Photoconversion одноклеточных в живых нетронутыми данио рерио

Резюме

Здесь мы представляем протокол проявить, как ячейки photoconversion достигается за счет УФ-облучения в конкретные районы, выражая флуоресцентный белок, Eos, в живых животных.

Аннотация

Животных и растительных тканей состоит из отдельных популяций клеток. Эти клетки взаимодействуют со временем для построения и поддержания тканей и может вызвать болезнь, когда нарушена. Ученые разработали умные методы расследования характеристики и естественную динамику этих клеток в неповрежденной ткани выразить флуоресцентных белков в подмножества ячеек. Однако время от времени, эксперименты требуют более выбранных визуализации ячеек в ткани, иногда на одну ячейку или населения клетки образом. Для достижения этой цели и визуализации единичных клеток внутри населенность клеток, ученые использовали одну ячейку photoconversion флуоресцентных белков. Чтобы продемонстрировать эту технику, мы покажем здесь как прямой свет УФ Eos выражая ячейку интереса к нетронутым, живущих у рыбок данио. Мы затем изображение те клетки Eos⁺ photoconverted 24 h позже определить, как они изменили в ткани. Мы описываем две техники: Одноместный клеток photoconversion и photoconversions населения ячейки. Эти методы могут использоваться для визуализации ячеек взаимодействий, клетки судьба и дифференциации и миграции клеток, делает его технику, которая применима в многочисленных биологических вопросов.

Введение

Несколько отдельных ячеек взаимодействуют для создания и поддержания сложных тканями растений и животных. Эти клетки часто вставными и трудно отличить от соседей на уровне отдельной ячейки без микроскопия высокого разрешения, которые требуют фиксации ткани. Однако, чтобы понять, как эти формы тканей, поддерживаются и стать больными, он был необходимым расследовать как сингл клеток в тканях, взаимодействующих с течением времени. В идеале эти эксперименты требуют маркировки единичных клеток в тканях неинвазивным способом без требования о фиксации. Теперь ученые разработали многочисленные методы для выполнения этой задачи^1,2,и^3,4.

Обнаружение и осуществление медузы Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) был один интересный подход, который позволил для маркировки отдельных клеток в тканях окружающей среды¹. С помощью конкретных клеток промоутеров, возможна генетически выбрать подмножество ячеек, которые помечены как¹. В качестве альтернативы вирусный индуцированных выражение гена GFP могут быть использованы для выбранного пользователем выражение гена GFP^3,4. Хотя довольно полезным, генетических опосредованной выражение гена GFP не позволяют выбранного пользователем выражение в рамках подмножества клеток в тканях; и вирусный выражение GFP, хотя и выгодно, может быть инвазивными. С появлением производных GFP и умные методы как Brainbow выразить собственный флуоресцентные белки более редко в тканях стало возможным для визуализации единичных клеток и их взаимодействия в сложных ткани^{2, 5}. Однако, эти подходы ярлык клетки случайным образом. Если нужный эксперимент требует визуализации одну ячейку или популяция клеток, определяемое экспериментатора, они таким образом ограничены. С таких экспериментов, было бы целесообразно иметь генетически выраженной флуоресцентный белок, который можно манипулировать, чтобы отличать, в одну ячейку моды, это от других флуоресцентные и не люминесцентные клеток.

Для достижения этой цели и визуализации клеточной биологии одиночных камер в сложных живых тканей, научное сообщество использует одну ячейку photoconversion собственный флуоресцентные белки^6,,78. С помощью генетически контролируемых экспрессии белка photoconvertible (то есть, eos, Каэдэ и т.д.), который переходит от зеленых красных флуоресцентных состояние при воздействии УФ (488 нм) света, мы можем выделить одну ячейку от его дневно обозначенные соседи^6,,78. Этот подход использует аппарат придает нашей Конфокальный микроскоп, который может направить свет от стека Лазерный дифракционный региона интерес. С этой техникой мы можем либо ярлык отдельные ячейки или больших популяций в форме, определяемой пользователем^9,10,11. Методика является минимально инвазивной по сравнению с одной ячейке инъекции вирусных GFP. Как доказательство концепции мы показываем, что мы можем photoconvert отдельные ячейки в пределах ганглия в периферической нервной системы и photoconvert больших популяций как клетки, расположенные на вентральной стороне спинного^{9,10, 11,12}. Затем мы можем визуализировать эти photoconverted клеточных популяций 24 часа позже, чтобы разобраться в их передвижения и дифференциация во время разработки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все исследования на животных были утверждены в Университете Нотр Дам институциональных животное уход и использование Комитета.

1. Подготовка образца данио рерио

1. Место один взрослый самец и один взрослый женский тг (кабриолет белка) в камеру спаривания в стандартные процедуры¹³. В этой рукописи используйте Tg(sox10:eos)⁹ рыбы из-за доступ, но другие трансгенных линий с photoconvertible белком может использоваться одинаково. Настройка более чем в одной палате, в случае, если рыба не укладывать. Разрешить рыбу, чтобы остаться на ночь в камере.
2. Следующим утром, Соберите яйца в чашках Петри 100 мм. Разрешить яйца созреть до 24 ч после оплодотворения (hpf) до скрининга.
3. Если животные выше были heterozygotes для трансген, экран 24 hpf блюда для Tg(sox10:eos) + эмбрионов с 488 нм источник света и GFP фильтровать наборы на рассечения микроскопа. Изолировать Tg(sox10:eos) + эмбрионов и позволяют Зрелые 48 hpf.
4. Dechorionate эмбрионы вручную с помощью иглы или пинцетом.
5. Подготовить и микроволновой 5 мл раствора точки агарозы легкоплавких 0,8%.
   1. Как только агарозы прохладный на ощупь, место 3-4 наркотизированных тг (sox10:eos) + 48 hpf рыбы в центре стекла coverslip 10 мм снизу Петри.
   2. Добавьте достаточно агарозы для покрытия поверхности coverslip, примерно в 1 мл. Использование иглы зондов устроить рыбы на их сторонах. Разрешить агарозы для закрепления обеспечить монтаж животных. Это может быть необходимо постоянно заново организовать данио рерио, до тех пор, пока агар затвердевает¹⁴. Затвердевания занимает около 2 мин.
6. После агарозы затвердевшим за 2 мин, медленно добавьте эмбриона носитель, содержащий Эстер аминобензойной кислоты 0,02% (Tricaine) чтобы блюдо до нижней поверхности агара и блюдо погружен. Это должно быть около 3 мл.

2. Микроскоп монтажа и предварительное преобразование изображений

1. Откройте конфокальный программного обеспечения и выберите окна захвата и фокус [рис. 1]. Под окном захват выберите лаборатории особенностях преобразования изображений под захват, установив раскрывающегося вкладки [рис. 1]. Здесь специфичные для лаборатории Настройка называется «Imaging рыбы.»
2. Поместите образец на конфокальный сферы и принести в фокус с помощью курс и плавная регулировка ручки.
3. Открыть окно фокус и найдите нужный регион интереса (то есть Спинной корень ганглиев).
4. Выберите c488 лазера под меню набор фильтров. Установить экспозицию до 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [рис. 2].
5. В разделе записи тип установите флажок 3D. В разделе 3D захвата выберите использовать текущую позицию и проверьте диапазон вокруг тока. В этом же разделе Установите диапазон до 35, количество самолетов до 36 и размер шага 1. Диапазон может быть увеличивается или уменьшается для размещения для глубины области изображений. Для спинного значение диапазона между 35-40 стеками обычно является достаточно [рис. 5].
6. Выберите текущее местоположение [рис. 5].
7. Нажмите кнопку Пуск в нижней части окна захвата получить изображение.

3. сотовый Photoconversion

1. Откройте конфокальный программного обеспечения и выберите окна захвата и фокус [рис. 1]. Под окном захват выберите лаборатории особенностях преобразования изображений под захват, установив раскрывающегося вкладки [рис. 1]. Здесь специфичные для лаборатории Настройка называется «Рыба удалять полный чип».
2. Выберите c488 и c541 лазера под меню набор фильтров. Если не использовать то же программное обеспечение микроскопа, найдите меню для выбора различных лазеров и выберите 488 нм и 541 нм лазеры. Установите воздействия 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [рис. 2]. Эти параметры лазера выбираются основе производить достаточно флуоресцентного сигнала не вызывая Фотообесцвечивание или токсичности. Если визуализируется токсичности или Фотообесцвечивание, уменьшите мощность лазера или воздействия.
3. Открыть окно фокус и нажмите на вкладку добавлены в окне фокус. Настройте параметры лазерного соответственно. Изменить стек мощность лазера 2 и затем нажмите кнопку Go. Изменить размер блока растр 1 и нажмите кнопку установить. Измените размер дважды на 4. Изменить линия лазера на v405 [рис. 3].
4. Откройте расширенный записать параметры в окне захвата. Выберите вкладку добавлены и изменить дважды повторений до 2. Нажмите кнопку OK [рис. 4].
5. Выберите вкладку XY в окне фокус. Дважды проверьте параметры лазерного из шага 2 в закладке добавлены [рис. 3, рис. 4]. Установите параметры лазерного photoconvert клетки интереса без photoconversion окружающих клеток.
   1. Если присутствует photoconversion смежных ячеек, уменьшите мощность лазера. Если не происходит photoconversion клеток, лазерной полномочий может быть увеличена. Оптимально установите мощность лазера photoconvert только региона интерес и не прилегающих районов.
6. Установите флажок timelapse под захват типа. Нажмите кнопку начать [Рисунок 6A].
7. После того, как откроется окно жить timelapse, выберите инструмент «круг» на верхней панели инструментов [Рисунок 7]
8. Нарисуйте круг в регионе пища ячейки. Щелкните правой кнопкой мыши обращается круг, выберите регион FRAPи ждать 3 секунды. Выделенная область должна стать диммер [рис. 8]. Нажмите кнопку остановить запись.
9. Если изображений более чем одного животного, вернитесь на вкладку XY в фокус меню и выберите позицию 2. Затем повторите шаги 4.1-4.6.
10. Чтобы преобразовать популяция клеток, следуйте протокол и лазерной параметры для действия 4.1-4.4, за исключением вместо рисования круга FRAP региона интерес, используйте инструмент «линия». Нарисуйте линию на области интереса и FRAP региона, используя те же параметры, перечисленные выше.

4. пост photoconversion изображений

1. После того как все точки photoconverted. Выберите стек лаборатории конкретных стандартных изображений, установка описана в precoversion изображений шаг 3. Это находится под захват, установив раскрывающегося вкладки в окне захвата [рис. 5].
2. Выберите c488 лазера и установить экспозицию до 300 мс, мощность до 5 лазера и активизировать до 75 [Рисунок 2].
3. Выберите c541 лазер находится в том же меню как лазер c488. Установить экспозицию до 500 мс, мощность до 10 лазера и активизировать до 75 [рис. 9].
4. В разделе записи тип установите флажок 3D. В разделе 3D захвата выберите использовать текущую позицию и проверьте диапазон вокруг тока. В этом же разделе Установите диапазон до 35, количество самолетов до 36 и размер шага 1. Номер диапазона может возрастать или уменьшаться для размещения на желаемую глубину визуализации [рис. 5].
5. Если существует несколько точек на вкладке фокус XY, выберите вариант многоточечные список в окне захвата. Если нет, выберите текущее местоположение.
6. Нажмите кнопку Пуск в нижней части окна захвата получить изображение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Photoconversion флуоресцентных белков может использоваться для обозначения отдельных клеток внутри ткани⁶. Чтобы продемонстрировать это, Tg(sox10:eos) рыбы⁹ были использованы для выражения протеина photoconvertible Eos под регулирования последовательности <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В сложных тканей различные типы клеток организовать в конкретных областях. Недавно были использованы методы для метки отдельных ячеек в этих больших ткани структур^1,2,3. Здесь мы показываем, два метода, которые аналогичным образом могут...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals			Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish	VWR	25384-302
Embryo medium			Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish	Ted Pella Inc.	14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)	Fluka analytical	A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters	Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets	3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion	405 nm laser
Slidebook software	3i
Methylene blue	Kordon