет растущий интерес. Помимо методов трансфекции для плазмида8 и мРНК9, вирусный доставки на основе аденовирусных10,11аденоассоциированный вирусный (AAV)12, бакуловирусы13, gammaretroviral14 и в прошлом был предложен лентивирусные векторы15 . В частности системы выбора должны гарантировать переходных доставки компонентов SB без интеграции вирусный вектор. Тем не менее учредительный выражение Транспозаза поднимает проблемы безопасности ввиду опасности неконтролируемого rehopping transposon.

Таким образом регуляцию SB100X системой изысканный тет-ON является первой задачей. Клонированные изменение тет отзывчивым промоутер, полученные путем замены оригинального промоутер развитых минимальной цитомегаловирусом (CMV) с минимальными промоутер (-81) гена Timidine киназы (ТЗ) вирус простого герпеса-1 (ВПГ-1)16, вверх по течению КДНК SB100X (pTetOTKSB100X). Мутировавшие реверс тетрациклин transactivator rtTA2s-17 м2 выражается под контролем сильного учредительный промоутер (phosphoglycerate промоутер, ПГК) клонирован в различных плазмида (НКПС PGKrtTA2S-м2). При добавлении к питательной среды, dox связывает rtTA2s-модулятор м2 и тросов тет промоутер сложных или, полученный в жестко регулируемых индукции SB100X выражение18.

Вторая основная задача возникает от неэффективных transfection клетки человека первичной несколько физических и химических методов. Для эффективной доставки Транспозаза в клетках человека устойчив к трансфекции, SB100X и rtTA2s-м2 выражение кассеты упаковываются в два интеграции дефектных лентивирусные векторы (IDLVs)19: IDLVTKSB и IDLVrtTA2s- М2. Вирусных векторов временно производятся как третьего поколения векторов в HEK293T клетки20 и pseudotyped с гликопротеина G вируса Vescicular стоматит (VSV-G), который предоставляет широкий спектр инфекции. Вектор частицы сосредоточены на ultracentrifugation и титруют immunocapture p24 Gag ВИЧ-1. Передавать линии клетки и клетки первичной, вектор частицы complexed с Полибрен и инкубируют с клеток-мишеней в наличие или отсутствие dox. Снадобь зависимо активации выражения SB100X в transduced клетках измеряется количественного RT-PCR (qRT ПЦР)18.

После того, как продемонстрировал тет регулируется SB100X выражение, транспонирования ГОИ (например, Зеленый флуоресцирующий белок, GFP) в целевой ячейке геном следующим молекулярные события, четко схематизируются бак и Миккельсен21. Третий IDLV вектор, перевозящих что выражение кассету для ГОИ, клонированные между IRs T2-transposon (IDLVT2) должен быть построен и упакованы как упомянуто выше. Наконец три IDLV векторов может использоваться эффективно передают клетки человека (например, первичной кератиноцитов) в пробирке и интегрировать ГОИ присутствии доксициклин18.

протокол

1. плазмид занятых

Примечание: Плазмида НКПС PGKrtTA2S-м2 был любезно предоставляемый профессор Zappavigna (Университет Модены и Реджо-Эмилии, Модена, Италия). PCMVSB100X плазмиды, перевозящих кодирующая последовательность гиперактивный Транспозаза и transposon плазмиды pT2/BH были любезно предоставленных профессор з. Ivics (Институт Пауля Эрлиха, Ланген, Германия) и профессор з. Izvak (центр Макса Дельбрюка молекулярной медицины, Берлин, Германия).

  1. Для всех форм клонирования в Escherichia Coli (E. coli), следуйте клонирования стратегия выбора и энзима ограничения процедуры или амплификации PCR фрагмента клонируемую.
    Примечание: В таблице 1 приведены все плазмид, используемые в настоящем Протоколе. Описание и ссылки для каждой плазмида предоставляются.

2. вирусный вектор производство

Примечание: Все вирусных векторов производятся в биологической капот на BSL2 уровне биобезопасности сдерживания согласно институциональных норм и правил.

  1. Культура сторонником HEK293T клетки в Дульбекко изменение орел среднего дополнена 10% HyClone сыворотки, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином и глютамин 2 мм.
  2. День 0: Подготовьте пять 15 см пластины/вирусной подготовки и семян 5.5x106 ячеек в 30 мл среды.
  3. День 1: Transfection
    1. Перед началом трансфекции, подготовьте 100 мл физраствора буфера 2 x HEPES (ОБД):
      NaCl (5 М) 5,6 мл
      HEPES (1 М) 10,0 мл
      Na2HPO4 (0,5 М) 0,3 мл
      Стерильная вода 84,1 мл
      Отрегулируйте к пэ-ашу 7.1 с 37% HCl.
      Примечание: 2 x HBS можно хранить при 4 ° C. Точное рН является чрезвычайно важным для эффективного transfection. Оптимальный рН-7.10 в 7.12.
    2. Удаление средних и добавьте 22,5 мл/тарелка свежих средних 4 ч до transfection.
    3. Transfect HEK293T клетки с передачи плазмида, плазмида pMD.Lg/pRRE.D64VInt упаковка, конверт кодирования плазмида pMD2.G и pRSV-Rev (Таблица 1) согласно следующей суммы/пластину:
      Передача плазмида 25.00 мкг
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 мкг
      pMD2.G 8,75 мкг
      pRSV-Rev 6,25 мкг
      Примечание: Плазмида ДНК готовятся согласно протоколу CsCl описал Маниатис22 или используя набор очищения плазмиды эндотоксинов бесплатно.
      1. Ресуспензируйте 56,25 мкг ДНК (смесь 4 плазмид) в 1,125 мл стерильной воды и 125 мкл 2,5 М CaCl2 (решение A).
      2. Добавьте 1.250 мл 2 x HBS конические пластиковых пробирок стерильные 15 мл (раствор B).
      3. Добавить решение (1.250 мл) B (1.250 мл) каплям при восходящей с 1 или 2 мл пипетки (трансфекции решения, общий объем 2.500 мл).
      4. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (RT).
      5. С помощью P1000 микропипеткой, распространите все решения трансфекции (2.500 мл) в монослое клеток каплям.
    4. Инкубируйте на ночь в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, 5% CO2.
  4. День 2: Удалите среды и добавляют 15 мл свежего среды (см. шаг 2.1).
  5. День 3: Сбор и сконцентрировать лентивирусные частиц содержащих супернатант.
    1. Собирать супернатант (~ 70 мл) от всех (n = 5), transfected клеток пластины фильтра через 0.45 мкм PESS фильтра и заполнить 2 polyallomer трубы (1-дюйма x 3,5 дюйма) / вирусный подготовки.
    2. Концентрата вектор частицы ultracentrifugation в 106000 x g для 2,5 ч, при 15 ° C с тормозом.
    3. Сразу же после остановки ultracentrifugation (чтобы избежать ресуспендирования гранул в трубку), осторожно налить супернатант в контейнер, содержащие отбеливатель 10% и приостановить 2 едва видны гранулы в 100 мкл ПБС (+ 1% BSA). Это нормально, как гранулы ясно и очень маленький. Используйте концентрированный вектор свежеприготовленные, или аликвота и хранить вирусных препаратов-80 ° c.
      Предупреждение: Супернатант содержит лентивирусные частицы, которые должны быть тщательно отбеленные прежде чем выбросить в биологически опасных отходов.
  6. Для Титруйте вирусный вектор подготовки, используйте набор immunocapture p24 Gag ВИЧ-1, согласно протоколу производителя.
    Примечание: Чтобы стандартизировать производство вирусный вектор, могут быть использованы на основе липосом реагентов. Тем не менее титр вирусных вектор сильно зависит эффективность трансфекции и чистоты плазмидной ДНК.

3. трансдукции линий клеток человека (например, клетки HeLa)

Примечание: Клетки HeLa культивируемых в среде Дульбекко изменение орла с 10% плода телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином и глютамин 2 мм. В таблице 1 перечислены все векторов, используемые в настоящем Протоколе. Представлено описание для каждого вектора. Трансдукция клеток HeLa позволяет проверить регуляцию SB Транспозаза в лучших дозы комбинации двух векторов, IDLV. Вариация IDLV доз могут быть связаны с вектор частицы титрования и целевой тип ячейки.

  1. День 0: Семян 2 x 105 клеток в 3 мл среды для каждой скважины 6-ну плиты. Подготовка 4 скважины.
  2. День 1: Трансдукции НеЬа клетки.
    1. Для каждого условия, разбавить лентивирусные векторы для заключительного тома 1 мл среды (см. примечание выше) в присутствии 10 мкл Полибрен (конечная концентрация 8 мкг/мл):
      Разбавление хорошо # 1: макет transduced клетки (отрицательный контроль).
      Разбавление хорошо # 2: IDLVTKSB вектор (2600 нг p24).
      Разведение для скважин #3, #4: IDLVTKSB вектор (2600 нг p24) + IDLVrtTA2s-вектор м2 (9600 нг p24).
    2. Удалите носитель из каждой скважины, где клетки НеЬа были покрытием в день 0 и добавьте лентивирусные вектор разведений в соответствующий хорошо.
    3. Spinoculate 6-ну пластины в 754 x g за 45 минут на 20-25 ° C, а затем передачи пластину 6-ну инкубатор культуры клеток при 37 ° C и 5% CO2.
    4. После 6 часов замените свежей среды на всех скважинах средних содержащие векторов и добавьте доксициклин 1 мкм в хорошо #4. Положите пластину в инкубатор культуры клеток при 37 ° C за 48 ч.
  3. День 3: Подготовка клетки Пелле извлечение RNA.
    1. Перед отсоединением клетки, приготовьте рабочий раствор трипсина (1 x):
      2,5% трипсина (10 x) 5,0 мл
      500 мм ЭДТА (конечная концентрация = 5 мм) 0.5 мл
      1 x 44,5 PBS мл
    2. Теплый трипсина рабочего раствора при 37 ° C перед использованием. Сохранить рабочий раствор трипсина на 4 ° C.
    3. Удаление средних и вымыть клетки с ПБС. Добавить 0,5 мл подогретым 37 ° C трипсина рабочего раствора в каждой скважине и инкубировать при 37 ° C 7 мин (в инкубатор культуры клеток).
    4. После инкубации, добавить 0,5 мл сыворотки содержащих среднего для каждой скважины для инактивации трипсина и собирать клетки в пластиковых пробирок. Промыть хорошо один раз с 3 мл ПБС и центрифуги суспензию клеток для 5 мин на 240 x g.
    5. Вымыть клетки с 5 мл 1 x PBS, центрифуги для 5 мин на 240 x g и удалить супернатант. Используйте свеже собранных клеток гранулы или хранить при температуре-80 ° C. Извлечение всего РНК из окатышей для выполнения полуколичественного RT-PCR (см. шаг 6).

4. трансдукции начальных клеток человека (например, кератиноциты)

Примечание: Человека первичной кератиноцитов посеяна на смертельно облученного 3T3-J2 клетки (фидер слой)23, рода подарок от Янь Barrandon (EPFL, Лозанна, Швейцария).

  1. Рост клеток 3T3-J2 Швейцарский мыши в Дульбекко изменение орел среде с 10% доноров бычьим сывороточным, 50 ед/мл пенициллин стрептомицином и глютамин 4 мм (средний 3T3).
  2. Расти кератиноциты, покрытие на смертельно облученного 3T3-J2 клетки в cFAD средний, Дульбекко изменение Eagle среднего и ветчиной F12 СМИ смесь (3:1) содержащий плода бычьим сывороточным (10%), пенициллин стрептомицином (1%), глютамин (2%), инсулин (5 мкг/мл), аденин ( 0,18 мм), гидрокортизон (0,4 мкг/мл), токсинного холеры (0.1 Нм) и трийодтиронин (2 Нм).
  3. День 0: Семя 3 x 105 смертельно облученных клеток 3T3-J2, предварительно разводят в 3T3 среднего до конечной концентрации 1 Х 105 клеток/мл в каждую лунку 6-ну пластины. Подготовьте 9 скважин.
  4. День 1: Трансдукции первичного кератиноцитов
    Примечание: Трансдукции кератиноцитов позволяет количественная оценка регуляцию SB Транспозаза в лучшие комбинации двух векторов IDLV (qRT-PCR) и проверки интеграции ГОИ (ГПУП) в клетки-мишени (по cytofluorimetric анализ).
    1. Перед отсоединением клетки, приготовьте рабочий раствор трипсина:
      0,5% трипсина ЭДТА (10 x) 5,0 мл
      500 мм ЭДТА (конечная концентрация = 5 мм) 0.5 мл
      1 x 44,5 PBS мл
    2. Теплый трипсина рабочего раствора при 37 ° C перед использованием. Сохранить рабочий раствор трипсина на 4 ° C.
    3. Чтобы отсоединить subconfluent кератиноцитов в культуре, удалите среднего, вымыть клетки с ПБС и добавить 1 мл раствора рабочего подогретым трипсина в каждой скважине. Инкубируйте при 37 ° C 15 мин в инкубатор культуры клеток.
    4. После инкубации клеток хорошо Ресуспензируйте тщательно и передать пластиковых пробирок, содержащий 2 мл сыворотки, содержащего суспензию клеток среднего (если многие клетки по-прежнему прилагаются, Проинкубируйте дополнительных минут при 37 ° C). Промыть хорошо один раз с 3 мл 1 x PBS или свежие среднего и добавить полоскания решение для пластиковых пробирок с суспензию клеток.
    5. Центрифуга для 5 мин на 580 x g и удалить супернатант.
    6. Вымыть клетки с 5 мл 1 x PBS, центрифуги для 5 мин на 580 x g и удалить супернатант.
    7. В 15 мл полипропиленовые трубы разбавляют кератиноцитов5 1.6x10 в 1 мл cFAD среды, одного разрежения для каждого условия.
    8. Разбавьте лентивирусные векторы в 1 мл cFAD среды в присутствии 20 мкл Полибрен (конечная концентрация 8 мкг/мл на окончательный объем 2 мл):
      Разведениях для скважин #1, #2, #3: макет transduced клетки (отрицательный контроль без векторов).
      Разведениях для скважин #4, #5: IDLVTKSB вектор (13000 нг p24) + IDLVrtTA2s-вектор м2 (48000 нг p24).
      Разведениях для скважин #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB вектор (13000 нг p24) + IDLVrtTA2s-вектор м2 (48000 нг p24) + IDLVT2 вектор (9,160 нг p24).
    9. Передают клеток в суспензии путем добавления каждого разведения лентивирусные вектор (1 мл) для соответствующего кератиноцитов подвеска (1.6x105 кератиноцитов в 1 мл).
    10. Удалите носитель из смертельно облученного 3T3-J2 клетки осеменены на день 0 и пластины преобразованы кератиноциты (1.6x105 кератиноцитов в 2 мл) на них. После преобразования и приступить к следующему.
    11. Инкубируйте на 25 ° C в течение 30 минут, а затем перенесите клетки до 37 ° C в инкубатор культуры клеток на 6 ч.
      Примечание: Сделать не spinoculate первичной кератиноцитов, как жизнеспособность и распространения будут сильно затронуты.
    12. После 6 часов добавьте 1 mL cFAD среды в каждой скважине. Добавьте 1 мкм доксициклин (конечная концентрация) в скважинах, #5, #8 и #9. Возвращение клетки до 37 ° C.
  5. День 2: Замените 3 мл KC среды с 10 нг/мл EGF среднего cFAD.
  6. День 3: Trypsinize и вымыть клетки из скважин #1, #4 и #5 как описано раньше (см. 4.4.1 в 4.4.6). Заблокировать ячейки окатышей на-80 ° C для извлечения всего РНК для qRT ПЦР-анализа (см. шаг 7).
  7. Trypsinize клетки от хорошо #2, #6 и #8, как описано в шагах 4.4.1 до 4.4.5 и выполнять cytofluorimetric анализ для экспрессия гена GFP (см. шаг 5).
  8. Держите культуры от скважин #3, #7 и #9 на по крайней мере 3-4 удвоений, достаточных для разбавления ООН комплексной IDLVT2 вектор (5 дней для человека первичной кератиноцитов, покрытие на фидер слой).
  9. День 6: Примерно 5 дней пост трансдукции, trypsinize клетки (см. шаги 4.4.1 до 4.4.5) из скважин, #3, #7 и #9 для выполнения анализа cytofluorimetric экспрессия гена GFP (см. шаг 5).
    Примечание: Эксперимент сроков и электромеханической эффективности являются весьма под влиянием главной ячейки типа и изменчивость собранных образцов.

5. Cytofluorimetric анализ на transduced первичной кератиноцитов

Примечание: Проточный цитометр, настроен с голубой лазер (488 нм), красный лазер (633 нм) и фильтров для обнаружения GFP и APC флуоресценции занятых (см. Таблицу материалов).

  1. Различать кератиноцитов от 3T3-J2 фидер слоя, лейбл преобразованы кератиноцитов отдельностоящий в день 3 и 6 (см. шаги 4,7 и 4,9) день с мыши моноклональные APC-конъюгированных антител анти фидера.
    1. Подготовка 4 мл окрашивания буфер для каждого образца:
      5% FBS 200 МКЛ
      500 мм ЭДТА (конечная концентрация = 2,5 мм) 20 мкл
      PBS 1 x 3780 мкл
    2. Стирайте отдельные клетки с 1 мл окрашивания буфера. Центрифуга для 5 мин на 580 x g и удалить супернатант.
    3. В трубке для приобретения цитометрии потока Ресуспензируйте 5 х 104 клетки в 100 мкл окрашивание буфера и добавить 2 мкл антител против подачи (1:50). Хорошо перемешайте и Инкубируйте 30 мин на льду в темноте.
    4. После 30 мин мыть с 2 мл окрашивания буфера. Центрифуга для 5 мин на 580 x g и удалить супернатант. Ресуспензируйте в 200 мкл окрашивания буфера.
    5. Приобрести APC и GFP сигналов, cytofluorimetric анализ18. Часть клетки GFP+ популяции клеток БТР– указывает transduced кератиноцитов.
      Примечание: При необходимости, исправить цветного образца до проточной цитометрии с 2% параформальдегида в PBS 1 x и хранить при 4 ° C в темноте до запуска.
  2. Анализ потока данных цитометрии путем построения соотношение между процент GFP+клеток на конечную точку (5 дней) и процент GFP+клетки 2 дней после трансдукции, нормализуется до остаточного уровня IDLVT2-преобразованы клетки.

6. полуколичественного RT-PCR

Примечание: Используйте ПЦР тепловая велосипедист.

  1. Извлечение RNA от преобразованы или управления ячейки, используя комплект для очистки РНК, по словам производителя протокол.
    Примечание: Общая РНК может храниться при температуре-80 ° C.
  2. Синтез cDNA в 20 мкл реакции с использованием 100 нг всего РНК и обратная транскриптаза комплекта, по словам производителя протокол.
    Примечание: cDNA может храниться при температуре-20 ° C.
  3. Дизайн праймеров для SB100X, rtTA2s-м2 и GAPDH (уборка гена).
    Предлагаемые проекты:
    SB вперед грунтовка: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB обратный грунтовка: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 вперед грунтовка: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 обратный грунтовка: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH вперед грунтовка: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH обратный грунтовка: 5'–CCACCACCCTGTTGCTGTAG–3'
  4. Выполните ПЦР в окончательной реакции объем 50 мкл. В частности Соберите в каждую ПЦР-пробирку следующие реакции:
    cDNA (разбавления 1:5) (из шага 6.2) 1.00 мкл
    Вперед грунтовка (10 мкм сток) 1.00 мкл
    Обратный грунтовка (10 мкм сток) 1.00 мкл
    дНТФ (10 мкм сток) 1.00 мкл
    Буфер (+ MgCl2) (10 x сток) 5.00 мкл
    Taq-полимеразы (5 U/мкл бульон) 0.25 мкл
    Стерильную воду 40,75 мкл
  5. Используйте следующую программу тепловая велосипедист: 1 цикл при 95 ° C за 5 мин затем продолжить с 95 ° C за 30 s, 58 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s для 34 циклов для SB100X, 32 циклов для rtTA2s-M2 и 25 циклов для GAPDH.
  6. Подготовьте гель агарозы 1%. Растворите 1 g агарозы в 100 мл КЭ 1 x (10 x фондовой разводят в стерильной воде), в стакан или настой. Растопите в микроволновке, закрученной каждую минуту до тех пор, пока полностью не растворится агарозы. Охладить расплавленный агарозы до тех пор, пока он достигает приблизительно 50 ° C, а затем добавьте 5 мкл бромид ethidium (10 мг/мл бульона). Налейте растопленное агарозы в собранном каппу с гребнем, для литья гель.
  7. Загрузить образцы (по 10 мкл) на геле агарозы и провести электрофорез.
  8. При желании приобрести картину гель и денситометрических анализ на ПЦР диапазонах.

7. количественного RT-PCR (qRT-PCR)

Примечание: Коммерческая система обнаружения последовательности используется. Праймеры PCR и 6-Карбоксифлуоресцеина (FAM) зонд для Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) приобретаются коммерчески.

  1. Ретро транскрипция шаг 6.2 см.
  2. Используйте программное обеспечение для разработки грунты и зонд конкретных для SB100X.
    Предлагаемая конструкция:
    SB.2 вперед грунтовка: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 обратный грунтовка: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    зонд SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. Выполните Real-Time PCR в 96-луночных пластины с ПЦР Мастер микс и грунтовки + зонд смесь, в окончательном реакции объем 25 мкл. В частности рассмотрим следующие реакции для каждой скважины:
    cDNA (1:10 разрежения в стерильной воде) 1.00 мкл
    2 x Мастер микс 12,50 мкл
    Праймеры + 20 x зонд смешать 1,25 мкл
    Стерильную воду 10.25 мкл
    Примечание: Выполните все реакции в трех экземплярах. Чтобы избежать ошибок, дозирования, готовят смесь для по крайней мере n + 3 реакций (без cDNA). Алиготе, используя многоканальные пипетки.
  4. Запуск ПЦР в реальном времени, используя следующую программу: 1 цикл на 95 ° C в течение 10 мин, затем 40 циклов 95 ° c 15 s и 60 ° C за 1 мин и удерживайте при 4 ° C.
  5. Анализ данных qRT-PCR, нормализующее относительное выражение (значение RQ) SB100X до уровня GAPDH того же образца cDNA, 2–ΔΔCT количественной, используя программное обеспечение для анализа типичных данных.

Результаты

С помощью процедуры представлены здесь, три IDLV векторы нося SB компоненты (SB100X, rtTA2S-transposon м2 и T2-GFP) были упакованы и используется для эффективной доставки и плотно регулировать систему SB в клетках человека. На рисунке 1A показана схема для в vitro т...

Обсуждение

Здесь мы описываем широко доступной методологии стабильно интегрировать ГОЙ в геном клетки-мишени, Спящая красавица-опосредованной транспонирования. Хотя для обеспечения синцитиального метод для изменения генома была разработана система SB, эффективности механизма интеграции (?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Zappavigna профессор, Университет Модены и Реджо-Эмилии, Модена, Италия для предоставления нам НКПС PGKrtTA2S-плазмида м2. Мы также признаем профессор з. Ivics (Институт Пауля Ehlrich, Ланген, Германия) и профессор з. Izvak (центр Макса Дельбрюка молекулярной медицины, Берлин, Германия) для pCMVSB100X и pT2/BH плазмид. Эта работа была поддержана Дебра международного и итальянского министерства университетов и исследований.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-GlutamineLonzaBE12-614FCell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), CharacterizedGE Healthcare Life SciencesSH30071.03Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/mlLonzaDE17-602EReagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mMLonzaBE17-605EReagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal salineLonzaBE17-737EReagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%Merck106580Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)Sigma-Aldrich320331Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injectionFresenius Kabi-Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filterWhatman10462100Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubesBeckman Coulter326823Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, MgLonzaBE17-516FBuffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kitPerkin ElmerNEK50001KTKit for IDLV particle titration.
PolybreneSigma-Aldrich107689Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, MgGIBCOBE17-160EReagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)100938BAnalaR BDHReagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)GIBCO15400-054Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand OriginGIBCO16030-074Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 mediaGIBCO21765Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serumLonzaDE14-801FSerum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia OriginGIBCO10099-141Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreasSigma-AldrichI5500Reagents for keratinocyte growth.
AdenineVWR1152-25Reagents for keratinocyte growth.
HydrocortisoneVWR3867-1Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052Reagents for keratinocyte growth.
TriiodothyronineSigma-AldrichT5516Reagents for keratinocyte growth.
Human EGFAustral BiologicalGF-010-9Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibodyMiltenyi Biotech130-096-099To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134RNA purification kit.
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)Sigma-AldrichD7295Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water(any)-Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start PolymerasePromegaM740BTaq polymerase.
Agarose, for molecular biologySigma-AldrichA9539Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10XInvitrogen15581028Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromideSigma-AldrichE1510Reagent for agarose gel electrophoresis.
DoxycyclineSigma-AldrichD-9891drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, SterileFalcon Corning352096Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, SterileFalcon Corning353025Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, SterileFalcon Corning353046Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mLEppendorf0030 120.086Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mLEppendorf0030 120.094Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free(any)-Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mLApplied Biosystem434690696-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without CapBD Falcon352052Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)(any)-Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)(any)-Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter(any)-Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler(any)-Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment(any)-Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BD-Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR systemApplied Biosystem7900HTEquipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.(any)-Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotorBeckman Coulter-Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

Ссылки

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131transposonON

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены