Терапия, тестирование в модели культуры на основе сфероида 3D клеток для головы и шеи плоскоклеточный рак

Резюме

Мы описываем эволюции на основе сфероида, трехмерный в vitro модель, которая позволяет нам проверить текущий стандарт экспериментальной терапии схем для головы и шеи плоскоклеточный рак на клеточных линий, направленных на оценку терапии восприимчивость и сопротивления на первичной клетки от человеческих образцов в будущем.

Аннотация

Текущие варианты лечения для продвинутых и рецидивирующий головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC) заключить излучения и химио лучевой подходы с или без хирургического вмешательства. Хотя схемы химиотерапии на основе платины в настоящее время представляют золотой стандарт с точки зрения эффективности и даны в подавляющем большинстве случаев, новых схем химиотерапии, а именно появляются иммунотерапии. Однако трудно предсказать и остаются недостаточно понятны ответов и терапии сопротивление механизмы либо режим химиотерапии. На сегодняшний день известны широкие вариации химиотерапии и радиационной механизмов сопротивления. Это исследование описывает разработку стандартизированных, высокой пропускной способности в vitro пробирного оценить ответ HNSCC клеточной линии для различных схем терапии и, надеюсь, на первичной клетки от отдельных пациентов как инструмент будущего для персональной опухоли терапии. Assay предназначен для интеграции в стандартный алгоритм контроля качества для HNSCC пациентов в нашем центре третичной медицинской помощи; Однако это будет предметом будущих исследований. Техническая осуществимость выглядит многообещающим для начальных ячеек от биопсии опухоли от фактической пациентов. Затем образцы передаются в лабораторию. Биопсия механически отделены следуют ферментативного пищеварения. Клетки затем культивировали в ультра-низкой адгезии клеток культуры флаконов, способствующих воспроизводимость, стандартизированных и спонтанного формирования Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Сфероидов затем готовы быть подвержены химио лучевой протоколы и протоколы иммунотерапия при необходимости. Окончательный размер жизнеспособность и сфероида показатели восприимчивости терапии и поэтому может быть втянутыми в рассмотрение в будущем для того, чтобы оценить ответ вероятно терапии пациентов. Эта модель может быть ценным, экономически эффективным инструментом к персонализированной терапии рака головы и шеи.

Введение

Голова и шея плоскоклеточный рак (HNSCC) является шестым наиболее распространенных рака во всем мире с ростом случаев инфицирования слизистой оболочки вируса папилломы человека (ВПЧ) инфекции связанные патогенеза, рядом с большинством случаев, вызванных чрезмерным никотина и алкоголя потребление ^1,2. Хотя небольшие опухоли и неинвазивного этапов, как правило, хорошо поддается лечению с хирургическое иссечение, обычно в сочетании с шейки матки лимфодиссекции, лечение для расширенного этапа и рецидивирующий HNSCC остается сложным из-за вторжения агрессивным опухоль с Метастатические распространение и устойчивость к радиации и химиотерапии протоколы^3,4,5,6,,78. Недавние исследования показывают высокую изменчивость клеточном фенотипу и суб характеристика циркулирующих и распространение раковых клеток только начался^9,10. Ранее вера твердых, форма опухоли массы пришлось пересмотреть в свете последних исследований в прошлом лет^11,12,13,14. Нынешние подходы для характеристики опухоли и выявление ключевых мутаций может определить несколько генов, которые, кажется, быть связаны с терапии сопротивление, но остаются дорогостоящих подход. Кроме того знание генотип не обязательно позволяют надежное прогнозирование фенотипа и его лечение реакции.

Там было несколько достижений в улучшении общей и безрецидивной выживаемости для расширенный этап и повторяющихся болезней. Никотин - а также связанные вирус карциномы текущие варианты лечения Помимо хирургии заключите агрессивной радиационной и химиотерапии на основе платины схемы. Там были последствия для различных ответов между ВПЧ отрицательных и положительных карцинома; Однако это еще не приведет к изменению в целом руководящие принципы терапии. Устойчивость к радиации и химиотерапии является широко распространенным явлением во всех стадиях опухоли и существует на основе платины химиотерапии также, как для целенаправленной терапии (анти-EGFR; рецептор эпидермального фактора роста) и недавно новые ингибирование контрольно-пропускного пункта¹⁵. Неэффективные лучевой и химиотерапии приходят высокой ценой значительных пациента заболеваемости с точки зрения дисфагии, мукозит, сухость во рту и риск снижения функции почек или сердца среди других. Прогнозирование терапии реакции предварительное решение концепции общей терапии для каждого отдельного пациента, как представляется, решающую цель, предотвращая концепции ненужных лечения, побочные эффекты и расходы.

Мы стремились создать модель для проверки конкретного пациента лечение восприимчивость к текущей стандартной химио излучения, которые могут быть интегрированы в регулярных и контролем качества онкологического лечения алгоритм с точки зрения технической стоя. Далеко целью было использовать модель без использования сильно изменены и возрасте клеточных линий, как плохо они представляют собой фактические человека опухолевых клеток без их изменчивости и неоднородности, как мы знаем теперь, при создании протокола было сделано в различных клеточных линий. Быть независимым только от коммерчески доступных клеточных линий, мы недавно успешно созданы промежуточные клетки линии, называется «Пика» от первичных клеток HNSCC от человека опухоли образцов с сохранение клеточных маркеров на его поверхности и ограниченные отрывки ¹⁶. это PiCa клеточной линии должны служить подготовка к разработке модели на дороге к позже после испытания с свежими человеческих раковых клеток с биопсий опухоли. Было показано, что клетки в трехмерной клеток культур по-разному реагируют и более в естественных условиях-как для отправления рака наркотиков, чем тех, кто растет в монослои^{17,18,19,20 ,21}, главным образом благодаря сохранению мигрирующих и суб дифференциация свойств определенных ячеек подмножеств^22,23,24. Здесь мы описываем протокол на основе сфероида, трехмерные модели из промежуточных клеточных линий и первичного человека плоскоклеточный рак ячейки и способы как интегрировать такую модель в лечение рака головы и шеи хирург, онколог ( Рисунок 1).

протокол

Все исследования, показано в этой рукописи, а именно использование образцов человека опухоли, защищены и в согласии с предыдущими решениями от медицины Университета Майнца/Университет Мюнхена медицинский центр по этике. Пациентов дали осознанного согласия согласно национальных правовых руководящих принципов, согласившись научного использования избыточного биологического материала, который был получен в ходе их лечения. Исследование проводилось во исполнение всех институциональных, национальные и международные руководящие принципы для благополучия человека.

1. Принимая биопсия опухоли головы и щеколда плоскоклеточный рак

1. Выполнять общие (пропофолом и/или севофлуран, расслабляющий мышцы агент) или местные инфильтрат (2% ultracaine, адреналин) / поверхности (xylocaine) анестезии в операционной комнате или ЛОР кресло экспертизы. Визуализировать массы опухоли в устной полости, глотки, гортани, других частях верхнем тракта пищеварения и дыхания с стандартной операционной инструментов и, при необходимости, под микроскопом.
2. Возьмите биопсии свежие опухоль от периферии раковые новообразования с тупым или режущие инструменты. Избегайте центр поражения результате обильные некроза в этой области. Поместите полученные ткани в стерильный контейнер с натрия хлорида изотонический раствор.
3. После биопсии, гемостаз при необходимости выполните, например., с устройством биполярный или монополярная коагуляция, помимо использования сосудосуживающих веществ.
4. Принесите биопсия опухоли, использоваться для экспериментов культуры клеток непосредственно в прилегающие Лаборатория тракта. Отправьте другой биопсий тумора pathologist как обычно, чтобы исключить рак.
5. Убедитесь, что лаборант готова для обработки образца непосредственно.

2. обработка образца тумора

1. Поместите образец опухоли на поверхность подходящим и стерильные и нарезать его тщательно с стерильным скальпель одноразовый как можно меньше.
   Предупреждение: Убедитесь, что статус инфекционных и передаваемых через кровь заболеваний хорошо документированы и техник в внимание учреждений стандартные протоколы для предотвращения иглы stick или резки травмы с потенциально биологически опасных пациентов материала и протоколы следовать после возможной травмы.
2. После достаточного механического разделения основной ткани, положить ткань во флакон, содержащий коллагеназы I / II и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Сито через стрейнер клеток Сокол 70 мкм и мыть подвеска с Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS).
3. После успешного разъединения и последующие стирки место суспензии, содержащей 1-2 × 10⁶ клеток в T75 колбы культуры клеток (75 см²) расти в суб confluency в 5% CO₂ и температуре 37 ° C. Этот шаг может занять до 10 дней.
   1. Использовать специальные кератиноцитов питательной среды, состоящей из следующих: 125 мл Дульбекко модифицированная орлы среднего (DMEM), 250 мл кератиноцитов дополняет среды (дополняться среднего, состоящий из 500 мл среды SF кератиноцитов, 15 мг гипофиза крупного рогатого скота экстракт (BPE), 2,5 мл пенициллина/стрептомицина, 150 нг рекомбинантного человеческого эпителиального фактора роста (EGF), 516 мкл 300 мм CaCl₂, запасов смеси должен быть подготовлен заранее), 125 мл F12 питательные смеси, 10 мг BPE (0,75 мл), 75 нг рекомбинантного человеческого EGF (2 мкл) , 3,75 мл 200 мм L-аланил-L-глютамин-дипептид (таблица материалов).

3. Заполнение ячеек в ультра-низкой адгезии клеток культуры пластин

1. Подтверждают рост опухолевых клеток под микроскопом. Подсчитать ячейки в культуре (первичный или клеточные культуры) и семян 5000 первичной опухоли клетки или клетки 1,000-2,000 промежуточных клеточной линии / линия другие клетки в 200-300 мкл СМИ (шаг 3.2.) в ультра-низким сцеплением пластины с вогнутой, круглые днища (96-луночных).
2. Культура клетки на 5% CO₂ при 37 ° C и в равных частях DMEM и сократимость эпителиальных клеток среднего (BEGM), плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина, пируват натрия 1%, 1% несущественные аминокислот, 1% L-глютамин (шаг 2.3.). Если используются клеточные линии, средства массовой информации на основе DMEM является достаточным.
   1. Выполните изменения средств массовой информации каждый день. Обратите внимание не аспирационная сфероида с пипеткой во время изменения средств массовой информации. Культура сфероидов до уровня роста, как descibed в 3.3 достигается (примерно 7-10 дней).
3. Подтвердите спонтанное сфероида формирования под микроскопом, ищет Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Исключите скважин с нерегулярными или нескольким сфероида формирования от дальнейшего расследования.
   Примечание: Сфероидов должны быть видны невооруженным глазом, тоже, содействия дальнейшей обработки и средства массовой информации изменения, как описано ниже.

4. выявление сфероидов смешанных стандартных или экспериментальных опухоли терапии

1. Выбор режима желаемого терапии. Дизайн достаточно большими управления группы, которые позволяют сравнения лечения для без лечения сфероидов или получения только частичное терапии лечения, напримерсфероидов. излучение в одиночку. Размер группы элементов управления зависит от конструкции экспериментальной группы и не может быть определена повсеместно.
2. Обмен средств массовой информации к средствам массовой информации с добавками, смысл СМИ с химиотерапевтические или моноклональные антитела в желаемой концентрации. Добавление цисплатина в концентрациях мкм 2,5/5/10 или 5-fluoruracil (5-фу) на 30 мкм.
   Примечание: Для высокой пропускной способности экспериментов или большой группы размеров/большое количество групп, один можно использовать автоматического дозирования робот, как мы далее устанавливают в экспериментах.
3. Кроме того излучают пластины культуры клеток с сфероидов на 2 гр, с помощью подходящего излучения.
   Предупреждение: Уважение института протоколы относительно предотвращения вредного облучения работников. Работать только с назначенными и обученных техников по руководящие принципы радиационной защиты. При желании добавьте химиотерапевтические как описано до 4.2. После этого.
4. Инкубируйте клетки для 24 ч в условиях ранее описанных культуры (37 ° C, шаг 3.2).
5. После инкубации продолжить культуры клеток для по крайней мере 6 дней с изменениями средств массовой информации каждый день.

5. Оценка сфероида размер и масштабы для считывания Assay пролиферации

1. Измерьте размер сфероида по площади после цифровой фото документации на 6 день (10 день, день 16) с помощью графического программного обеспечения (параметр 1).
2. После центрифугирования в 520 g x 2,5 мин пластины удалите супернатант. Мыть ячейки с достаточным количеством 1 x PBS и центрифуги, пластину снова как описано, а затем удалить супернатант (PBS).
3. Добавьте 100 мкл ферментативные клеток отряд решения каждого флакона позволяют сфероидов распустить. Инкубировать пластину для 8 минут при 37 ° C.
4. Проверка успешного растворения сфероида под микроскопом. 100 мкл DMEM. Центрифуга пластину на 520 x g 2,5 мин удалить супернатант и приостановить клетки в 100 мкл DMEM.
5. Выполните assay коммерчески доступных колориметрические распространения, в примере WST-8 assay на каждом флаконе согласно инструкции производителя²⁵. Зачитал assay в читалку иммуноферментного анализа (ИФА) (параметр 2).

Результаты

Мы были в состоянии сформировать можно воспроизвести сфероидов от одноклеточного суспензий, сначала из различных клеточных линий, включая проприетарные PiCa клеток линии, позднее от первичных человеческих раковых клеток, производным от свежих опухоли биопсий, как опи?...

Обсуждение

Мы смогли установить протокол для создания воспроизводимых сфероидов из клеточных суспензий, для обеих линий клетки и в предварительных экспериментов, клетки первичной опухоли человека. Мы сначала оценить два ранее описанных методов и определили Ула метод, где используются культуры ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350