JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем, оптимизированный протокол чип последовательности высокой пропускной способностью и трубопровод Вычислительный анализ для определения генома общесистемной хроматина состояния моделей из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий.

Аннотация

Изменения гистона являются одним из основных компонентов epigenome и играют важную роль регулирования в определении транскрипционный анализ статуса ассоциированных локусов. Кроме того наличие конкретных изменений был использован для определения позиции и личность-кодирования функциональных элементов, таких как усилители. В последние годы иммунопреципитации chromatin, следуют следующего поколения последовательности (чип seq) стал мощным инструментом определения генома общесистемной профилей отдельных гистона модификаций. Однако это становится все более очевидным, комбинаторные шаблоны изменений chromatin, называют Chromatin государствами, определить личность и характер связанных геномной Локус. Таким образом рабочие процессы, состоящие из надежной методологии (HT) высок объём для профилирования количество меток гистона модификации, а также Вычислительный анализ трубопроводов способна обработки мириады чип-Seq профилирование наборов данных, необходимых для всеобъемлющее определение государств epigenomic в большое количество проб. HT-чип-Seq рабочего процесса, представленные здесь состоит из двух модулей: 1) экспериментальный протокол для профилирования нескольких модификаций гистона от небольших количеств образцов опухоли и клеточных линий в 96-луночных формате; и 2) вычислительные данные анализа трубопровода, который объединяет существующие инструменты для вычисления отдельные Марк размещение и комбинаторные хроматина состояние модели. Вместе эти два модуля облегчить легкая Обработка сотни образцов чип-Seq быстрым и эффективным образом. Рабочий процесс, представленные здесь используется для получения структур хроматина государства от 6 гистона Марк профилей в меланома опухоли и клеточных линий. В целом мы представляем всеобъемлющий чип seq рабочий процесс, который может быть применен к десятков образцов человека опухоли и рак клеточных линий для определения epigenomic аберраций в различных злокачественных опухолей.

Введение

Большинство млекопитающих геномов (98-99%) состоит из некодирующих последовательностей, и эти регионы nocoding содержат нормативных элементов, известных участвовать в контроле экспрессии генов и хроматина организации1,2. В нормальной клетке конкретные Ассамблея геномной ДНК в уплотненных хроматина структура имеет решающее значение для пространственной организации, регулирования и точные сроки различных процессов, связанных с ДНК3,4,5. В раковых клеток, однако, chromatin изменения по аномальным эпигенетические механизмы может привести к неправильной Организации структуры хроматина, включая доступ к регуляторных элементов, хромосомные циклической системы и ген выражение модели6, 7,8,9,10.

Несмотря на недавние успехи мы ограничили понимание эпигеномные изменения, которые связаны с опухолевой прогрессии или терапевтического ответа. Epigenome состоит из массива изменений, в том числе меток гистона и метилирование ДНК, которые вместе образуют динамического состояния (упоминаемый как состояние хроматина), которая посягает на выражение генных сетей и других процессов, решающее значение для поддержания Сотовый личность. Недавно изменения в усилители были показаны в множественные злокачественные опухоли, изучая профили H3K27Ac11. Хотя такие исследования дают представление о корреляции изолированных эпигенетических меток, более чем 100 эпигеномные изменения были определены12,13 без четкого понимания их биологических функций и взаимозависимость. Кроме того есть еще большее количество возможных комбинаторной моделей этих гистона и модификации ДНК, и это эти комбинаторной закономерности - не отдельные модификации - диктовать эпигеномные государств14. Таким образом существует огромный необходимость выявления изменений в этих государствах хроматина в прогрессии рака или ответы на терапии. Всесторонние знания о epigenome изменений в раках отставание в части из-за технического (например , поколения крупномасштабных данных из небольшого количества клинического материала/сингл клеток) и аналитический (например алгоритмы для определения комбинаторные государства) проблемы. Таким образом ощущается насущная необходимость для надежные методы высокой пропускной способностью для профилирования большое количество марок изменения гистона из клинического материала и вычислительной подходов в реализации предсказать комбинаторной шаблоны, которые будут способствовать определение эпигеномные государств, связанных с различными этапами tumorigenesis и терапевтической резистентности. Кроме того, данные, поступившие от недавних epigenome профилирования исследования15,16,,1718,19,20,21, 22,23 в нормальных тканей и клеточных линий может быть интегрирована с профилями хроматина опухоли для дальнейшего понимание epigenome вклад биология опухоли.

Хроматин профилирования стала мощным инструментом для выявления глобальных привязки моделей различных chromatin изменения15,-24. В последние годы чип seq стал «золотым стандартом» для изучения ДНК белковых взаимодействий на глобальном масштабе25,,2627. Для любого эксперимента чип seq критические шаги необходимые для его успеха, включая обработку ткани и диссоциации, determing условий оптимального sonication, determing оптимального антитела концентрации для осадков, Библиотека подготовки, После последовательность обработки данных и анализа, ниже по течению. Каждый из этих шагов содержат ключевые качества контрольно-пропускных пунктах и когда вместе взятые, имеют решающее значение для надлежащего выявления потенциальных целей для функциональной проверки. Через инновации в эти шаги несколько предварительного исследования были разработаны методологии для выполнения чип или чип-Seq от небольшого количества ткани28,29,,3031,32 . Кроме того некоторые исследования показали, что протоколы для экспериментов чип высокой пропускной способности, следуют ПЦР на основе количественный33,34. Наконец некоторые публично доступна анализ платформы для чип-Seq данных теперь доступны как Easeq35 и36галактики. Однако хватало интегрированную платформу для выполнения чип-Seq в духе высокой пропускной способности в сочетании с вычислительной трубопровода для выполнения одной марки, а также анализы состояние хроматина.

Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий процесс чип seq для картирования генома общесистемной государств хроматина в опухоль тканей и клеточных линий, с легко следовать руководящим принципам, охватывающий все шаги, необходимые для успешного эксперимента. Приняв метод высок объём ранее описанных Blecher Гонен et al. 37, этот протокол может быть выполнена на десятки образцов параллельно и успешно применяется на линии клеток рака и человеческих опухолей, таких как меланома, толстой кишки, простаты и глиобластомы мультиформной. Мы демонстрируем методологии для шести основных гистона модификаций, которые представляют собой основные компоненты эпигеномный нормативные ландшафт в человека меланомы клеточных линий и образцов опухоли. Эти изменения включают в себя H3K27ac (усилители), H3K4me1 (активных и готова усилители), H3K4me3 (промоутеры), H3K79me2 (транскрибируется регионов), H3K27me3 (polycomb репрессии) и H3K9me3 (гетерохроматиновые репрессии). Эти метки может использоваться отдельно или в сочетании для выявления государств функционально различных хроматина, представляющих репрессивных и активных доменов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все клинические образцы были получены следующие руководящие принципы институциональных Наблюдательный Совет.

1. буфер подготовка

  1. Сделайте 200 мл TE буфера (10 мм трис-HCl, 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) рН 8,0).
  2. Сделайте 200 мл STE буфера (10 мм трис-HCl, 10 мм ЭДТА рН 8,0, 140 мм NaCl).
  3. Сделать 200 мл 2,0 М глицин (37.52 г глицина в 200 мл воды) и тепло его на 65 ° C.
  4. Сделайте 200 мл 5% раствора натрия Дезоксихолат (DOC) (10 g DOC в 200 мл воды).
  5. Сделайте 500 мл чип урожай буфера (12 мм трис-Cl, 0.1 x фосфатный буфер (PBS), 6 мм ЭДТА, 0,5% лаурилсульфат натрия (SDS)).
  6. Сделать 500 мл буфера для разведения чип (140 мм NaCl, 0.1% 10 мм трис-Cl, DOC, 1% тритон-X, 1 мм ЭДТА).
  7. Сделать 500 мл Буфер RIPA мыть (STE, 1% тритон x-100, 0.1% SDS, 0.1% DOC).
  8. Сделайте 500 мл буфера мытья РИПА/500 (Буфер RIPA + 360 мм NaCl).
  9. Сделать 500 мл LiCL мыть буфера (TE, 250 мм LiCl, 0,5% NP-40, 0,5% DOC).
  10. Сделать 500 мл прямого Элюирующий буфер: 10 мм трис-Cl рН 8,0, 5 мм ЭДТА, 300 мм NaCl, 0,5% SDS.
  11. Сделайте 50 мл антитела Binding/блокирование буфера (PBS + 0.1% BSA TWEEN-20 + 0.2% IgG бесплатно).

2. ткани/мобильные линии обработки и Cross-linking

  1. Если ткань флэш замороженных, dethaw его на льду до диссоциации.
  2. Отделить 50 мг ткани (~ 8 мг на антитела изменения гистона) вручную в 2 мл из Hanks сбалансированный соли раствора (HBSS) с помощью стерильные лезвия бритвы. Фарш ткани на 3-4 мм куски приблизительно 5 минут в стерильных тканевой культуры блюдо.
  3. Ткани и HBSS решение перенести в диссоциатором трубу и добавьте еще 8 мл HBSS. Далее, отделить ткани, с помощью диссоциатором до гомогенизированный.
  4. Меланома опухоли, место трубы в диссоциатором и запустите следующие циклы каждый один раз в следующем порядке: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 и m_heart_02.01.
  5. Скрип 21 × 106 клеток в 10 мл среды (~ 3 × 106 процентов изменения гистона и ввода; он может быть снижен до 100 000 ячеек на знак для популяций редких) вырос в стандартной тканевой культуры блюдо и собирать их в 15 мл Конические трубки.
    Примечание: Средства массовой информации используются для представителя меланома клеток линии WM115-DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки и 5% пенициллина/стрептомицина.
  6. Crosslink клетки/ткани с помощью окончательный формальдегида 1% концентрации, добавив 200 мкл 16% формальдегида на 3 мл HBBS для ткани (или 3 мл среды для клеток). Встряхните смесь 10 об/мин, используя миксер для ровно 10 минут при 37 ° C.
    Предупреждение: Формальдегид токсичных и должны рассматриваться в соответствующих зонта.
  7. Добавить 200 мкл 2,0 М глицин 3 мл образца и продолжать пожимая 10 об/мин для еще 5 минут при 37 ° C.
    Примечание: Глицин действует как утоления. Сделайте свежий глицин раствора каждый месяц как pf рН, решение, как правило, с течением времени.
  8. Спиновые образцов 934 x g 5 мин при 4 ° C, с помощью настольная центрифуга. Удалить супернатант, добавить 5 мл холодного льда PBS, Центрифугуйте образцы снова в 934 x g и удалить супернатант.
  9. Вспышки заморозить гранулы и хранить его на-80 ° C для дальнейшей обработки.

3. ткань Lysis, Sonication и подготовка антител

  1. Растворите 1 таблетка ингибитор протеазы на 10 мл чип урожай буфера.
  2. Добавить 300 мкл буфера урожай чип с ингибиторами протеазы на 50 мг ткани и позволяют 30 мин лизиса на льду.
    Примечание: 300 мкл буфера урожай чип с ингибиторами протеазы за 1 X 10-7 линий клеток меланомы WM115.
  3. В то время как лизировать клетки, включите капилляре disruptor и связанные системы охлаждения и дайте температуре возможность добраться до 4 ° C. Sonicator трубы в капилляре disruptor и sonicate меланома тканей для 60 циклов в 30 s на и 30 s off, чтобы получить фрагменты хроматина ~ 200-600 пар оснований (ВР).
    Примечание: Время Sonication могут отличаться между ткани типа и должны быть скорректированы соответствующим образом. Это является важным шагом и должны быть оптимизированы в эксперимент, прежде чем приступать к иммунопреципитации.
  4. Во время sonication мыть 20 мкл белок G магнитные бусы на антитела на сэмпл, три раза с использованием 1000 мкл привязки/блокирование буфера (PBS + 0.1% TWEEN-20 + 0,2% BSA).
  5. Для ~ 8 мг меланомы ткани Инкубируйте 3 мкг каждого гистона антитела в 100 мкл привязки / блокирование буфера втечение 2 ч при температуре 4 ° C с вращения с помощью трубки револьвер. 12 образцов для сингулярных антитела содержат 240 мкл бусы, 36 мкг антител и 1200 мкл привязки/блокировки буфера.
    Примечание: Для 3 × 106 клеток, используйте 5 мкг каждого антитела и 30 мкл белок G магнитные бусы на антитела. Антитела и протеина G бусы следует титруют если используется различное количество ткани. Этот протокол иллюстрирует иммунопреципитации условия описаны шесть изменения гистона (Таблица материалов), однако, концентрации антитела должны быть оптимизированы для других модификаций и транскрипционных факторов.
  6. Определить размер фрагментов, удалить 20 мкл раствора sonciated хроматина и добавить Элюирующий буфер Мастер микс (комнатной температуры), содержащий 44 мкл прямой Элюирующий буфер, 1 мкл РНКазы (20 мг/мл) и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) на сэмпл. Проинкубируйте образцы в PCR тепловой cycler для по крайней мере 2 ч при 50 ° C. Очищение образца с помощью ПЦР очистки комплект инструкций производителей.
  7. Убедитесь, что хроматина достаточно стриженый, определяя размер фрагмента с помощью инструмента electropherogram ДНК высокая чувствительность до перехода к этапу 3.6. Включите инструмент electropherogram.
  8. Загрузка 2 мкл Реагента высокой чувствительности буфера в каждой скважине 8-Ну оптические трубки газа. Загрузка 2 мкл лестница высокая чувствительность в первый хорошо и 2 мкл очищенный образцов в оставшихся скважинах.
  9. Место оптическая труба шапки на трубки НТИП и вихревой образцы на 2000 об/мин на 1 мин открыть крышку и вставьте новые ленты высокой чувствительности экрана и окно загрузки советы. Снимите крышки газа и загрузить образцы в инструмент electropherogram.
  10. Откройте программное обеспечение для анализа, выделите первые тринадцать запрещено на ленте экрана и нажмите на вкладку Пуск в нижнем правом углу. Фрагменты хроматина, колебаясь между ~ 200-1000 bp подходят для чипа.
  11. Передача sonicated решение в стерильные пробирки и спин трубы на 21,130 x g с помощью центрифуги столешницы для 15 мин при 4 ° C. Супернатант передавать новые трубы.
  12. Определите суммарный объем супернатант и удалить 10% общего решения для управления вводом и хранить при 4 ° C.

4. chromatin иммунопреципитации

  1. Растворите 2 таблетки ингибитор протеазы в 20 мл буфера для разведения чип.
  2. После sonication разбавленной оставшиеся выборки 5 раз, используя чип буфером для разбавления проб довести SDS уровнях вплоть до 0,1%. Разбавьте 270 мкл оставшихся супернатант с 1080 мкл буфера для разведения чип для получения окончательного суммарный объем 1350 мкл.
  3. Когда заканчивается инкубации антитела и протеина G магнитные бусы, поместите трубку на магнит и удалить супернатант.
  4. С трубки, по-прежнему сидел на магните мыть бисер один раз путем добавления 750 мкл буфера для разведения чип с ингибиторов протеазы.
    Примечание: Важно, чтобы не нарушить бусы или поворот трубы во время этого шага.
  5. Фишки буфером для разбавления проб мыть и Ресуспензируйте бисер в 240 мкл буфера для разведения же чип. Аликвота 20 мкл бисера в 12 отдельных труб, каждая из которых используется для выборки отдельных тканей.
  6. Алиготе sonicated материал равномерно белок G бусы с специфическим антителом и сушилка с помощью трубки револьвер на ночь при 4 ° C.

5. мытье и обратного сшивания Immunoprecipitated ДНК белковых комплексов

  1. На следующее утро после обратного сшивания, передачи антител белка решение 96-луночных тарелку и поместите его на магнитную подставку. Разрешить бусины присоединиться для по крайней мере 30 s и удалить супернатант.
  2. Вымойте бусины 5 раз с 150 мкл ледяной Буфер RIPA мыть с помощью многоканальные пипетки. Во время стирки шаги, сделать не накапайте бисер, но перемещать магнит непрерывно справа налево для 30 s за мыть.
  3. Стирайте образцы дважды с 150 мкл ледяной буфера мытья RIPA-500.
  4. Стирайте образцы дважды с 150 мкл ледяной LiCl мыть буфера.
  5. Вымойте образцы с 150 мкл ледяной TE мыть буфера и немедленно удалить буфер TE. Этот шаг может быть опущен для низкого входного приложений.
  6. Добавьте управления вводом от шага 3.7 в свежих добра 96-луночных пластины, содержащие образцы ДНК чип.
  7. После стирки шаги добавить Элюирующий буфер мастер смесь (комнатной температуры) содержащий 44 мкл прямого Элюирующий буфер, 1 мкл РНКазы (20 мг/мл) и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) за образец чипа и ввода для обратного сшивания.
  8. Проинкубируйте образцы с помощью ПЦР тепловой cycler для 4 ч при 37 ° C, 4 h при 50 ° C и h 8-16 на 65 ° C.

6. Очистка и количественная оценка осажденный ДНК

  1. На следующее утро, место образцы обратно на магнит и передачу супернатанта новой 96-луночных ПЦР-планшете, который содержит immunoprecipitated ДНК.
  2. Добавьте 2.3 x парамагнитных бусины решение (115 мкл для 50 мкл раствора) и тщательно накапайте вверх и вниз 25 раз с использованием многоканальные пипетки. Решение станет однородной, если правильно смешать.
  3. Инкубируйте решение при комнатной температуре от магнита на 4 мин место образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин удалить супернатант.
  4. Оставляя образцы на магните, 150 мкл 70% этанола (vol/vol) и инкубации при комнатной температуре за 30 s не нарушая бисер.
  5. Удаление этанола и повторите мыть. Разрешить парамагнитных бусины воздуха сухой на магните для 5 мин.
    Примечание: Удалите все этанола после второй мыть как остальные этанола будет вмешиваться с очисткой.
  6. Удаление образцов из магнита и 30 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Смешать, закупорить 25 раз и Проинкубируйте образцы при комнатной температуре от магнита на 4 мин.
  7. Поместите образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин передачи 20 мкл каждого образца для новой 96-луночных пластины для приготовления библиотеки. Сохраните оставшиеся 10 мкл чип ДНК в случае любых возможных проблем с поколением библиотек.
  8. На данном этапе количественно чип ДНК до подготовки библиотеки. Концентрации ДНК измеряется с высок чувствительности ДНК реагенты. Определите размер распределение осажденный ДНК с помощью высокочувствительного ДНК electropherogram инструмент перейти к шагу 7.1.

7. Библиотека поколение с помощью комплекта библиотека подготовки ДНК Ultra II NEBNext

  1. Создайте библиотеки для секвенирования NGS, с помощью подготовки библиотеки ДНК после рекомендуемый протокол от производителя. Все реакции выполняются в 96-луночных пластины и инкубаций выполняются в PCR тепловая велосипедист с крышкой температуры > 100 ° C и объем на 50 мкл.
  2. Для индексов используются мультиплекс Oligos NGS платформы. Выполнение в общей сложности 10 x циклов для амплификации PCR, используя следующие параметры: первоначальный Денатурация при 98 ° C за 30 s, денатурации на 98 ° C 10 s, отжиг/расширение при 65 ° C для 30 s (10 x циклов), окончательное расширение 65 ° C за 5 мин и удерживайте при 4° C.
    Примечание: Таблица 1 содержит Праймеры для амплификации PCR.
  3. После амплификации PCR удалить образцы и довести объем до 100 мкл, с использованием воды, свободной от нуклеиназы. Выполнить выбор двухсторонний парамагнитных размера (0.55x/0.8x), Первый Добавление 55 мкл бисера и смешивать, закупорить 25 раз. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре от магнита на 4 мин.
  4. Поместите образцы обратно на магнит и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин. Этот шаг используется для сохранения больших фрагментов на бусы, которые подходят для виртуализации.
  5. Передать новой пластинкой ПЦР 96-луночных супернатант. Не выбрасывайте супернатанта как это содержит частично очищенная ДНК.
  6. Еще 25 мкл парамагнитных бусины и смешивать, закупорить 25 раз и инкубации при комнатной температуре от магнита на 4 мин.
  7. Поместите образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин и удалить супернатант. Этот шаг используется для сохранения фрагменты ~ 200 до 600 ВР, который будет использоваться для завершения библиотек.
  8. Оставляя образцы на магните, 150 мкл этанол 70% (v/v) и позволяют инкубировать 30 s не нарушая бусины (не двигаться на магните). Удаление этанола и повторите мыть во второй раз.
  9. Разрешить парамагнитных бусины воздух сухой на магните для 5 минут удалить все этанола после второй мыть, как остальные этанола будет вмешиваться с очисткой.
  10. Удаление образцов из магнита и 25 мкл 10 мм трис-Cl рН 8.0. Смешать, закупорить 25 раз и инкубации при комнатной температуре от магнита на 4 мин место образцы обратно на магните и инкубации при комнатной температуре еще 4 мин.
  11. Количественно библиотек с помощью инструмента electropherogram ДНК высокая чувствительность до мультиплексирования чтобы убедиться, что размеры подходят для виртуализации. Завершенные библиотеки в диапазоне между 200-600 ВР и лишены всех Димеры праймера.
    Примечание: В случае необходимости, другой 0,7 x парамагнитных шарик очистки производится для удаления нежелательных грунтовка димеры, которые присутствуют в ~ 130 bp.
  12. Бассейн количественных ДНК, на основе уникального индекса грунты по концентрации. Для пула, содержащие шесть образцов с концентрацией 1 нг/мкл и 6ng/мкл распределение является 15 мкл низкие образца и 2,5 мкл высшей пробы. Это делается для обеспечения чтения, которые счетчики будут равномерно распределены на каждый Лейн потока ячейки.

8. Последующая обработка данных чип seq

  1. Трубопровод, основанные на snakemake,3839 используется для процесса все следующие шаги в одной команде. Важно отметить, что каждый из этих шагов обсуждаются индивидуально с связанные команды.
  2. Определить качество сырья fastq последовательности чтения с помощью FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/): Откройте терминал unix и измените каталог (cd) на папку, содержащую файлы raw fastq для каждого из шести модификаций гистонов. Тип терминала unix, fastqc *fastq.gz и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ]. Это будет работать метрики контроля качества на всех fastq файлов в папке.
  3. Совместите качества читает генома ссылку и удалить дубликаты перед сжатием файлов bam. Это выполняется с помощью Боути версия 1.1.239, SAMBLASTER версии 0.1.2140и SAMTOOLS версия 1.3.141: В unix типа терминала, bowtie -m 1 - n 1--Лучший--слоев -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | SAMtools Просмотр -Sb - > histone1.bam и нажмите кнопку [Возврат].
    Примечание: path_to указывает папку, содержащую Ассамблеи генома человека hg19. Это будет меняться в зависимости от организма интерес.
  4. Сортировка файлов bam, SAMTOOLS с помощью следующей команды: В тип терминала unix, samtools вроде histone1.bam -m 2G-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted и нажмите клавишу [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
  5. Индекс файлов bam, SAMTOOLS с помощью следующей команды: тип терминала unix, samtools индекса histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai и нажмите [Enter].
  6. Определить однозначно сопоставленных и невыровненных читает, SAMTOOLS flagstat с помощью следующей команды: тип терминала unix, samtools flagstat histone1.sorted.bam и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
  7. Нормализовать bam файлов каждого чтения графов, выполняя случайной выборки с помощью следующей команды: В тип терминала unix, Самбамба Просмотр bam -f-подвыборка-семя = 3 -s 0.X histone1.sorted.bam | SAMtools сортировка -m 2G-@ 5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam и нажмите клавишу [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
  8. Индексировать файлы bam, снова SAMTOOLS с помощью следующей команды: тип терминала unix, samtools индекс histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai и нажмите [Enter].
  9. Чтобы визуализировать чип seq библиотек на генома браузер (т.е. UCSC или IGV), создавать файлы воротила помощью масштабирования bam файлы читает за kilobase за deepTools версия 2.4.040 млн (RPKM). Это можно выполнить, используя следующие команды:
    1. Для стандартных воротила файлов: В тип терминала unix, bamCoverage -b histone1. Downsample.Sorted.BAM--normalizeUsingRPKM--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw и нажмите клавишу {RETURN].
    2. Для ввода вычитается воротила файлов: В тип терминала unix, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam--bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--коэффициент вычесть--binSize 30--smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW и нажмите клавишу [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
  10. Определение чип seq сигнал обогащения на фоне «Input», используя модель на основе анализа чип seq (ПДК) версии 1.4.225,26 и версии 2.1.0. Используйте macs1 для «точечный источник» факторов H3K4me3, H3K4me1 и H3K27ac и macs2 для «широкой источник» факторов, H3K79me2, H3K27me3 и H3K9me3. Это выполняется с помощью следующих команд:
    1. Для точечного источника: В тип терминала unix, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--держать dup все - n histone1.file и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
    2. Для широкого источника: В тип терминала unix, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM 1e - p-6--широкий--широкой среза 1e-6--держать dup все--nomodel - n histone1.file и нажмите [ВОЗВРАЩАТЬСЯ].
  11. Использование ChromHMM24 для определения моделей комбинаторной хроматина государства на основе изменения гистона, учился, используя следующие команды:
    1. В терминале unix типа cd/path_to/ChromHMM_folder и нажмите [Enter].
    2. Однажды в ChromHMM тип каталога java-mx2G-jar ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output и нажмите [Enter].
    3. Тип, java-mx2G-jar ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/каталог с выходными данными 15 hg19 и нажмите [Enter].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Этот протокол позволяет иммунопреципитации из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий, которые могут быть выполнены на десятки образцов параллельно с использованием метода высок объём (рис. 1A). Хроматина фрагменты должны варьироват...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий высок объём чип seq модуль для картирования генома общесистемной государств хроматина в человека опухоли тканей и клеточных линий. В любом протоколе чип seq одним из наиболее важных шагов является специфичность антитела. Здесь этот метод ил...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, никаких конфликтов.

Благодарности

Мы благодарим Маркуса Койл, Кертис Гамбс, ядро SMF в MDACC для поддержки виртуализации. Работа, описанная в этой статье была поддержана грантов от гранта NIH (CA016672) для SMF ядро и NCI награды (1K99CA160578 и R00CA160578) к. р.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Ссылки

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178(2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033(2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086(2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134Seqchromatin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены