Роман в Vitro раны исцеления Assay для оценки миграции клеток

Резюме

Здесь мы представляем протокол для оценки воздействия пептидов на миграции бронхиальной эпителиальных клеток. Этот метод позволяет для быстрого и высокую воспроизводимость получения количественных данных на скорость миграции и раны закрытия клеток.

Аннотация

Цель этой работы заключается в том, чтобы показать новый метод для оценки способности некоторых иммуномодулирующих молекул, например антимикробных пептидов (AMPs), чтобы стимулировать миграцию клеток. Важно отметить, что миграция клеток является событием ограничения скорости во время процесса заживления раны, чтобы восстановить целостность и нормальной функции слоев ткани после травмы. Преимущество этого метода над классической assay, которая основана на вручную сделал нуля в монослое клеток, является использование культуры специальных силиконовых вставок предоставление двух отсеков для создания псевдо-рану поля свободной ячейки с четко определенной ширины (500 мкм ). Кроме того благодаря автоматизированной изображения анализ платформы, можно быстро получить количественные данные о скорости закрытия и ячейки миграции рану. Более точно будет показан эффект двух лягушка кожи усилителей на миграции бронхиальной эпителиальных клеток. Кроме того Предварительная обработка этих клеток с специфичные ингибиторы представит информацию о молекулярных механизмов, лежащих в основе таких событий.

Введение

Основном, известно, что заживление ран в животных является основополагающим процесс для восстановления целостности и нормальной функции слоев ткани после травмы¹. Несмотря на эпителиальные поверхности, подвергшихся воздействию внешней среды (например, кожи, органов дыхания и желудочно-кишечного тракта) образуют защитный барьер от физических и химических оскорбления, формирование раны может легко произойти, особенно после операция или микробной инфекции². В качестве примера колонизации легочной ткани, оппортунистических бактериальных патогенов Pseudomonas aeruginosa, особенно в страдающих кистозный фиброз (CF), приводит к повреждению эпителия дыхательных путей с последующим дыхательной недостаточности^{3, 4}. Заживление ран — это сложный узел ремонт механизм для восстановления нормальной архитектура пораженных тканей⁵. Он характеризуется начальной воспаления, последовал период регенерации эпителизации, ангиогенез и тканей ремоделирования с коллагена и ячейки дифференциация^6,7,8 . Для обеспечения целостности эпителиальных и контролировать распространение микробов, все живые организмы производят молекулы обороны, включая антимикробных пептидов (AMPs)^9,10. Процесс заживления очень трудно имитировать в пробирке из-за недостатка клеток мусора и сложного взаимодействия различных типов клеток. Однако в пробирке способности пептидной ускорить закрытие псевдо-раны, стимулируя миграцию эпителиальных клеток свидетельствует о ее способности исцелять скомпрометированных эпителия. Действительно миграции клеток является событием ограничения скорости в заживлении ран, и изучение факторов, которые могут повлиять на миграцию клеток поможет для целевой терапии для улучшения заживления ран.

Здесь высоко воспроизводимых экспериментальных пробирного предоставляется на основании специальных силиконовых вставок культуры для оценки миграции клеток в пробирке. Он основан на создании разрыв 500 мкм (псевдо-раны) на вырожденная клетки однослойная. Клетки на краю искусственные поля «раненый» начнется переход в ячейку свободно OBLASTь, формирование новых клеток контакты. Культуры вставка представляет собой новый инструмент для быстрого заживления экспериментов. Предоставляются два водохранилища, разделенных стеной 500 мкм, и они могут быть надлежащим образом размещены в 3-см блюдо тарелку или в колодец 12-ну плиты. Заполнение каждого отсека вставки с суспензию клеток позволяет клеткам расти в каждой области, назначенные до слияния, в то время как удаление Вставка породит чистой сотовый бесплатно разрыв примерно 500 мкм (равна ширине разделительной стены). Надлежащего клеток питательной среды, дополнена тест соединения можно добавить в блюдо пластины/хорошо. После разрыва могут быть визуализированы в разные временные интервалы под инвертированным микроскопом, желательно один, оснащены видео камеры для захвата изображений. Наконец измерение изменений в области охватывает ячейки по программе анализа веб-автоматизированных изображения позволит количественная оценка скорости закрытия и ячейки миграции рану. В целом этот метод является шагом вперед в отношении классических assay, где нуля производится вручную промо вырожденная клеток монослои стерильной иглой или пипетки Совет¹¹. Действительно, последняя процедура может разрушить пластиковые дно тарелки пластины/Ну и покрытия, создавая морщины. Кроме того «раненых» область не имеет четко определенной ширины по всей длине разрыв, как это сильно зависит от давления исследователями на кончик иглы. Кроме того выбили клетки могут образовывать сгустки живых и мертвых клеток на краях нуля; Кроме того распространение живых клеток в область «раненый» может помешать скорость миграции клеток, генерации невоспроизводимых результатов¹².

Кроме того благодаря нуля изображения анализ платформы, пользователи могут быстро получить (в течение нескольких минут) количественные данные о миграционных поведение отдельных клеток без необходимости приобретения дополнительного программного обеспечения. Эта платформа способна анализа фазы контраст микроскопии изображений низкого (~ 5 X), средний (~ 10 X) и высокой (~ 20 X) увеличение. После загрузки zip-файл изображений (в *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff формат) для создания файла резюме, который показывает процент клеток охватывает районы и скретч областях, а также скорость ячейки автоматически проводится анализ миграция, на различных временных интервалах.

В этой работе, с помощью AMP-производная лягушка кожи, т.е. Esc(1-21) и его diastereomer Esc(1-21) - 1 c¹³и бронхиальной клеточная линия, выражая функциональные CF трансмембранной проводимости регулятор (МВТР)^14,15, предоставляется пример пептид индуцированной клеток миграции по сравнению с необработанной (управления) образцов. Обратите внимание, что эпителия дыхательных путей и МВТР играть решающую роль в поддержании функции легких и ранение ремонт¹⁶. Кроме того, с помощью селективных ингибиторов (например, AG1478)¹⁷ рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), доказательства того, что миграция бронхиальной клеток, вызванные вышеупомянутыми пептиды включает активацию EGFR^{12, 18} сообщается.

В резюме цель этой процедуры заключается в том, чтобы показать, как использование таких силиконовые вставки культура представляет собой быстрый и легко доступный пробирного для точного определения миграции адэрентных клеток (например, бронхиальной эпителиальных клеток) и молекулярной механизмы контроля таких событий.

протокол

1. Подготовка клетки

1. Семенной 2, 5х10⁶ ячеек в 10 мл из минимальных основных средних (MEM) дополнены глютамин 2 мм (MEMg), плюс 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), антибиотики (0,1 мг/мл пенициллина и стрептомицина) и puromycin (0,5 мкг/мл для отбора и техническое обслуживание ячейки строки) в колбе T75. Инкубируйте настой при 37 ° C и 5% CO₂ на 2 дня. Перед началом эксперимента, проверьте слияния клеток под инвертированным микроскопом.
   Примечание: Ячеек, которые используются для эксперимента, увековечен человека бронхиальной эпителиальных клеток, преобразованы с лентивирусные вектор присвоении сопротивление puromycin. Они стабильно Экспресс функциональная МВТР^14,15.
2. После слияния клеток достигла 90-100%, аспирационная среднего из колбы и отменить его в бутылку отходов под биологической безопасности шкаф класса II. Вымойте клетки с 6 мл фосфата буфер солевой без кальция и магния (CMF-PBS). Мягко рок колбу вручную и отбросить CMF-PBS.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не коснуться монослое клеток с пипеткой.
3. Добавить 10 мл CMF-PBS и инкубировать настой при 37 ° C и 5% CO₂ за 10 мин.
4. Аспирационная CMF-PBS и выбросьте его. Затем добавьте 2 мл трипсина/ЭДТА в колбу.
5. Встряхните флакон, позволяя решение полностью покрыть клетки и инкубировать настой при 37 ° C и 5% CO₂ за 10 мин до тех пор, пока клетки заметно отдельностоящий под микроскопом.
   Примечание: В конце время инкубации, клетки должен появиться округлые и не привязан к пластиковой поверхности. Если клетки не хорошо отдельностоящий, может потребоваться вручную агитации.
6. Добавить 10 мл MEMg плюс 10% FBS инактивирует трипсина и собирать клетки путем промывания в нижней части колбы. Перевести тома в конической 50 мл трубки.
7. Центрифуга трубки для 5 мин на 80 x g.
8. Аспирационная супернатант и вновь приостановить клетки в 6 мл MEMg плюс 10% FBS. Пипетка неоднократно, чтобы разрушить любые сгустки.
9. Взять 10 мкл суспензии клеток с микропипеткой и придать объем под покровным стеклом, ранее положить над Burker или Нойбауэр камеры.
10. Подсчитать ячейки.

2. заполнение в культуре клеток вставляет

1. В каждом хорошо 12-ну плиты передачи культуры Вставка стерильным пинцетом (рис. 1). Использование пинцета нажать по краям вставки, чтобы исправить их на поверхность пластины.
   Примечание: Вставки имеют липкий нижней, что позволяет адгезии.

Рисунок 1 : Схематическое представление силиконовые культуры вставок, правильно введена в скважины плиты 12-а. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Правильно развести суспензию клеток в MEMg плюс 10% FBS. Заполните каждый отсек кассеты с 70 мкл суспензии клеток (о 3.5x10⁴ клетки/палата).
   Примечание: Плотность ячеек, применяемых в каждом отсеке зависит от типа клеток. Рекомендуется использовать плотность клеток, которая приводит к полной слияния в течение 24 ч.
3. Под микроскопом убедитесь, что клетки не утечка из отсеков вставки и инкубировать 12-ну пластина для 24 ч при 37 ° C и 5% CO₂.

3. псевдо-рану исцеления Assay

1. После инкубации Визуализируйте клетки под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться, что были сформированы монослои вырожденная клеток.
2. Вновь приостановите испытания соединений (например, AMPs) в 1 мл MEMg.
   Примечание: Подготовьте свежие разведений AMPs, начиная от Стоковый раствор хранится при температуре-20 ° C.
3. Аккуратно удалите вставок, стерильным пинцетом. Будьте осторожны, чтобы не сломать монослои ячейки. Передача операций вставки на абсорбирующий бумаги.
   Примечание: Для повторного использования же вставок, стерилизуйте их в 70% этанола для по крайней мере 3 h. Рекомендуется чтобы выбросить их потом.
4. Чтобы удалить ячейки non сторонник, добавьте 1 mL MEMg на хорошо с помощью микропипеткой. Закройте пластины и осторожно покачайте его.
   Примечание: Не добавляйте среднего непосредственно поверх ячейки монослои, чтобы избежать их нарушения.
5. Аспирационная среднего и заменить его 1 мл MEMg на хорошо. Закройте пластины и визуализировать клетки бесплатно пробелы (созданная путем вставки) под инвертированным микроскопом при 4-кратном, оснащены видео камеры. Получение изображений во время ноль (T0) и сохранять их в формате .jpg.
6. Удалите носитель из скважин, вымыть их с 1 мл раствора PBS и отменить его.
7. Добавьте тест соединений (в точке 3.2) скважин. Для без лечения контрольных образцов добавьте 1 мл MEMg. Инкубируйте пластины при 37 ° C и 5% CO₂.
8. После 15, 20 и 24 h лечения наблюдать миграции клеток под микроскопом при 4-кратном и приобрести изображений.
   Примечание: Во время этого шага, пытаются захватить изображения в тех же областях, что касается T0. Выбор временных интервалов, в которые записываются изображения зависит от скорости миграции клеток.
9. Для изучения влияния некоторых селективных ингибиторов, т.е. AG1478, о миграции клеток, аспирационная среднего от каждого отсека вставки перед удалением вставок.
   1. Мыть каждый отсек с свежими MEMg и заполнить его с 70 мкл MEMg с AG1478.
   2. После 30 минут инкубации при 37 ° C и 5% CO₂действуйте, как описано от пункта 3.3.
      Примечание: Во время стирки шаг и предварительной обработки клеток монослои с специфичные ингибиторы, будьте осторожны, чтобы не удалить вставки.

4. анализ

1. По окончании эксперимента выберите изображения наиболее репрезентативных выборок различных экспериментальных групп и создать zip-файл, содержащий отдельные изображения в T0, Т15, T20 и T24 h.
   Примечание: Отдельные изображения принимаются на выбранных временных интервалов для всех образцов. Запустите triplicates для каждого эксперимента, который повторяется по крайней мере три раза. В конце, для всех экспериментальных групп, минимум 3 изображения («a», «b», «c», и т.д., вытекающие из каждого независимый эксперимент) на каждом этапе анализируются.
2. Загрузите zip-файл в программное обеспечение анализа изображений, которое автоматически обеспечивает по электронной почте резюме файл электронной таблицы, содержащие экспериментальных данных охватывает ячейки и скретч районах (в процентах) в точках выбранного времени.
   Примечание: Признание переднего края и поверхности во многом основан на метод обнаружения края (направленных на выявление точек, в которых резко меняет яркость изображения).
3. Сохраните данные и собирать их. Нормализовать все данные в отношении среднее значение в момент нулевой. Вычислить среднее значение нормализованных данных всех реплицирует на каждом этапе и относительной стандартная ошибка (SEM). С помощью двухсторонней дисперсионный анализ (ANOVA), выполните статистический анализ с программным обеспечением надлежащих статистических данных. Различия между пептид лечение и управления группами в разные временные интервалы, считаются статистически значительному для p< 0,05.
4. Участок полученные данные в диаграмму как гистограмму, которая показывает процент клеток-окрестности всех образцов группы против выбранного интервала.

Результаты

Этот протокол был использован для определения ранозаживляющее действие Esc(1-21) и Esc(1-21) - 1 c с точки зрения миграции активность клеток, индуцированной на бронхиальную эпителиальных клеток, выражая функциональные МВТР. В этот assay, культуры пластины были помещены в скважин?...

Обсуждение

Клетки миграция является важным процессом во многих физиологических и патологических мероприятиях, включая заживление ран, развития эмбриона и метастазов рака. Основная процедура для изучения клеток миграции в пробирке включает в себя: (i) создание монослое клеток, (ii) производств...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 °C water bath before use
Glutamine	Euroclone	ECB3000D
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin and Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Warm at room temperature before use
DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS with calcium and magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Culture-Insert 2 well	Ibidi	80209
Wimasis Image Analysis	Ibidi	30002
PRISM software	GraphPad	version 6.0