Микроскопия на основе методов для оценки миграции эпителиальных клеток во время в Vitro заживление ран

Резюме

Эта рукопись описывает, как разрез как поражения на искусственный эпителиальных клеток монослои удобно модель раны исцеления в пробирке, позволяя для воображения, конфокальная или лазерная сканирующая микроскопия, и которые могут обеспечить высокое качество количественные и качественные данные для изучения поведения клеток и механизмы, участвующие в миграции.

Аннотация

Миграции клеток является обязательным аспектом для заживления ран. Создание искусственных раны на животных моделях исследования часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, хотя потенциально не хватает точности. В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает подходящую платформу для исследования миграционных поведение ячейки в заживлении ран и влияние лечения на эти клетки. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются в условиях не притока; Однако этот подход может не напоминают природные условия заживления. Нарушения целостности эпителия механическими средствами создает реалистичной модели, но могут препятствовать применению молекулярных методов. Следовательно, микроскопии основанные методы являются оптимальными для изучения миграции эпителиальных клеток в пробирке. Здесь мы подробно два конкретных методов, искусственного рану скретч пробирного и Фронт assay искусственных миграции, который может получить количественные и качественные данные, соответственно, на мигрирующих производительность эпителиальных клеток.

Введение

Клетки миграции необходим для заживления ран, как он несет ответственность за окончательное закрытие эпителиальных разрыва и восстановлению нарушенных поверхности¹. Выполнение искусственных раны в животных моделях позволяет для репликации этого сложного процесса в физиологических условиях². Однако этот подход часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, которые потенциально не хватает точности для изучения различных процессов, из-за сложного характера процесса заживления раны.

В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает полезной альтернативой животных моделей для изучения роли, которую эти клетки играют в заживлении ран и эффекты лечения на мигрирующих поведение клеток. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются на молекулярных методов с использованием не притока культур^3,4,5,6; Однако нарушение целостности эпителия обычно достигается тонкой механической разрезов. В культуре клеток это означает, что незначительное количество клеток могут быть подвержены разрыва раны, и они представляют собой образец слишком мал для методы молекулярной биологии. Однако эти поражения могут быть изучены в микроскопических масштабе, воспользовавшись врожденной мигрирующих свойств некоторых эпителиальных клеток линий, например норки легких эпителиальных клеток (Mv1Lu) или клеток кератиноцитов спонтанно увековечен человека (HaCaT) линии.

Здесь мы описали метод для микроскопии, которая подходит для получения количественных данных о миграции эпителиальных клеток в контексте заживления^3,4,,78. Кроме того мы представляем дополнительные методы, которые будут полезны для изучения качественно молекулярных и морфологических изменений, происходящих на эпителиальные монослои во время миграции. В целом эти методы предоставляют основу для изучения динамики и морфологических изменений, связанных с поведением эпителиальных клеток и ответ на лечение во время заживления ран.

протокол

1. искусственные рану скретч Assay количественных исследований

1. Подготовка клетки однослойная
   1. Работая в стерильных условиях, семян и расти Mv1Lu или HaCaT эпителиальных клеток в культуре колбы с использованием сыворотки дополнено средней. Обновление среды один раз каждые 24-48 ч. После того, как клетки достигают 80% слияния, отсоедините клеток с использованием соответствующего метода, т.е., trypsinization⁹.
      Примечание: Mv1Lu и HaCaT эпителиальных клеточных линий культивируемых с помощью EMEM и DEMEM питательной среды, соответственно, с 2 мм L-глютамина и инкубировали при 37 ° C с контролируемой атмосферой 5% CO₂. Каждая линия клетки должна тщательно assayed для определения концентрации клеток и сроков, необходимых для достижения полного confluency. Обычно для Mv1Lu или HaCaT клеток, 2-4 х 10⁴ или 4-6 x 10⁴ клетки/Ну, соответственно, являются семенами в колбе культуры² 175 см, и на 80% слияния дает до 35 x 10⁶ Mv1Lu или 1 x 10-⁷ HaCaT клетки.
   2. В любой 12-ну или 24-ну культуры пластины семян в каждой скважине 2 мл клеток. Обновите среднего, один раз каждые 24-48 ч. числа клеток обеспечить достаточно высока, чтобы достичь 100% слияния после 2 или 3 дня.
   3. После того, как клетки достичь слияния, удалите сыворотки дополнено средней и дважды промыть свежей сыворотки бесплатно среднего. Держите клетки в сыворотки свободной среде за 24 ч до царапин.
      Примечание: Mv1Lu или HaCaT клетки не имеют специальные подложки требований; Однако для линий клетки подвержены отсоединение спонтанно в условиях свободной от сыворотки, предварительное покрытие поверхности плиты культуры с помощью поли L-лизин решения следует рассматривать¹⁰.
2. Однослойная царапин
   1. Работая в стерильных условиях, поцарапайте культуры монослоя перетаскиванием твердо узкий конец 20 мкл или 200 мкл стерильные микропипеткой кончиком, в зависимости от желаемой ширины нуля. Держите кончик перпендикулярно поверхности культуры увеличить разрыв однородности.
      1. Поместите пластины для культуры над темной поверхности четко контролировать монослое клеток. При необходимости выполните два перпендикулярных царапины (кросс образный) на каждом хорошо учиться до 4 миграции областей.
   2. Стирать отдельные клетки, аккуратно удалив питательной среды и осторожно добавить свежие среднего сыворотки бесплатно. Повторить два раза, или до тех пор, пока наиболее неприсоединенной клетки были удалены.
3. Экспериментальная процедура и сбор данных
   1. Принимать до 4 Предварительная обработка исходных образов, сосредоточены на скретч разрыв от каждой хорошо с помощью микроскопа Перевернутый фазово контрастной включения ПЗС-камеры. Выберите интерес областях, совместив края поля микроскопа рядом пересечение царапин.
      Примечание: Как правило, изображения приобретаются с использованием 10-кратным увеличением и размер изображения 1280 x 1024 пикселей. Выбор областей интереса как описано выше помогает для легкой локализации и проверки до 4 измерений в колодец.
   2. После того, как все фотографии приобретаются, назначать лечение скважин; Обмен в среду в скважинах с свежей среды, которая содержит выбранный лечения.
      Примечание: в качестве альтернативы, для химических веществ и соединений, которые не нарушают однородность питательной среды, лечение может быть прививанным непосредственно в среде культуры.
   3. Инкубируйте почесал пластины (37 ° C с контролируемой атмосферой, содержащих 5% CO₂) до условиях наблюдения достичь 90% нуля разрыва. Избегайте полного закрытия.
      Примечание: Общее сокращение разрыва аннулирует коллекции изображений после лечения, как ссылка районы не обнаруживаются и не удается установить привязки по времени для закрытия разрыва. В случае Mv1Lu или HaCaT клетки 16-19 h обязаны достичь 90% слияния.
   4. Остановить миграции клеток, фиксируя клетки; аккуратно замените экспериментальных питательной среды с 1 мл 4% формалина в PBS. Инкубируйте 15 мин на RT.
   5. Вымыть клетки, чтобы удалить избыток формалин; аккуратно замените свежим PBS решение в скважинах. Повторите по крайней мере два раза.
      Примечание: На данном этапе, после запечатывания, пластины может храниться при температуре 4 ° C на неопределенный срок.
   6. Принимать после лечения ссылки изображения каждой скважины от первоначальных районов ведения захвачен после царапин. Используете же оборудование (Перевернутый оптических фазово контрастной Микроскоп включения CCD камера) и соответствующие настройки изображения (увеличение и цифровой резолюции/плотность).
      Примечание: Для клеток, которые мигрируют в отдельности и заполнить пробел независимо от формирования согласованного фронта (например, клетки человека рак груди MDA-MB-231), курс изображения может позволить расчет скорости миграции отдельных клеток.
4. Анализ изображений и количественная оценка миграции
   1. С помощью обработки изображений программное обеспечение (например, ImageJ), определить границы нуля разрыв и определяют разрыв поверхности до четырех измерений в предварительной обработки изображений. Записать данные в виде «разрыв предварительной обработки поверхности» (PREGAP). Повторите ту же процедуру для последующей обработки изображений. Запишите данные «разрыв после лечения поверхность» (POSTGAP).
      1. Откройте записанное изображение с помощью ImageJ. В меню «изображение», задайте тип изображения 8 бит. В меню «процесс» перейдите в меню «Фильтры» и применить фильтр «отклонение».
      2. В меню «изображение», введите «настроить» подменю и порога черно-белый (B & W), убедитесь в том, что «Темный фон» не выбран. В меню «процесс» перейдите в подменю «двоичный» и выберите «заполнить дыры».
      3. В меню «Анализ» выберите «установить измерений» и активировать «район». Затем нарисуйте измеримые области после миграции край контура таким образом делимитации разрыв.
      4. В меню «Анализ» выберите «анализировать частицы» и записывать значения «площадь» Рисованные площадь поверхности.
   2. Ввести значения PREGAP и POSTGAP Общая площадь в электронную таблицу для количественного определения абсолютной миграции как разница разрыв поверхности измерений для каждого набора отдельных образцов: PREGAP − POSTGAP [произвольной единицы]. Кроме того, нормализации абсолютной миграции данных каждого состояния для контрольных образцов: (образец / управления) * 100 [%].
      Примечание: Для клеток, которые мигрируют в отдельности и заполнить пробел независимо от формирования согласованного фронта, (например, клетки человека рак груди MDA-MB-231), абсолютной миграции может рассчитываться путем подсчета клеток, вторжение в центральной полосы либо в элемент управления или обработанные образцы.
   3. Участок количественная оценка результатов (см. Рисунок 1). Выполните статистический анализ, при необходимости.

Рассмотрим t критерия Стьюдента при сравнении двух условий или дисперсионный анализ тест на большее количество условий.

2. искусственный миграции фронт Assay для топографических исследований

1. Подготовка клетки однослойная
   1. Работая в стерильных условиях, место одного слоя стерилизовать круглые coverslips в пустой культуры пластины до тех пор, пока пластины поверхность полностью покрыта.
      Примечание: До 12 и 33 coverslips помещается на 5 см и 10 см диаметр тарелки, соответственно.
   2. На табличке культуры аккуратно семян достаточное количество клеток на концентрацию, что позволяет 100% слияния после 2 или 3 дня. Убедитесь, что не coverslip перекрывается соседних coverslips и предотвращения coverslips от плавающих, применяя мягкое давление с стерильных микропипеткой наконечником. Обновите носитель каждые 24-48 ч.
      Примечание: Каждая линия клетки должна тщательно assayed для определения концентрации клеток и сроков, необходимых для достижения полного confluency. Обычно для Mv1Lu или HaCaT клеток, 2-3 х 10⁶ или 2,5-4 х 10⁶ клеток/10 см диаметр пластины, соответственно, являются семенами. Для небольших пластин необходимо сократить число клеток.
   3. После того, как клетки достичь слияния, удалить сыворотки дополнено средней и заменить свежей сыворотки бесплатно среды. Держите клетки в сыворотки свободной среде за 24 часа, прежде чем производится искусственное рану.
      Примечание: Mv1Lu или HaCaT клетки не имеют специальные подложки требований; Однако для линий клетки восприимчивыми по отключению спонтанно в сыворотки свободных условиях, предварительно покрытие поверхности культуры с помощью поли L-лизин решения следует рассматривать¹⁰.
2. Однослойная ранив
   1. С помощью стерильных пинцетов, аккуратно перенести coverslip чистой 10 см пластины, содержащие свежей сыворотки бесплатно среднего. Избегайте повреждения монослоя, удерживая coverslip на периферии с помощью пинцета. Избегайте чрезмерного давления, которое может привести к поломке coverslip.
   2. Создание искусственных раны, перетащив стерилизованные лезвия бритвы в поперечной линии над центром coverslips. Перетащите туда и обратно, 3-4 мм для того, чтобы полностью удалить полосе центральной монослоя. Убедитесь в том, что никакого мусора клеток остается прикрепленным к краям раненых.
      Примечание: на 12-мм диаметром раунд coverslip, делается надрез в середине из coverslip. Убедитесь в том оставить полоска клеток напротив главного фасада, достаточно большой (по крайней мере 2 мм) во избежание наклона coverslip в следующих шагах.
   3. Передача раненых coverslips с ячейками вверх, к чистой 6-ну пластины содержащий по крайней мере 2 мл свежей сыворотки бесплатно среднего. Подходит до 4 раненых coverslips/хорошо.
   4. Осторожно промыть два раза свежих сыворотки свободный средних удалить отдельные клетки.
3. Экспериментальная процедура и выборки
   1. Аккуратно обмен в среду в скважинах с свежей среды, которая содержит выбранный лечения.
      Примечание: в качестве альтернативы, для химических веществ и соединений, которые не нарушают однородность питательной среды, лечение может быть прививанным непосредственно в среде культуры. Продолжайте с осторожностью во избежание любого потенциального отряд ячейки.
   2. Держите пластину внутри клетки инкубатора (37 ° C, 5% CO₂) для желаемого экспериментальной сроков.
   3. Остановить миграции клеток, фиксируя клетки; аккуратно замените экспериментальных питательной среды с 1 мл 4% формалина в PBS. Инкубируйте 15 мин на RT.
      Примечание: На время курса экспериментов, удалить образцы из плиты культуры и исправить их в отдельную тарелку чтобы избежать испарения формалин, сказывается на других, текущих экспериментальных условиях.
   4. Вымыть клетки, чтобы удалить избыток формалин; аккуратно замените свежим PBS решение в скважинах. Повторите по крайней мере два раза.
      Примечание: На данном этапе, после запечатывания, пластины может храниться при температуре 4 ° C на неопределенный срок.
4. Топологический анализ и иммунофлюоресценции (если)
   1. Выполните если окрашивание и изображений на отдельных coverslips как описано в других разделах^3,4,11.
      1. Разрушения на 10 мин, погружая coverslips в 0,3% раствора Triton X-100 в PBS.
      2. Блок для 30 мин, с использованием следующих блокирования решения: 0,3% альбумина Bovine сыворотки; 10% плода бычьим сывороточным; 5% обезжиренное молоко; 0,3% раствор Triton X-100 в PBS.
         Примечание: Блокирование решение без молока можно заранее подготовлены и хранятся при температуре-20 ° C.
      3. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре внутри влажной камере, с основного антитела, разводят в молоко бесплатно блокирования решения. Место coverslips вверх вниз в решении 15 мкл антител для обеспечения надлежащего распределения.
         Примечание: Рабочие разбавления антитела является переменной и будет зависеть от антител в использовании. Например антитела анти c-Jun кролик требует разбавления 1/100.
      4. Вымойте три раза путем погружения coverslips в в 0,1% раствор Triton X-100 в PBS.
      5. Инкубируйте coverslips в вторичное антитело, разбавленных в молоко бесплатно блокирующий буфер для 30 мин.
         Примечание: Рабочие разбавления антитела является переменной и будет зависеть от антител в использовании. К примеру коза анти кролик (488) требует разбавления 1/400 для оптимального разрешения. Другие маркировки реагентов как Фаллоидин и Хехст-33258 могут добавляться в буфер инкубации на данном этапе.
      6. Вымойте три раза путем погружения coverslips в 0,1% раствор Triton X-100 в PBS.
      7. Маунт coverslips вверх вниз в 10 мкл монтажа СМИ капли (например, Vectashield) на микроскопа. Оставьте слайды в темноте при комнатной температуре на ночь для монтажа средних закалки. Впоследствии хранить при 4 ° C в темноте на неопределенный срок.
   2. Получите эпифлуоресцентного либо confocal микроскопии изображений структурных изменений, происходящих на перенос передний край.
      Примечание: Топологических исследования могут выполняться черепица фотографии от миграции фронта внутренняя монослоя. Возможно, программное обеспечение на основе анализа интенсивности флуоресценции местных полуколичественных исследований.

Результаты

Искусственные рану скретч Assay количественных исследований: оценки эпидермального фактора роста (EGF) содействие миграции:

EGF является известный индуктор распространения эпителиальных клеток и миграции, и таким образом положительный кон?...

Обсуждение

После кожи или слизистой нарушения барьер функция восстанавливается действиями многочисленных типов клеток, включая фибробластов или иммунной и эпителиальных клеток. Слитно, эти клетки проходят комплекс процесса с участием апоптоза, распространения, дифференциация и главное, фиброб...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Optional 10 % FBS supplement
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E	Use at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Dilute as appropriate
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Dilute to 1x
24-well culture plates	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-well culture plates	SARSTEDT	83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Used 10 ng/mL
Round cover glass	MENZEL-GLÄSER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743	Martor (through VWR)	MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscope	Motic Spain	Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscope	ZEISS Microimaging, Germany	LSM 510 META
10 cm Culture dish	BD FALCON	353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488	Invitrogen	A11008	Used 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	Used 1:100
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Skim milk	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	Release 1.50i
Zen LSM 510 image processing software	ZEISS Microimaging, Germany	Release 5.0 SP 1.1