Поверхности функционализации наночастиц вирус гепатита Е, используя методы химической спряжение

Резюме

Мы инженерии капсульных белков вируса гепатита Е как наночастиц theranostic (HEVNP). HEVNP самостоятельно собирает в стабильной икосаэдра клетку в слизистой доставки. Здесь мы описываем изменения HEVNPs для ориентации, мутирует поверхности подвергаются остатков, к которым, которые конъюгат синтетическими лигандами, конкретно привязанные опухолевых клеток опухоли.

Аннотация

Вирусоподобных частиц (VLP) использовали как nanocarriers для отображения иностранных эпитопов или доставить небольшие молекулы в обнаружения и лечения различных заболеваний. Это приложение полагается на генетической модификации, самостоятельной сборки, и хвоща спряжение выполнить против опухоли применение рекомбинантного VLP. по сравнению с генетической модификации одиночку, химические спряжение иностранных пептидов VLP предлагает значительное преимущество, потому что она позволяет целый ряд организаций, таких как синтетических пептидов или олигосахариды, чтобы конъюгированных на поверхности VLP модулированных и гибким образом без изменений VLP Ассамблеи.

Здесь мы продемонстрируем использование наночастиц вирус гепатита E (HEVNP), Модульная theranostic капсулу, как многофункциональный доставки перевозчиком. Функции HEVNPs включают ткани таргетинг, визуализации и терапевтические доставки. На основе устоявшихся структурных исследований HEVNP, структурно независимым и открытые поверхности остатки были отобраны для хвоща замены как спряжение сайты для maleimide связаны химических групп через тиоловых селективный связей. Один частности хвоща модифицированных HEVNP (замена Cys аспарагина в 573 aa (HEVNP - 573C)) был конъюгированных к груди рак клеток конкретных лиганд, LXY30 и помечены с ближней ИК-области спектра (NIR) флуоресценции краситель (Cy5.5), визуализации, опухоль целевой HEVNPs как эффективный диагностический капсулы (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Подобные инженерной стратегии могут быть использованы с другими макромолекулярных комплексов с известным атомных структур для изучения потенциальных приложений в theranostic доставки.

Введение

Развитие нано размера векторов в лечебных и диагностических доставки, известный как nanotheranostics, изменилось многое из области биомедицины от обобщенных процедур к целенаправленной доставки¹. Целевые nanotheranostic доставки интегрирует нано размера вектора (наночастиц) с theranostic молекулами стабильно прямого theranostic молекулы к конкретным больные ткани или биохимические пути^2,3,4 . Наномедицина пришел на первый план целенаправленной доставки, потому что оптимально размеров наночастиц имеют способность стабилизировать распространение theranostic молекул и выборочно целевых клеток поверхности молекул, представленные на пораженные ткани. Многие nanotheranostic платформах по-прежнему страдают от пассивного клеток поглощения, предварительно пожилые деградации, токсичности и недостаточно ассоциации с theranostic молекулами. VLP преодолеть многие из этих препятствий в целенаправленной доставки. Они использовали как nanocarriers для отображения иностранных эпитопов или доставить небольшие молекулы: режим, который может использоваться для борьбы с многих заболеваний¹. Это приложение полагается главным образом на имущество самостоятельной сборки, а также простота генетических изменений, выполнить разработанные приложения для данного VLP. По сравнению с генной инженерии, химические спряжение иностранных пептидов в ВЛП отображает значительное преимущество, потому что она позволяет множество сущностей, например пептидов или олигосахариды, чтобы конъюгированных на поверхности VLP в модулированных и гибко без изменений VLP Ассамблеи.

HEVNPs, производные от Рекомбинантный белок капсид ГЭМ, 2-^й открытый чтение фрейма (ORF2), неинфекционных, самостоятельной сборки capsids, способный клеток привязки и вход. Потому что HEV эволюционировали для слизистой передачи, собранный капсид белок аналогично стабилен в протеолитические и кислой слизистой условия⁵. HEVNPs образуют дупло, T = 1 икосаэдра капсида, состоящий из 60 идентичных блоков^6,7 ORF2, делает его весьма стабильным, как хранения, так и в суровых условиях физиологических. Отсутствие любой вирусный генетические элементы, производство эффективной, высокая урожайность достигается через бакуловирусы выражение системы в клетках насекомых. Из-за их протеолитических стабильности, собственн-собранные HEVNPs извлекаются и очищенной от клеток супернатанта, существенно снижая необходимой очистки шагов. Кроме того HEVNPs обладают поверхности подвергаются выступ домена (P) подключен через гибкий шарнир стабильную базу икосаэдра. P домен формы поверхности подвергаются шипы на вершине икосаэдра базы в то время как гибкая петля позволяет значительно изменить домен P без ущерба для базовой структуры икосаэдра. С 60 неоднократные единиц один участкам модифицирование приводит в 60 симметричный сайтов для химического модуляции. Недавно мы предложили нано платформу с помощью HEVNP, которая может химически конъюгат лигандами или малых молекул для theranostic приложений. Это было достигнуто путем замены одной Аминокислоты цистеина на выступ домена HEV-VLP как реакция сайт с связаны maleimide пептидами или молекул. Основываясь на предыдущих структурный анализ HEV-VLP и хорошо изучена иммуногенность epitopes^8,9, следующих пяти HEV-VLP аминокислоты были заменены хвоща как потенциальных кандидатов: Y485C, T489C, S533C, N573C и T586C ( Рисунок 1). После очистки от насекомых клеток и выражение, их VLP образований были подтверждены передачи электронной микроскопии (ТЕА) наблюдения (рис. 2), и подвергаются хвоща сайты были проанализированы Западной пятно после maleimide связаны биотин Спряжение (рис. 2). Среди пяти мутантов HEVNP - 573C отображается сильный сигнал maleimide биотин спряжение (рис. 2) и был использован для последующих демонстрации как nanocarrier для клетки рака груди на⁴ (рис. 3).

Этот протокол описывает методы химической спряжение придавать HEVNPs опухоль ориентация молекул путем сопряжения поверхности цистеина. Мы подробно спряжение опухоли обнаружения и ориентации молекул для доставки опухоли с рекомбинантным HEVNPs, содержащий цистеина в N573 (HEVNP - 573C). Мы сосредоточились на двухэтапный нажмите химии спряжение процесс привязки опухоли рака молочной железы, ориентация пептид, LXY30¹⁰ HEVNPs в форме LXY30-HEVNP (рис. 4). Впоследствии, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 были конъюгированных на отдельный сайт Lys на HEVNPs построить LXY30-HEVNP-Cy5.5 флуоресцентного обнаружения как в пробирке (рис. 5) и в естественных условиях⁴.

протокол

1. HEVNP производство в клетках насекомых

Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в капюшоне культуры клеток. Обратитесь к нашей предыдущей публикации для более подробной HEVNP производства процедуры¹¹.

1. Культура клетки Sf9 в СМИ насекомых клеток (см. Таблицу материалы) до 50-75% слияния в 6-ну пластины.
2. Использование насекомых клеток трансфекции реагентов по данным производителя протоколы, transfect Bacmids, содержащих HEVNP - 573 C ORF2 в Sf99 клетки производить рекомбинантные бакуловирусы. Инкубируйте transfected клеток при 27 ° C 3-6 дней, в зависимости от жизнеспособности клеток.
3. Соберите супернатант в 3-6 дней после заражения (после transfected клетки лизированы бакуловирусы инфекции) как запас бакуловирусы P0.
4. Удаление питательной среды перед применением 200 мкл акций P0 до 50-75% вырожденная Sf9 клеток в колбе монослоя² 25 см. Рок колбу каждые 15 мин для обеспечения полного охвата посевным материалом. Повторите 4 раза, в общей сложности 60 мин.
5. Добавить 2 мл насекомых клеток питательной среды в колбу и держать на 27 ° C 3-6 дней, в зависимости от жизнеспособность клеток, чтобы усилить бакуловирусы высокий титр.
6. Проведения анализов доска для получения бакуловирусы титр, читать¹².
7. Культура взвешенных Tn5 клетки насекомых (Таблица материалов) 100 мл среды насекомых клеток в 250 мл флакон и встряхните в 27 ° C 150 об/мин до титра 0,5 x 10⁵ -⁶ 1 x 10 для прививки.
8. Добавление бакуловирусы на разносторонности инфекции (МВД) 5-10 до 100 мл Tn5 клеток в 250 мл флакон. После прививки встряхните в 27 ° C 150 об/мин за 5-7 дней.
9. Как только большинство клеток, как представляется, имеют везикулы и 70-90% клеток мертвых под наблюдением оптический микроскоп, собирать Tn5 клеток и передачи в 33 мл ультрацентрифуга трубы. Место ультрацентрифуга трубы в свинге ведро роторов, баланс и спин вниз ячейки мусор и рекомбинантные baculoviruses на 10 000 g x 90 мин при 25 ° C.
10. Держите супернатанта, содержащий выпустила HEVNPs на 4 ° C для дальнейшей очистки. Для длительного хранения бакуловирусы супернатанта добавьте ингибиторов протеазы.

2. HEVNP очистки

1. Гранулы и изолировать HEVNPs, с использованием градиента разделения цезия хлорид (CsCl):
   1. Передавать собранные супернатант (из шага 1.10) и добавить 20% NP-40 в каждую пробирку, чтобы сделать окончательный концентрации 0,5% NP-40 распустить все оставшиеся клеточной мембраны. Аккуратно перемешать, закупорить и Инкубируйте по крайней мере 30 мин при температуре 25 ° C.
   2. Ультрацентрифуги HEVNPs на 112,400 x g в свинге ведро роторов втечение 2 ч при температуре 4 ° C для пеллет вниз HEVNPs от супернатант. Отменить надосадке после центрифугирования и нежно вновь приостановить сырой гранул в 200 мкл 10 мм MES буфер рН 6,2 в каждой тюбике на ночь (O/N) при 4 ° C. Запустите SDS-PAGE (шаг 3.1) для подтверждения присутствия HEVNP ORF2 в сырой гранул как 52 kDa группа.
   3. Подготовьте градиент CsCl 38,5% (w/v) путем смешивания 1.96 g CsCl, вновь приостановлено сырой гранул и ~ 4 мл 0,01 М MES pH 6.2 в 5 мл ультрацентрифугирования. Баланс трубы и место в размахивая ведро ротора. Ультрацентрифуги на 147 000 x g для 16 h при 4 ° C.
2. После CsCl градиент сбор фракций:
   1. Выбросите Топ 500 мкл фракция, которая является главным образом легкие клеточной мембраны мусора. Сбор 500 мкл фракций, начиная с верхней части трубки и изменить советы между каждой фракции. Поместите каждую долю в пронумерованных/меткой 1,5 мл пробирок.
      Примечание: Наличие HEVNP ORF2 в долях, отделены от CsCl градиент не могут быть обнаружены путем запуска страницы SDS гели из-за высокой концентрации CsCl. CsCl в каждой фракции могут быть удалены или разбавленный следуя процедуре очистки CsCl. Кроме того CsCl градиента могут быть заменены на 10-40% сахарозы градиента¹³ чтобы избежать CsCl остаточных.
   2. Передать 5 мл ультрацентрифуга каждой фракции и разбавленных CsCl с 4,5 мл 10 мм МЧС, pH 6.2. Баланс трубы и место в размахивая ведро ротора. Ультрацентрифуги на 147 000 x g за 2 ч при 4 ° C до Пелле вниз HEVNPs.
   3. Отменить супернатант и нежно вновь приостановить HEVNPs в 100 мкл 10 мм MES рН 6,2 в каждой тюбике. Обложка трубы, чтобы избежать испарения и инкубировать O/N при 4 ° C.
   4. Запись A280 чтения и соотношение A260/A280 Нм, с помощью спектрофотометра. Определите Приблизительные концентрации ORF2 как:
      
      Каждый ORF2 будет содержать 1 сайт Cys и 1 Lys сайт для химического спряжение.
      Примечание: Коэффициент молярной вымирания HEVNP ORF2 является 60,280, что эквивалентно 1.019 мг/мл × A280. Это так близко к 1:1, концентрация HEVNPs (в мг/мл) могут быть аппроксимированы A280 и, следовательно, концентрация ORF2 выше уравнение. К примеру, HEVNP с A280 чтение 1 будет иметь концентрации 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм ORF2.
   5. Подготовьте SDS-PAGE. Для определения фракций, содержащих 53,3 кДа HEVNP ORF2 белка (шаг 3.1) используйте 6 мкл пример от каждой фракции. HEVNPs должно быть найдено в фракции 3-5, с плотностью ~1.25 г/мл.
   6. Подтвердите наличие и чистоты HEVNPs ТЕА наблюдения. Подготовка или развести образцы HEVNP 0,5 - 2,0 мг/мл для ТЕА. HEVNPs появляются в ТЕА в виде пустой икосаэдра белки, ~ 27 Нм в диаметре (рис. 2). Некоторые белковых загрязнений могут оставаться во фракциях и будет соблюдаться в рамках ТЕА (шаг 3.2).
3. В случае, что примесей присутствуют под ТЕА повторите шаг 2.1.3 - 2.2.6 для улучшения чистоты HEVNPs.
   Примечание: Загородный очищение через CsCl градиента может привести к потере урожая HEVNPs. Кроме того CsCl градиента очистки могут быть заменены 10-40% сахарозы градиент избежать остаточного CsCl¹³.

3. HEVNP характеристика

1. Подготовьте бис-трис белка гелях SDS PAGE 4-12%, 1,0 мм, 17-Уэллс (см. Таблицу материалы) по данным пользователя вручную¹⁴:
   1. 2 мкл 4 x загрузки буфера 6 мкл образец протеина. Инкубируйте образца смесь в блоке тепла на 10 минут при 100 ° C до денатурировать протеина. Загрузите образцы протеина на геле.
   2. Запустите, установив источник питания постоянного тока на 100 V за 10 мин, затем 150 V за 45 минут до тех пор, пока образцы запустить примерно на 1 см выше нижней части геля SDS-PAGE.
   3. Пятно геля SDS-страницы Кумасси синим цветом (0,25% (w/v) блестящий синий R250 Кумасси, 30% (v/v) метанола, 10% (v/v) уксусная кислота), за 1 ч.
   4. После окрашивания процедуры, удалить пятно Кумасси синий и применять исключения окрашивания буфера (30% (v/v) метанола, 10% (v/v) уксусная кислота) на гель белка для > 12 ч при комнатной температуре.
   5. Документ гель под белый свет, чтобы подтвердить наличие HEVNP ORF2 в полосе 52 кДа.
2. Наблюдать за использованием ТЕА HEVNPs.
   1. Подготовка или развести образцы HEVNP 0,5 - 2 мг/мл с 10 мм MES pH 6.2 для изображений ТЕА.
   2. Ионизировать углерода покрытием сетки с 40 мА тлеющего разряда для 30 s производить поверхности гидрофильных углерода. Свечение разгрузки оборудования описан в Таблице материалов.
      Примечание: Поверхности гидрофильных углерода сеток может только последние 30 мин после свечения разряда лечения.
   3. Держите в пинцета и 2 мкл пример HEVNP к сетке, ждать 15-30 s и пятно с фильтровальной бумаги.
   4. Немедленно промывайте сетку с ddH₂0 и пятно с фильтровальной бумаги.
   5. Сразу же мкл 2 уранила 2% ацетат сетке, подождите 15 s, а затем пятно с фильтровальной бумаги. Сухой образца сетках, поместив их в электронный сушка сухой кабинет для O/N.
   6. Перевести сетку в ТЕА и изображения в масштабе 10-80k. HEVNPs появляются в ТЕА в виде пустой икосаэдра белков, которые являются ~ 27 Нм в диаметре, из-за отсутствия вирусной РНК.

4. Химическая спряжение HEVNPs с биотина, лигандом против рака и флуорофоров

1. Выполните один шаг спряжение HEVNPs и maleimide связаны биотин.
   1. Буфер изменений: применять HEVNPs в мини-диализа и dialyze против 0,01 М PBS рН 7,4 при комнатной температуре за 1 ч по данным производителя протокол (Таблица материалов). Передача HEVNPs 1,5 мл пробирок и измерить концентрацию белка на 280 Нм, используя спектрофотометр.
   2. Смешайте HEVNP 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм Cys реакции сайтов (см. подробности в шаге 2.2.4), с равным количеством maleimide-биотин (100 мкм) в 0,01 М PBS, рН 7,4, чтобы молярное соотношение 1:5; реагировать O/N при 4 ° C. Удаление несвязанных maleimide биотина 40 K MWCO спина Desalting столбец процедурой по данным производителя протокол (Таблица материалов).
   3. Анализируйте образцы через стандарт сокращение SDS-PAGE (шаг 3.1).
   4. С помощью стандартных процедур, подготовьте хемилюминесцентный западной помарке с помощью стрептавидина HRP-связаны. Захват хемилюминесцентный сигнал X ray фильмов (Рисунок 2).
2. Выполните два шаг LXY30 сопряжения поверхности подвергаются хвоща на HEV NPs (рис. 5).
   1. Буфер обмена: применение HEVNPs в мини-диализа и dialyze против 0,01 М PBS рН 7,4 при комнатной температуре за 1 ч. Передача HEVNPs 1,5 мл пробирок и измерять концентрацию белка на 280 Нм, используя спектрофотометр.
   2. Добавить 650 мкм maleimide азид и 650 мкм алкины LXY30¹⁰ в 0,01 М PBS рН 7,4 с 200 мкм CuSO₄ и 1 мм аскорбиновой кислотой сформировать связанный с maleimide LXY30 (Mal-LXY30) на 650 мкм. Инкубируйте смеси на 4 ° C для O/N.
   3. Смешайте HEVNP 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм Cys реакции сайта (см. подробности в шаге 2.2.4), около 10% объем мал-LXY30 (650 мкм) в 0,01 М PBS рН 7,4, чтобы молярное соотношение 1:3; реагировать O/N при 4 ° C.
      Примечание: Из-за относительно высокой концентрацией мал-LXY30, окончательный концентрации реагентов, например CuSO₄, уменьшается примерно в 10 раз после смешивания, чтобы избежать их повреждения HEVNPs. Другим вариантом является метод Cu бесплатно спряжение¹⁵.
   4. Удаление несвязанных maleimide клик LXY30 с 40 K MWCO спина обессоливания столбца в зависимости от производителя протокол (см. Таблицу материалы). Держите связаны LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) при 4 ° C.
3. Выполнить один шаг спряжение LXY30-HEVNPs и Эстер Cy5.5 NHS (ГСЗ-Cy5.5)
   1. Смешать связаны LXY30 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) до 1 мг/мл, что эквивалентно 18,8 мкм Cys реакции сайта (см. подробности в шаге 2.2.4), с равным объемом ГСЗ-Cy5.5 (100 мкм) в 0,01 М PBS рН 7,4 чтобы молярное соотношение 1:5; реагировать O/N при 4 ° C.
   2. Удаление несвязанных Cy5.5-NHS с 40K MWCO спина обессоливания столбца процедуры согласно протоколу производителя (см. Таблицу материалы). Держите LXY30, Cy5.5 связаны HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) при 4 ° C.

5. привязка к HEVNP и интернализации в MDA-MB231 клеток рака молочной железы

1. Семя MDA-MB231 клеток рака молочной железы в 35-мм стекла дно блюда (5 х 10⁴ за блюдо) O/N в культуре клеток млекопитающих кабинета.
2. Ячейка привязки эксперимент Подготовьте LXY30-HEVNP-Cy5.5 следующие шаги 4.2-4.3. Разбавить LXY30-HEVNP-Cy5.5 0,01 мг/мл, что эквивалентно 0,188 мкм HEVNP ORF2 (см. шаг 2.2.4) в 250 мкл 0 - 1% FBS/DMEM.
   1. Подготовка образца отрицательный контроль на 0,01 мг/мл HEVNP-Cy5.5, выполнив шаг 4.3 но сопряжённых с ГСЗ-Cy5.5 краска только, (HEV-Cy5.5). Разбавить HEVNP-Cy5.5 0,01 мг/мл, что эквивалентно 0,188 мкм HEVNP ORF2 (см. шаг 2.2.4) в 250 мкл 10% FBS дополнена DMEM.
3. Вымойте клетки однажды применив 250 мкл буфера PBS 1 М, рН 7,4. Удалите в буфер PBS после стирки, сохраняя некоторые буфера в ячейку культуры блюдо.
4. Примените 250 мкл LXY30-HEVNP-Cy5.5 в 10%, что FBS дополнена DMEM или HEVNP-Cy5.5 в 10%, что FBS дополнена DMEM для культивируемых клеток рака молочной железы MDA-MB231. Щит клетки культивировали блюда от света с алюминиевой фольгой.
5. Держите клетки культивировали блюда в культуре клеток 37 ° C кабинета на 1 ч для интернализации.
6. Вымойте культивируемых клеток на льду 3 раза, 5 мин на мыть, с 250 мкл 1 М PBS, рН 7,4.
7. Исправить ячейки в 4% ПФА в 1 М PBS, рН 7,4 на 20 минут и затем смыть с 250 мкл 1 М PBS, рН 7,4.
   Примечание: Клетки теперь готовы быть imaged конфокального микроскопа. Репрезентативных данных показано на рисунке 5.

Результаты

Сродни HEV-VLP все Cys изменение растворимых икосаэдра capsids HEVNPs сформированы и не статистической обработки в растворе в ходе производства или очистки. До и после изменения одноступенчатых maleimide биотин спряжение, каждый из Cys HEVNPs были неотличимы от HEV-VLP в негативных пятно EM (<...

Обсуждение

В отличие от времени генной инженерии процедура, которая обычно занимает недели, здесь мы демонстрации простой двухэтапный и одношаговые химических спряжение процедур, которые могут быть завершены в течение 3 дней, добавления рака, ориентация лиганда и/или флуоресценции обнаружения к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger