ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

Резюме

Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система обеспечивает перспективным инструментом для генной инженерии и открывает возможность целенаправленной интеграции трансгенов. Мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии для эффективных ДНК интеграции в естественных условиях и целевой терапии гена с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9.

Аннотация

Как перспективный генома редактирования платформы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система имеет большой потенциал для эффективного генетические манипуляции, особенно для целенаправленной интеграции трансгенов. Однако, из-за низкой эффективности гомологичная рекомбинация (HR) и различных indel мутации не гомологичных конца присоединения (NHEJ)-на основе стратегии-деления клеток, в естественных условиях генома редактирования остается большой проблемой. Здесь мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-основанный ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для эффективного в vivo точные целевые интеграции. В этой системе, целенаправленных генома и доноров вектор содержащий гомологии оружия (~ 800 bp) в окружении одной руководство РНК (sgRNA) целевой последовательности расщепляется, ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Эта стратегия на основе HMEJ достигает эффективного трансген интеграции мыши зигот, а также в гепатоциты в естественных условиях. Кроме того, стратегия на основе HMEJ предлагает эффективный подход для коррекции fumarylacetoacetate гидролазы (фа) мутации в гепатоцитах и спасает фа-дефицит индуцированные поражения печени мышей. Вместе взятые, сосредоточив внимание на целенаправленных интеграции, эта стратегия на основе HMEJ обеспечивает перспективным инструментом для различных приложений, включая создание генетически модифицированных животных моделей и целевых генной терапии.

Введение

Точные, целенаправленных генома редактирования часто требуется для производства генетически модифицированных животных моделей и клинической терапии. Много усилий был достигнут в разработке различных стратегий для эффективного целенаправленного генома, редактирования, такие как цинковый палец нуклеиназы (ZFN), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем. Эти стратегии создания целевых двухнитевые разрывы ДНК (DSB) в геноме и воспользоваться преимуществами встроенных систем ремонта ДНК, таких как гомологичная рекомбинация (HR)^1,2, microhomology опосредованной конец присоединения (MMEJ)^{3 , 4 , 5}и не гомологичных конце присоединения (NHEJ)^6,,78 побудить целенаправленной интеграции трансгенов^1,9. HR-стратегия на основе в настоящее время наиболее часто используемые генома редактирования подход, который является очень эффективным в клеточных линий, но не легко доступной для не деления клеток из-за его ограниченного возникновения в конце S/G2 фазе. Таким образом HR-стратегия на основе не применима для в естественных условиях изменения генома. Недавно была разработана стратегия на основе NHEJ для забивные эффективного гена в ткани мыши⁸. Тем не менее метод на основе NHEJ обычно вводит indels на перекрестках, что делает его трудно генерировать точные генома редактирования, особенно при попытке построить в кадр фьюжн генов⁸. На основе MMEJ целенаправленной интеграции способен редактирования точных генома. Однако это лишь незначительно увеличивает эффективность целенаправленной интеграции в предыдущих докладах⁵. Таким образом повышение эффективности точные целевые интеграции в vivo срочно необходима для широкого терапевтического применения³.

В недавно опубликованной работе, мы продемонстрировали гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии, которая показала высокую эффективность целенаправленной интеграции всех сообщений о стратегии как in vitro и in vivo¹⁰. Здесь, мы описать протокол для создания системы HMEJ, а также строительство векторов сингл руководство РНК (sgRNA), ориентация гена интереса и доноров векторы укрывательстве sgRNA целевые сайты и ~ 800 bp гомологии оружия (рис. 1) . В этом протоколе мы также описывают подробные шаги для генерации ДНК забивные мышей и краткие шаги для целенаправленной интеграции в тканях в естественных условиях. Кроме того исследование доказательства в концепция стратегии на основе HMEJ продемонстрировала свою способность исправить Fah мутации и спасти фа^{- / -} печени провал мышей, которые далее показали его терапевтический потенциал.

протокол

Все процедуры, включая животных темы были утверждены Комитетом по этике биомедицинских исследований на Шанхай институтов биологических наук (CAS).

1. дизайн доноров плазмиды

1. Выбор sgRNA
   1. Используйте онлайн-ТРИФОСФАТЫ дизайн инструментов для прогнозирования sgRNAs целевого региона^{11,12,13,14,15}. Для Cdx2 локус, дизайн шести различных sgRNAs (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) вокруг стоп кодон с высшего ранга и Нижняя потенциал вне цели (рис. 1A)¹⁶.
   2. Линеаризации 2 мкг Cas9-ЦМВ-EGFP векторы выражения и sgRNA, BbsI пищеварения (1 мкл BbsI втечение 2 ч при 37 ° C в конечной концентрации 1 U/мкл в объеме 20 мкл). Затем очищайте продукт, комплект очистки гель с гель агарозы 1% в 1 × буфер TAE.
   3. Mix пару sgRNA олигонуклеотидов в 10 мкл 1 × T4 ДНК лигаза буфера до конечной концентрации 50 µM. Инкубируйте oligo решения с помощью градиента температуры 95 ° c до 25 ° C со скоростью изменения температуры на 5 ° C/5 мин (95 ° C за 5 мин затем 90 ° C за 5 мин, 85 ° C за 5 мин и т.д.), который будет отжига oligos.
   4. Смешайте 4 мкл отожженная продукт, 2 мкл линеаризованного вектора с 1 мкл T4 ДНК лигаза в 10 мкл 1 × T4 ДНК лигаза буфера и затем перевязать при 22 ° C для 1-2 ч (рис. 1Б).
2. Сюрвейер нуклеиназы assay sgRNA
   Примечание: Нацеленности эффективности sgRNA, используемый для эксперимента стук в оценивается нуклеиназы пробирного инспектора (также известный как T7 эндонуклеазы I (T7EI) проба)¹⁷. Выберите sgRNA с высокой эффективностью расщепления ДНК и низкой расстояние между sgRNA резки и стоп-кодон.
   1. Transfect Cas9-sgRNA-EGFP векторы выражения в N2a линии клетки культивировали в DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10%, 1% ПСЖ и 1% несущественные аминокислот, transfection комплекта (см. Таблицу материалы). Инкубируйте transfected клеток при 37 ° C в 5% CO₂.
   2. После 48 ч инкубации, собрать 5000 transfected клеток (GFP⁺), активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS) с использованием не transfected клеток как элемент управления.
   3. Дайджест собранные клетки в 2-5 мкл oflysis buffer (0,1% тритон X-100, 0.1% анимации, 20 и 100 µg/mL протеиназы K) 56 ° C за 30 минут, и затем тепловой инактивации протеиназы K на 95 ° C в течение 10 мин.
   4. Усилить пример вложенных ПЦР (Таблица 1), используя протокол изготовителя. Размер продуктов ПЦР равен 300-500 bp.
      1. Смешайте 1 мкл лизис продукта с ДНК-полимеразы и парой праймеров внешних, признавая последовательность вокруг целевого сайта sgRNA (0,1 мкм, конечная концентрация) (Таблица 1) и выполнять основной ПЦР в объеме 20 мкл.
      2. Активация ДНК-полимеразы на 95 ° C за 5 мин и выполнение основного PCR для 30 циклов при 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 24 s (1 мин/1 КБ), с расширением окончательный при 72 ° C за 5 мин.
      3. Выполните вторичных ПЦР, используя 1 мкл первичного продукта PCR и парой праймеров вложенные внутренние.
   5. Денатурировать и повторно отжига 300-600 нг очищенного продукта ПЦР в 20 мкл 1 × T7EI реакции буфера (50 мм NaCl, 10 мм трис-HCl, 10 мм MgCl₂, 1 мм DTT рН 7,9) с использованием градиента температуры от 95 ° C до 25 ° C со скоростью от 5 ° C/5 мин.
   6. 1 мкл T7EI фермента, отожженная продукты PCR и дайджест при 37 ° C на 2 ч. Затем запустите пищеварение продукта на 2% агарозном геле в буфер TAE 1 × 120 V за 40 мин до тех пор, пока фрагменты отделены (см. Таблицу материалы).
   7. ImageJ используйте для определения группы интенсивности необрезанный ДНК и вырезать. Вычислить indel частоты с использованием методов, ранее сообщили⁹ (рис. 1C).
3. Строительство доноров вектора
   Примечание: Для создания HMEJ доноров векторов для Cdx2 гена, построить доноров ДНК (800 bp HAL-p2A-mCherry-800 bp HAR) рядом с 23 nt Cdx2-sgRNAs ориентация последовательность на обоих концах (рис. 1D и 1 рисунокE). Пэм последовательности целевых объектов был рядом с конца гомологичных руку. Гибсон Ассамблее рекомендуется для HMEJ доноров клонирования.
   1. Усилить 800 руку левой гомологии bp (HAL) с вперед грунт 1F (содержащий последовательность совпадения nt 15-20 от вектора, 23 nt Cdx2-sgRNA определение последовательности и около 20 nt последовательности от HAL) и обратить вспять грунт 1R (содержащий последовательность совпадения bp 15-20 от p2A-mCherry и около 20 nt последовательности от HAL) в конечной концентрации 0,1 мкм с помощью мыши геномной ДНК на 200 нг/мкл (рис. 1D, Таблица 1).
   2. Усилить p2A-mCherry вставки фрагмента с вперед грунт 2F (содержащий последовательность совпадения nt 15-20 от HAL и около 20 nt последовательность из вставки фрагмента) и обратить вспять грунт 2R (содержащий последовательность совпадения nt 15-20 от Хар и около 20 nt последовательности от Вставка фрагмента) на 0,1 мкм конечной концентрации с использованием геномной ДНК или плазмиду с последовательностями репортер на 100 нг/мкл и 30 нг/мкл (рис. 1D, Таблица 1).
   3. Усилить 800 руку правой гомологии bp (HAR) с вперед грунт 3Ф (содержащий последовательность совпадения nt 15-20 от вектора, 23 nt Cdx2-sgRNA определение последовательности и около 20 nt последовательность из Хар) и обратить вспять грунт 3R (содержащий последовательность совпадения nt 15-20 от p2A-mCherry и около 20 nt последовательность из Хар) в конечной концентрации 0,1 мкм с помощью мыши геномной ДНК на 200 нг/мкл (рис. 1D, Таблица 1).
   4. Запустите все продукты PCR на геле агарозы 1% в 1 буфер TAE × и очистить продукты PCR ожидаемого размера, Комплект извлечения геля, согласно инструкциям производителя (Таблица 1).
   5. Дайджест 50-100 ng вектора конструкции с KpnI и XbaI. Смешайте 2 мкл линеаризованного вектора на 30-40 нг/мкл с тремя ПЦР усиленный фрагментов (1 мкл для каждого, 100-200 нг/мкл) 2 х Гибсон микс. Добавление H₂O для окончательного громкость до 10 µL.Incubate смесь на 50 ° C 60 мин.
   6. Преобразовать сведущее Escherichia coli клеток со всеми собранный продукт и экстракт плазмида создает набор экстракции ДНК согласно инструкциям производителя. Проверьте HMEJ доноров, секвенирования ДНК.

2. геном редактирования в эмбрионов мыши, с помощью метода на основе HMEJ

1. Производство Cas9 мРНК
   1. Для приготовления Cas9 мРНК добавьте T7 промоутер последовательность Cas9 кодирование региона по амплификации PCR, используя соответствующий грунт пара, перечисленных в таблице 1. В конечной концентрации 0,1 мкм и 20 добавить праймера Cas9 F/R нг Cas9 выражая вектор 1 × высококачественный микс ДНК-полимеразы. Окончательного громкость до 50 мкл с H₂O.
   2. Активация ДНК-полимеразы на 95 ° C за 5 мин и выполнять ПЦР для 36 циклов при 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 68 ° C в течение 4 мин (1 мин/1 КБ), с расширением окончательный на 68 ° C в течение 10 мин.
   3. Очистить продукт PCR T7-Cas9 для в vitro транскрипция (IVT), а затем расшифровать 0,5-1 мкг ДНК по транскрипции Кит мРНК при 37 ° C в течение 8 ч в общем объеме 20 мкл, согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы).
   4. 1 мкл DNase в смесь, чтобы удалить шаблон ДНК при 37 ° C на 15 мин добавить хвост поли A для 45 минут при 37 ° C и восстановить Cas9 мРНК, комплект очистки РНК, согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы).
2. Производство sgRNA
   1. Создайте шаблон sgRNA, движимый T7 промоутер с высокой точностью ДНК полимеразы как выше. Выберите sgRNA леску, содержащий вектор как шаблон. Праймеры используются, перечислены в таблице 1.
   2. Очистить продукт PCR T7-sgRNA и использовать 0,5-1 мкг ДНК как шаблон для в vitro транскрипция sgRNA, используя короткий набор транскрипции РНК при 37 ° C для 6 h в общем объеме 20 мкл, согласно инструкциям производителя (см. таблица материалов < / c11 >).
   3. 1 мкл DNase в смесь и продолжать инкубацию при 37 ° C на 15 минут, чтобы удалить шаблон с ДНК. Очистить sgRNAs, РНК очистки комплект, как указано выше (см. Таблицу материалы).
   4. Разбавить sgRNA до 500 нг/мкл в РНКазы свободной воды и хранения образцов в −80 ° C на срок до 3 месяцев.
      Примечание: ТРИФОСФАТЫ ribonucleoproteins (RNPs) являются альтернативного замещения с лучшей резки эффективность^18,19,20.
3. Культуры коллекции, микроинъекции и в пробирке эмбрион
   1. Superovulate женских B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) мышей (7-8 недель), беременных Маре гонадотропина сыворотки (ГСЖК), следуют хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) 48 ч позже. После инъекции ХГЧ дом самки с B6D2F1 мужчины на ночь.
   2. Пожертвуйте самки CO₂ анестезии, 24 ч после инъекции ХГЧ. Соберите оплодотворенных эмбрионов от их яйцеводов (с 30-50 эмбрионов для каждой девушки) в среде м2.
   3. Место оплодотворенных эмбрионов (около 300 яиц за один день инъекций) в среду КСОМ (5.55 г/Л NaCl, 0,19 г/Л хлористого калия, 0,05 г/Л х₂PO₄, 0,05 г/Л MgSO₄•7H₂O, 0,04 г/Л глюкозы, 1,12 г/Л натрия лактата, 2,1 г/Л NaHCO₃ , пируват натрия 0,02 г/Л, 0,25 г/Л CaCl₂•2H₂O, ЭДТА 0,004 г/Л, 0,146 g/L L-глютамина и 1 г/Л бычьим сывороточным альбумином) при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO₂.
   4. Смесь Cas9 мРНК (100 нг/мкл), sgRNA (50 нг/мкл) и HMEJ доноров вектор (100 нг/мкл) и добавьте H₂O для окончательного громкость до 10 мкл. поставить смесь на льду.
   5. Тянуть капиллярного иглы (наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,78 мм с накаливания) с помощью съемника микропипеткой (параметры: тепло, давление, 300; задержка, 200; скорость, 80; тянуть, 60, 74. Таблица материалов). Коммерческие иглы бы альтернативной заменой микроинъекции.
   6. Придать вероятный объем смеси в цитоплазму зигот с четко определенной pronuclei в капли среднего HEPES-CZB, содержащий 5 мкг/мл cytochalasin B с помощью microinjector с постоянным потоком настройки (рисA) (см. Таблица материалов)²¹.
      Примечание: Каждая группа зигот должны быть введены в течение 20-30 мин Cytochalasin B может повысить жизнеспособность зигота мыши после инъекции. Кроме того микроинъекции может эксплуатироваться с пьезо системы, как описано ранее²².
   7. Культура вводят зигот в среде КСОМ при 37 ° C, под 5% CO₂ до бластоциста этап после 3,5 дней для флуоресценции наблюдения (цифры 2B и 2C).
4. Перенос эмбрионов и поколение мышей
   1. Мат эстрального ICR самок мышей с вазэктомии мышей-самцов ICR в тот же день, как инъекции.
   2. Культура вводят зигот в стадии 2-клеток при 37 ° C под 5 CO₂и передачи 25-30 2-клеток эмбрионов в яйцеводов pseudopregnant МГП самок на 0,5 дня пост coitum (dpc). Получателя матери доставить щенков на 19,5 dpc.
5. Генотипирование мыши
   1. Извлечение мыши геномной ДНК из пальца или хвост образцов, используя набор для экстракции ДНК, согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалы).
   2. Определение 5' и 3' Джанкшен забивные событий с помощью 200-400 нг геномной ДНК, измеряется УФ вид спектрометрии как шаблон для выполнения amplification ПЦР.
      1. Активация ДНК-полимеразы на 95 ° C за 5 мин и выполнять ПЦР для 38 циклов при 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C в течение 1 мин (1 мин/1 КБ), с расширением окончательный при 72 ° C для 10 мин. Для 5' Джанкшен используйте вперед грунт на вверх по течению от HAL, с обратной один на стук в фрагмент (p2A-mCherry). А 3' Джанкшен используйте вперед грунт на стук в фрагмент (p2A-mCherry), с тем обратный по течению Хар (Таблица 1).
   3. Запуск 6 мкл продукта PCR на геле агарозы 1% в 1 × буфер TAE и проверьте размер ожидаемых фрагментов. Затем проверьте их ДНК последовательности (рис.D).

3. HMEJ-основанный в Vivo генома редактирования в гепатоцитах

1. Получателей C57BL/6J мышь (8 недель) в удерживающего устройства и положить хвост через щели.
2. Смешайте HMEJ доноров векторов (30 мкг) и векторы выражения spCas9 (30 мкг) в 2 мл физраствора. Для управления эксперимента приостановите HMEJ доноров векторов (30 мкг) в 2 мл физраствора (рисA).
3. Очистите хвост мыши с 70% этиловом спирте. Вставка иглу в хвост вен и плазмида ДНК раствор в течение 5-7 s. Удалите иглу и отпустите кнопку мыши из удерживающего устройства.
4. Пожертвовать мышей, CO₂ анестезии после 5-9 дней после инъекции. Perfuse transcardially мышей с 0,9% физиологического раствора, после чего параформальдегида 4%, с использованием перистальтического насоса и исправить печени на ночь при 4 ° C.
5. Обезвоживания тканей, с использованием 30% сахарозы на ночь, до тех пор, пока он тонет в нижней части трубки.
6. В разделе замороженные ткани на толщину 10 мкм для печеночных проб.
7. Промыть в разделах три раза в 0,1 М фосфат амортизированное (PB) и инкубировать их с основного антитела: кролик анти mCherry (разводят в 5% NGS) на ночь при 4 ° C.
8. Вымойте секции три раза в PB и затем инкубировать их с вторичные антитела: Cy3-AffiniPure коза анти кролик IgG втечение 2 ч при комнатной температуре на орбитальный шейкер.
9. Изображение в разделах с DAPI 20 мин и горе с глицерином на стеклянных вставках для дальнейшего наблюдения флуоресцирования (рис. 3B).

Результаты

HMEJ-основанные геном редактирования в эмбрионов мыши: Чтобы определить стук в эффективности метода, основанного на HMEJ в мыши зигот, мы поставляли Cas9 мРНК, sgRNA ориентации генов Cdx2 и HMEJ доноров в мыши зигот, который был разработан для предохранителя p2A-mCherry Ре?...

Обсуждение

Наиболее важные шаги в строительстве HMEJ плазмид доноров являются: (1) выбор sgRNA с высокой эффективностью расщепления ДНК и низкой расстояние между sgRNA резки и стоп-кодон и (2) надлежащего строительства HMEJ доноров. ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной расщепление на обоих трансген доноров вектор (...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
pX330	Addgene	42230
pAAV vector	Addgene	37083
pX260	Addgene	42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40	Addgene	97307	AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA	Addgene	97308	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor	Addgene	97319	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technology	L3000015
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9930
Bbs I	New England Biolabs	R0539S
NEB Buffer 2	New England Biolabs	B7002S
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit	Qiagen	12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA	Life Technologies	AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS	Life Technologies	AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS	Life Technologies	AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97	Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass	Sutter Instrument	B100-78-10	type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)
FemtoJet microinjector	Eppendorf
Freezing microtome	Leica	CM1950-Cryostat	thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry	GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson Immunoresearch
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Gibco	10099141
NEAA	Gibco	11140050
Pen,Strep,Glutamine	Gibco	10378016
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02
FACS	BD AriaII
PMSG	Ningbo Sansheng Medicine	S141004
HCG	Ningbo Sansheng Medicine	B141002
Cytochalasin B	Sigma	CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red	Millipore	CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red	Millipore	CAT#MR-015-D
Mineral oil	Sigma