JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем методологии клоновых анализа прекурсоров гемопоэтических стволовых клеток во время мышиных эмбрионального развития. Мы объединяем индекс сортировки клеток одного из эмбриональных аорто Гонада мезонефрос региона с совместного культуры эндотелиальных клеток и трансплантации характеризовать фенотипических свойств и приживления потенциал одного кроветворных прекурсоров.

Аннотация

Возможность изучить генезис гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во время эмбрионального развития было ограничено отсутствием анализов, которые функционально определить долгосрочный потенциал мультилинейного приживления и редкость HSC прекурсоров в раннего эмбриона Индивидуальные предполагаемого HSC прекурсоров. Здесь мы описываем методологии, которая позволяет изоляции и характеристика функционально проверенных HSC прекурсоров на уровне отдельной ячейки. Во-первых мы используем индекс сортировки в каталог точные фенотипического параметра каждой индивидуально отсортированных ячейки, используя комбинацию фенотипические маркеры для обогащения HSC прекурсоров с дополнительные маркеры для экспериментального анализа. Во-вторых каждый индекс сортировка клеток совместно культивируемых с сосудистой нишу стромы аорто Гонада мезонефрос (AGM) региона, который поддерживает созревания-отлаживание HSC прекурсоров для функциональных HSC с мультилинейного, долгосрочные приживления потенциал в Трансплантация анализов. Эта методология позволяет корреляции фенотипических свойств клоновых кроветворения прекурсоров с потенциалом их функциональной приживления или другие свойства, такие как транскрипционный анализ профиля, предоставляя средства для детального анализа прекурсоров HSC Разработка на уровне отдельной ячейки.

Введение

Клоновых исследования показали гетерогенность в свойствах долгосрочный приживления взрослых СКК, обеспечивая новое понимание HSC подтипы и изменения в поведении HSC во время старения1. Однако подобные исследования эмбриональных СКК и их прекурсоров были более сложным. Во время раннего эмбрионального развития, СКК возникают от населения прекурсоров, известный как эндотелий кроветворения в рамках переходного процесса, упоминаемые как эндотелиальные гемопоэтических перехода2. Первый HSC, определяется их способности предоставлять надежную и долговременную мультилинейного приживления, после трансплантации в кондиционированном взрослых получателей, не обнаруживаются до тех пор пока после эмбриональных дня 10.5 (E10.5) в мышиных эмбрионов, в очень низкой частоты3 . Во время их разработки прекурсоры HSC (pre-HSC) вытекающие из эндотелия кроветворения, должны пройти созревания до получения свойства взрослых HSC, которые позволяют эффективно приживления в трансплантации анализов4,5 , 6. заслоняя исследования редких HSC происхождения, множество гемопоэтических прародителями с эритроидные, миелоидной и лимфоидных потенциал уже обнаружено до появления HSC от pre-HSC7,8. Таким образом отличающие pre-HSC от других гемопоэтических прародителями требует методов клонально изолировать клетки и передавать их с сигналами, достаточные для их созревания HSC, чтобы обнаружить их приживления свойства в трансплантации анализов.

Были описаны ряд подходов, которые позволяют для обнаружения pre-HSC, либо ex vivo или в естественных условиях созревания по HSC. Ex vivo методы зависели от культуры эмбриональных тканей, таких как AGM региона, где первый HSC обнаруживаются в развитие9. Опираясь на эти методы, протоколы, которые включают диссоциации, сортировка и повторное агрегирование AGM тканей позволили характеристика отсортированных населения, содержащие HSC прекурсоров во время разработки от E9.5 до E11.5 в пункт аорты splanchnopleura (P-Sp) / AGM регионов4,5,10; Однако эти подходы не поддаются высок объём анализа прекурсоров, необходимых для Клональный анализ на уровне отдельной ячейки. Аналогичным образом, в естественных условиях созревание трансплантации в новорожденных мышей, где микроокружения считается более подходящим для поддержки более ранних этапов HSC прекурсоров, позволил также исследования отсортированных населения из желточного мешка и AGM / P-Sp (P-Sp является предшественником региона AGM) с характеристиками pre-HSC, но эти методы также не сумеют обеспечить надежную платформу для одной ячейки анализ11,12.

Исследования из Rafii et al. продемонстрировал, что стромы Akt активированный эндотелиальных клеток (EC) может обеспечить нишу субстрат для поддержки взрослых следственный HSC самообновления в vitro13,14,15. Мы недавно установлено, акт активированный EC, производные от региона AGM (AGM-EC) обеспечивает подходит в vitro нишу для созревания кроветворения прекурсоров, как E9 в развитии, для взрослых отлаживание HSC, а также последующие изолированные самообновлению сгенерированный HSC16. Учитывая, что эта система использует простой 2-мерной Сопредседатель культуры, он легко адаптируется для Клональный анализ потенциала HSC индивидуально изолированных кроветворения прекурсоров.

Недавно мы сообщили подход к assay HSC потенциал клоновых кроветворения прекурсоров путем объединения индекс сортировки отдельных кроветворения прекурсоров из мышиных эмбрионов с AGM-EC Сопредседатель культуры и последующих функционального анализа в трансплантации assays17. Индекс сортировки является режим активирован флуоресценции клеток сортируя (FACS), записей (индексы) все фенотипические параметры (то есть, вперед точечной (FSC-A), стороны точечной (SSC-A), флуоресценции параметры) каждого индивидуально сортировки клеток что эти функции можно ретроспективно коррелирует с последующим функционального анализа после сортировки. СУИМ программное обеспечение записи оба фенотипические информацию для каждой ячейки и положение/колодец 96-луночных пластины, в которую он был помещен. Этот метод ранее элегантно используется для выявления неоднородности в взрослых HSC, определить фенотипические параметры дальнейшего обогащения для долгосрочного голокоренные подмножества HSC, которые коррелируют с транскрипционный анализ фенотипических параметры HSC свойства в одной ячейке уровня18,19. Здесь мы предоставляем подробные методологии этого подхода, который позволяет идентификации уникальных параметров фенотипических и происхождение взносов pre-HSC ранних этапах эмбрионального развития.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из онкологического исследовательского центра Фреда Хатчинсона.

1. Подготовка монослои AGM-EC для совместного культуры

  1. за 24 часа до AGM диссекции и сортировка, сделать AGM-EC культуры средств массовой информации и фильтрации стерилизации.
  2. Добавить 0,1% желатина в воде (100 мкл/а) в каждой скважине 96-луночных плиты и инкубации при комнатной температуре 15 мин аспирата желатин и оставить пластину в культуре ткани капюшоном с крышкой, пока скважин сухим.
  3. Отделить монослои AGM-EC и пластины для 96-луночных пластины.
    Примечание: Поддерживать AGM-EC, подготовленный ранее описанных16, в AGM-EC культуры средств массовой информации. Для обеспечения согласованности AGM-EC клеточных линий следует заморожены как только достаточное количество получаются (обычно 1-3 прохода) и используемый для совместного культуры экспериментов на ряд определенных проход (как правило, проезд 5-12). AGM-EC клеточных линий являются производными от C57BL/6J (CD45.2) AGM. Смотрите Таблицу материалов для всех СМИ композиций.
    1. Аспирационная СМИ от культуры AGM-EC в колбе2 75 см и добавьте 5 мл PBS. Аспирационная PBS и добавить 3 мл раствора трипсина (см. Таблицу материалы).
    2. Инкубируйте при 37 ° C для 2-4 мин, до тех пор, пока большинство клеток отрывая пластину. Добавление 7 мл AGM-EC культуры средств массовой информации и пипетки 8 - 10 раз с 10 мл пипетки подготовить отдельные клетки подвеска, и передачи в 15 мл.
    3. Спина на 300 g x 5 минут, удалить супернатант, вновь приостановить в культуре средств массовой информации 10 мл AGM-EC и оценить номер ячейки с Горяева. Разбавьте клетки к концентрации 1 х 105 клеток/мл в AGM-EC культуры средств массовой информации.
  4. Добавьте 100 мкл AGM-EC суспензию клеток (1 х 104 клетки) в каждой скважине gelatinized 96-луночных плиты. Место в 37 ° C, 5% CO2 культуры ткани инкубатора в одночасье разрешить AGM-EC для присоединения и формируют вырожденная монослоя.
    Примечание: Равномерно распределять AGM-EC стромальные клетки так что ограниченное разрастание или слипания для оптимального сотрудничества культуры клеток.
  5. Подготовьте монослоя AGM-EC для акционеров совместного культуры.
    1. Следующим утром, подготовьте AGM сыворотки свободных средств массовой информации.
    2. С помощью 12-ну многоканальные пипетки, удалить носитель культуры AGM-EC из AGM-EC и добавить 200 мкл/хорошо AGM сыворотки свободных средств массовой информации без цитокинов промыть любых остаточных сыворотки содержащих средств массовой информации.
    3. Удалите средства массовой информации и добавить 200 мкл/хорошо AGM сыворотки свободных средств массовой информации с цитокинами. Работать быстро, когда удаление и Добавление средств массовой информации, таким образом, чтобы не нарушалась эндотелиального слоя; например, удалить и повторно добавить СМИ по одной строке за один раз. Поместите пластины для 96-луночных в инкубатор культуры ткани при 37 ° C, пока не эмбриональных клеток готовы для сортировки.

2. подготовка одной ячейки подвеска из мышиных эмбриональных тканей

  1. Вскрыть AGM от приурочен вязки.
    1. Настройка времени вязки для генерации эмбриональных тканей нужного возраста.
    2. Урожай эмбрионов от беременных женщин на 9,5-11,5 дней поста coitum (dpc), в зависимости от стадии пре HSC для анализа.
      Примечание: Эмбриональных тканей собирают от мышей C57BL/6J (CD45.2) как описано и точно поэтапной основе Сомит фото16. Мы ориентированы на анализ популяций из эмбриональных AGM региона и его предшественник, P-Sp, между E9.5 в E11.5, основанный на Сомит промежуточной.
    3. Вскрыть AGM от эмбрионов20.
      Примечание: Подробные протоколы для рассечения AGM из мышиных эмбрионов были опубликованы другие20. Кроме того желточного мешка или других тканей, якобы pre-HSC активность также может быть проанализированы этим методом.
  2. Отделить расчлененных эмбриональных тканей.
    1. Собирать расчлененных тканей в 15 мл конические пробки, содержащие 10 мл PBS с 10% FBS на льду. Гравитация урегулировать тканей, аспирационная PBS/FBS, а затем сразу же добавить 1 мл 0,25% коллагеназы и место в ванну воды 37 ° C 25 мин.
    2. Добавьте 1 mL PBS/10% FBS и пипетки около 20 - 30 раз с кончиком пипетки 1 мл для получения одной ячейки подвеска. Добавьте еще 8 мл PBS/10% FBS и центрифуги клетки на 300 g x 5 мин отбросить супернатант.

3. антитело пятная мышиных эмбриональных клеток

  1. Подготовьте блокирующий буфер для пятнать антитела.
    1. Добавить 10 мкг/мл анти мыши CD16/CD32 (Fc рецептор (FcR) блок) и 1 мкг/мл DAPI (1 мг/мл бульона в H2O) 1 мл PBS с 10% FBS.
    2. Составить в шприц 3 мл и пройти через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации. Вновь приостановить клетки гранулы из диссоциированных мышиных эмбриональных тканей (из шага 2.2.2) в 500 мкл блокирование буфера и инкубировать на льду на 5 мин.
  2. Подготовьте смесь антител17.
    1. Добавить 10 блок FcR мкг/мл 1 мл PBS с 10% FBS и 10 мкл каждого флюрохром конъюгированных антител анти VE-Кадгерины (CD144, смотрите Таблицу материалы) и антитело проспряганное флюрохром анти EPCR (CD201, см. Таблицу материалов). Использование масштаба 1: 100 окончательного растворения антител, если не указано иное по рекомендациям изготовителя или согласно титрования.
      Примечание: Эта комбинация антитела используется для определения ворота для сортировки, как описано ниже (шаг 4.2). Сортировка на основе совместного выражения VE-Кадгерины и EPCR позволяет значительного обогащения для части AGM-производные ячейки, содержащие HSC прекурсоров деятельность, как описано выше17.
    2. Добавьте дополнительные флюрохром конъюгированных антител для дальнейшего фенотипического анализа отдельных прекурсоров, индекс сортировка.
      Примечание: Эти антитела являются не обязательно используется для определения ворота для сортировки. В этом примере протокол мы включили антитело проспряганное PE анти CD41 и конъюгированных FITC анти CD45 антитела для анализа относительного выражение этих гемопоэтических маркеров, которые развиваются во время появления pre-HSC от кроветворения эндотелия4 ,5,16,17. Другие маркеры интерес может быть включен в качестве желаемого. Образцы, окрашенных с флюрохром конъюгированных isotype антитела элементы управления используются для определения отрицательных и положительных ворота для анализа.
    3. Составить смесь антител в шприц 3 мл и пройти через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации. Добавьте 500 мкл антител смесь суспензии клеток в блокирующем буфере, пипетки для микширования и инкубировать на льду, по крайней мере 15-20 мин.
  3. Мойте окрашенных клеток.
    1. Добавь FBS PBS/10% 8 мл. Центрифуга клетки на 300 x g за 5 мин, аспирата и вновь приостановить ячейки окатышей с 1 мл PBS/10% FBS.
    2. Удалите скопления клеток, закупорить суспензию клеток через 35 мкм клеток сетчатый фильтр крышки на 5 мл. Промойте ситечко ячейки с дополнительной 3 мл PBS/10% FBS. Центрифуга клетки на 300 g x 5 мин, аспирационная, вновь приостановить в 500 мкл PBS/10% FBS и место на льду до СУИМ.

4. индекс сортировки одного кроветворения прекурсоров до 96-скважин с AGM-EC стромы для совместного культуры

  1. Подготовить СУИМ машина для режима пластины и выравнивание для сортировки к 96-луночных плит согласно инструкциям производителя. Выберите одну ячейку режим и индекс сортировки режим в программном обеспечении для максимальной чистоты маска параметров и возможность приобретения параметров индекса для каждого отсортированного ячейки.
  2. Получить образец клеток с антителом, витражи образцы установить ворота для сортировки.
    1. Загрузить образец окрашенных клеток на машине СУИМ и приобрести клетки на низкой скорости потока. Участок FSC-A стихи SSC-A и выберите ворот, который включает клеток разного размера (рис. 1B) (которая основывается на том наблюдении, что pre-HSC деятельности определена в клетках различных размеров профилей в AGM17). FSC-A стихи FSC-W и SSC-A стихи SSC-W и выберите ворота исключить Дуплеты. Тогда участок FSC-A стихи DAPI ворот живых клеток (отрицательный для DAPI) (рис. 1B).
    2. Участок PECy7 (или соответствующие флюрохром для VE-Кадгерины пятно) против PerCP (или соответствующие флюрохром для EPCR пятно). Ворота клетки, которые являются позитивными для VE-Кадгерины (которая включает смешанного населения эндотелиальных клеток кроветворных прародителями и pre-HSC от AGM) и которые имеют высокие EPCR выражение (которое обогащает для pre-HSC P-Sp/AGM17). Это заключительный ворота, которые будут использоваться для индексации сортировка одной клетки на шаге 4.3 (рис. 1B).
    3. Участок дополнительные флуорохромов, используемые для окрашивания.
      Примечание: В зависимости от субпопуляция анализируемым, дополнительные ворота может устанавливаться основан на обнаружении других маркеров для окрашивания клеток. Однако индекс сортировки позволяет запись люминесцентных параметров для каждого отсортированного ячейки таким образом, что эти параметры могут быть проанализированы ретроспективно. Таким образом без дополнительных стробирования необходимые на данный момент. Для всех установок СУИМ образцы, окрашенных с одного антитела должны использоваться для регулировки компенсации, с учетом распространения выбросов перекрывающихся флуорохромов и с изотипа управления антител, для учета окрашивания фона и определить негативных/позитивных ворота.
  3. Индекс сортировки клеток AGM.
    1. Место 96-луночных пластины приготовленные AGM-EC стромы в AGM сыворотки свободных СМИ с цитокинами (от шага 1.5.3) в блоке пластины сортировочная машина СУИМ. Загрузить образец и начать приобретение образца. Выберите режим сортировки/одной ячейки индекса и начать sortingsingle клетки для отдельных скважин-96. Используйте низкие скорости потока для сведения к минимуму касательное напряжение на эмбриональных клеток.
    2. Убедитесь, что все события записываются во время сортировки индекса. Это даст возможность перечисления общее количество клеток, проанализированы ворот сортировки относительно фактический номер сортировки для отдельных 96-скважины, как не все события, записанные будут отсортированы в колодцы.
    3. После того, как клетки были отсортированы для всего 96-луночных пластины, место пластину в инкубатор культуры ткани при 37 ° C на 5% CO2. Повторите для дополнительных пластин, необходимых на эксперимент.
    4. Совместное культуры индивидуально сортировка клеток в 96-Уэллс содержащие AGM-EC (из шага 4.3) на срок до 7 дней (5 дней для ячеек, Сортировка от E11-11,5 эмбрионов, 6 дней от E10-10.5 эмбрионов, 7 дней от эмбрионов E9-9.5). Визуализируйте гемопоэтических колоний различных размеров и морфологии с инвертированным микроскопом на 100 крат (рис. 2B) после периода совместного культуры.
      Примечание: Средства массовой информации не нужно быть изменен в период совместного культуры. Сортировка кроветворения прекурсоров могут первоначально интегрироваться в AGM-EC слой с EC-как морфология и не могут быть изначально отличать от AGM-EC стромы (рисунок 2A). Однако следующих 24-48 ч в сотрудничестве культуре, небольшие, округлые гемопоэтических клеток или кластеры клеток могут быть обнаружены. В конце совместного культуры (5-7 дней) отдельные колонии гемопоэтических клеток могут быть визуализированы в подмножестве 96-скважин, которые получил отсортированный ячейки с клоновых гемопоэтических потенциалом. Если визуально инспектируемого скважин содержат более чем один собственный колонии, то этот образец исключается из вниз по течению анализа исключить образцы, которые получили более чем одну ячейку Сортировка в колодец.

5. анализ клоновых гемопоэтических потомства, после совместного культуры

  1. Урожай клоны из каждого 96-луночных для анализа СУИМ.
    1. Энергично пипетки не присоединяться гемопоэтических клеток эндотелия слоев с помощью многоканальных дозаторов с 200 мкл наконечники. Старайтесь не разъединять эндотелиального слоя. Удаление 100 мкл (~ 50% выборки) для фенотипического анализа гемопоэтических потомства, СУИМ.
    2. Трансфер в 96-луночных V-днище и центрифуги на 300 x g за 2 мин до Пелле клетки. Удалите средства массовой информации, стряхивая СМИ от пластины с одним быстрым движением, в то время как перевернутый пластину (проведите пластины).
    3. Поместите оставшиеся 100 мкл клетки в оригинальной 96-луночных пластины в incubatorfor использования 37 ° C в последующих приживления assay (шаг 6).
  2. Инкубируйте клетки с соответствующей антитела для гемопоэтических анализа.
    1. Вновь приостановите гранулы клеток в каждой скважине 96-луночных V-дно с 50 мкл PBS/2% FBS, содержащий блок FcR 10 мкг/мл и 1 мкг/мл DAPI. Инкубируйте пластину на 4 ° C за 5 мин.
    2. Добавьте 50 мкл PBS/2% FBS, содержащие 10 мкг/мл FcR блок и смесь антител для анализа HSC, содержащие PE-Cyanine7-конъюгированных анти VE-Кадгерины, конъюгированных PerCP анти CD45, PE-конъюгированных анти EPCR, конъюгированных APC анти Sca1 и конъюгированных FITC анти Gr1 и анти F4/80 (каждое антитело на окончательное разведение 1: 100 если не указано иное, на основе рекомендаций изготовителя или согласно титрования). Инкубируйте пластину на 4 ° C для по крайней мере 20 мин.
  3. Удалить несвязанные антитела с последовательным разведений и анализировать клетки.
    1. Добавьте 200 мкл в хорошо PBS/2% FBS и центрифуги на 300 x g за 2 мин до Пелле клетки. Затем проведите пластины удалить супернатант и добавить 200 мкл PBS/2% FBS в каждой ячейке гранул и центрифуги на 300 x g за 2 мин до Пелле клетки.
    2. Проведите пластины, чтобы удалить супернатант и добавьте 50 мкл/хорошо PBS/2% FBS для анализа. Перейти для анализа клеток СУИМ, используя проточный цитометр, оснащенном читателем пластины.
      Примечание: Приобретать фиксированный объем клеток (например, 35 мкл всего 50 мкл, используемые для ре подвеска) для перечисления подмножеств гемопоэтических потомства.
  4. Анализ данных СУИМ для каждой скважины, содержащий гемопоэтических потомства экран для колоний, которые содержат HSC потенциальных (рис. 3).
    1. Первые ворота CD45 позитивные населения, что является отрицательным для миелоидных маркеры Gr1 и F480. Не ворота из клеток, которые по-прежнему низкий уровень VE-Кадгерины. VE-Кадгерины положительные и отрицательные CD45 клетки от слоя AGM-EC, которые разрушаются во время сбора урожая гемопоэтических колоний.
    2. Ворота CD45+VE-Cad- / низкаяGr1 ячейки F4/80– –далее на подмножества, что Экспресс высокие уровни EPCR и Sca1 (рис. 3A -C).
      Примечание: В предыдущих исследованиях, колоний, не хватает клетки с CD45+VE-Cad- / низкаяGr1–F4/80–Sca1ПриветEPCRПривет фенотип (рис. 3D) можно воспроизвести не удалось представить обнаружению мультилинейного периферической крови приживления в облученных получателей мышей17 (данные не показаны); Таким образом эти колонии не должны быть включены в анализ последующей трансплантации в шаге 6.

6. анализ приживления свойств отдельных клонов и корреляции с фенотипических свойств выяснены путем сортировки индекса

  1. В день (если возможно) или утром после фенотипического анализа в шаге 5, вновь приостановил оставшиеся 100 мкл клетки от каждого 96-луночных содержащие гемопоэтических колоний после совместного культуры (из шага 5.1), энергичные дозирование с помощью кончика пипетки 200 мкл.
  2. Подготовка и добавить спасения клетки от всего костного мозга congenic штамма B6. SJL-PtprcЭППУb/BoyJ (B6 CD45.1) взрослых мышей16,17.
    1. Подсчитать ячейки ядерных костного мозга в растворе турками под Горяева. Разбавляют до концентрации 5 x 105 тому клеток/мл в PBS с 2% FBS.
    2. 100 мкл спасения клеток костного мозга (5 x 10-4) для каждой скважины, содержащий гемопоэтических потомства для трансплантации анализа и смешивать, закупорить.
  3. Трансплантации потомства индивидуальных клонов в единый смертельно облученных получателей congenic штамм B6. SJL-PtprcЭППУb/BoyJ (B6 CD45.1) взрослых мыши.
    1. Смертельно облучить одинаковое количество мышей B6 CD45.1 как количество клонов придать индивидуально потомства один клон (используя 1000 КГИ от источника цезия).
    2. Нарисуйте 200 мкл суспензии всего клеток (это включает в себя клетки от клонов, а также клетки костного мозга спасения B6 CD45.1 5 x 10-4 ) в ½ мл инсулин шприц с иглой 29 G ½ дюйма.
    3. Смертельно облучить B6 CD45.1 взрослых получателей перед 2-24 ч для инъекций.
    4. С помощью мыши пластиковый фиксатор, который позволяет доступ хвост, придать через хвост вен 200 мкл тома, содержащего как от каждого клона и 5 x 104 B6 CD45.1 взрослого костного спасения клетки для помощи в получателей выживания.
    5. Ухо тег и весят получателя мышей и проверить их вес/здоровье на регулярной основе (например, 3 - 4 раза / неделя пост облучения/трансплантации, или на отдельных организационных стандартных оперативных процедур) для обеспечения хорошего здоровья.
  4. Выполнить анализ периферической крови приживления на регулярной основе (например, 2, 16, 24 недель) после трансплантации.
    1. Удаление 50-100 мкл крови через ретро орбиталь кровотечение или другой метод давая этически утвержденных крови.
    2. Добавить 3 мл буфера lysis (16,6 g NH4Cl, 2 g NaHCO3 и 74.4 мг ЭДТА 2 L H2O) в крови и инкубации при комнатной температуре на 5 мин центрифуги на 300 x g 5 мин аспирата и вновь приостановить лепешка с 2 мл PBS/2% FBS. Центрифуга на 300 g x 5 мин.
    3. Вновь приостановить лепешка с 150 мкл PBS/2% FBS содержащего 10 мкг/мл FcR блока и 1 мкг/мл DAPI и отказаться от 1/3 тома, также содержащий 50 мкл изотипа элементов управления для доноров и линии, 1/3, также содержащий 50 мкл антител для доноров и изотипа элементов управления для линии и 1/3 в колодец, содержащей 50 мкл антител для обнаружения как доноров, так и линии.
      Примечание: Антитела для обнаружения мультилинейного приживления: конъюгированных APCeFluor780 анти CD45.2, пе-Cyanine7-конъюгированных анти CD45.1, FITC-конъюгированных анти CD3, PE-конъюгированных анти F4/80, PerCP конъюгированных анти Gr1 и APC-конъюгированных анти CD19, или isotype соответствующие элементы управления.
    4. Выявления клонов с долгосрочным приживления путем оценки вклада периферической крови СУИМ со временем CD45.2 (донор)-производных гемопоэтических клеток миелоидного (Gr1 и/или F4/80 положительный), B-клеток (CD19 положительный) и Т-лимфоцитов (CD3 положительным) (Рисунок 4A -B).
      Примечание: Гемопоэтических приживления также могут быть проанализированы CD45.2 (донор)-производных вклад гемопоэтических населению из тканей, собирают из костного мозга, селезенки, вилочковой и брюшины, или после вторичного трансплантации клеток костного в B6 CD45.1 мышей для анализа последовательных приживления свойства17.
  5. Соотнести каждый клон фенотипических свойств как определяется индекс первоначальный одну ячейку Сортировка с его приживления свойствами. Использование программного обеспечения для анализа потока, загрузите параметры сортировки для каждого индекса сортировка клеток, (коррелирует с 96-луночных, к которому он был отсортирован). Карта функционального данные на участках потока для оценки фенотипических свойств одиночных клеток, как они относятся к их функциональных вывода (например, долгосрочные, мультилинейного приживления) (рис. 4 c).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 1A показана схема экспериментального дизайна. После того, как P-Sp/AGM тканей расчлененный, пул и отделить в коллагеназы, они запятнаны с антителами к VE-Кадгерины и EPCR для сортировки индексов. Pre-HSC обогащаются в клетках, на VE-Кадгерины+EPCRв?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Изучение генезиса HSC во время эмбрионального развития требует средства для выявления потенциальных прекурсоров кроветворения, еще не хватает компетенции предоставлять долгосрочные мультилинейного кроветворные воссоздания в трансплантированы взрослых получателей HSC. В этом протоко...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Эндрю Бергер, Стейси Dozono и Брайан Раден в Фреда Хатчинсона потока Cytometry ядро для помощи с СУИМ. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения NHLBI UO1 Грант #HL100395, вспомогательные совместный грант #HL099997 и NIDDK Грант #RC2DK114777. Брэндон Хадланд поддерживается в Лимонад Стенд Фонд Алекс и Hyundai надежды на фундаменте колеса.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE ExpressGibco12605-028Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in waterStemCell Technologies7903Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture platesCorning3599Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottlesFisher Scientific9741202Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Bovine SerumFisher ScientificSH30088.03100 mls
Penicillin StreptomycinGibco15140-1225 mls
HeparinSigmaH314950 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM)StemCell Technologies71005 mls
Endothelial Mitogen (ECGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%)StemCell Technologies7902Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringeBD Biosciences309657Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filterMilliporeSLGP033RSUse to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer capCorning352235Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O)Millipore268298Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block)BD Biosciences553141Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7eBioscience25-1441-82Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7eBioscience25-4301-81Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PEBD Biosciences558040Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PEBD Biosciences553925Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITCeBioscience11-0451-85Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCeBioscience11-4031-81Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottomCorning3894Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-0451-82Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5eBioscience35-4031-80Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PEeBioscience12-4031-81Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APCeBioscience17-4321-81Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITCeBioscience11-4321-41Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITCBD Biosciences556923Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needlesBD Biosciences309306Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCPBiolegend108426Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCPBiolegend400629Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PEeBioscience12-4801-82Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PEeBioscience12-4321-80Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITCBD Biosciences555274Staining
Anti-mouse CD19 APCBD Biosciences550992Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APCBD Biosciences553932Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7eBioscience25-0453-82Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7eBioscience25-4321-81Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA softwareBD Biosciences
BD FACSCanto II with plate readerBD Biosciences
HaemocytometerFisher ScientificS17040For counting cells
Multi-channel pipetteFisher Scientific14-559-417For dispensing cells
FACS analysis softwareFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo

Ссылки

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135pre HSCAGM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены