JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Легковесные флуоресценции пробирного представлен для оценки эффективности амино ацил тРНКГлу синтетаза/tRNA пар включению белков в клетках млекопитающих неканонических амино кислот (ncAAs). Описывается применение ncAAs учиться G-протеин рецепторов (GPCR), включая фото сшивки отображение привязки сайтов и bioorthogonal GPCR маркировки на живые клетки.

Аннотация

Генетическая включение неканонических аминокислот (ncAAs) через желтый остановка кодон подавления является мощный метод для установки искусственных зондов и реактивной постановление на белки непосредственно в живой клетке. Каждый ncAA включены выделенный ортогональных подавитель tRNA/амино ацил ТРНК синтетазы (ОРСЕ) пару, которая импортируется в организме хозяина. Включение эффективность различных ncAAs может значительно отличаются и неудовлетворительным в некоторых случаях. Ортогональные пар может быть улучшена путем манипулирования ОРСЕ или тРНК. Однако направленной эволюции tRNA или ОРСЕ, использование больших библиотек и методы выбора мертвых/жив не осуществимо в mammalian клетках. Здесь представлен поверхностным и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар в mammalian клетках. Assay позволяет скрининг десятков до сотен вариантов ОРСЕ/tRNA с умеренным усилием и в разумные сроки. Использование этого анализа для создания новых tRNAs, которые значительно улучшают эффективность системы ортогональных Пирролизин описан, наряду с применением ncAAs к изучению G-белка в сочетании рецепторов (GPCR), которые являются сложными объектами для ncAA мутагенез. Во-первых путем систематического включения фото сшивки ncAA по всей поверхности внеклеточного рецептора, сайтов связывания различных лигандов на нетронутыми рецептор сопоставляются непосредственно в живой клетке. Во-вторых, путем включения последнего поколения ncAAs в GPCR, сверхскоростной катализатор свободных рецепторов маркировки с флуоресцентной краской свидетельствует, который эксплуатирует bioorthogonal штамма повышен обратная Дильс ольха циклоприсоединения (SPIEDAC) на живую клетку. Как ncAAs правило может применяться к любой белок, независимо от его размера, метод имеет общий интерес для ряда приложений. Кроме того ncAA включение не требует никакого специального оборудования и легко выполняется в лабораториях стандартных биохимии.

Введение

Генетических включение химических зондов в белки это мощный метод для содействия расследованию структурных и динамических аспектов белков функции непосредственно в собственном контексте живой клетки. В настоящее время сотни неканонических аминокислот (ncAAs) оснащены наиболее разрозненные химических групп могут быть site-specifically включены в белки биосинтез1,2,3,4. Между ними, один находит Фото чувствительных ncAAs такие фото сшиватели5, Фото клетке6,,78,9 и фото переключаемый аминокислоты10, 11, аминокислоты, учитывая напряженные алкенов и алкинам бесплатно катализатор bioorthogonal химии2,12,13,14,15,16 ,17, аминокислоты, перевозящих Дансил18, кумарина9,19и21 флуорофоров продан20,и аминокислот с другими биофизических зонды как Ну как с поста поступательные изменения1,2,3,4,,2223,24,25.

Генетического кодирования ncAA включена на выделенный амино ацил тРНК синтетаза (ОРСЕ) паре родственных подавитель тРНК, который включает ncAA в ответ янтаря стоп-кодон во время регулярных рибосомных синтеза. ncAARS/tRNA пар спроектированы таким образом, чтобы быть ортогональные в организме хозяина, т.е. не кросс разговор с эндогенного парами. Методика является хорошо установленным в прокариот и эукариот хостов и легко применимые к mammalian клеток. Пар для включения ncAA в mammalian клетках основываются на трех основных систем ортогональных: тирозил системы, которая объединяет TyrRS E. coli26 с супрессор тирозил янтаря с б. stearothermophilus27 (Ec TyrRS /BstЯм пара),18,6, E. coli лейцил системы (Ecих/tRNAлеиCUA пара)28 и архей pyrrolysyl системы (PylRS/тРНК Пыль пара)3, whereby tRNAпыль природного янтаря супрессор. В общем каждый ncAA признается специализированных ncAARS. В зависимости от структуры ncAA ncAARS получается через направленной эволюции TyrRS, их или PylRS, хотя некоторые синтетаз может принимать более одного ncAA.

Ортогональные пара импортируется в клетки, просто используя вектор плазмиды. Наиболее распространенных и эффективных плазмид являются bicistronic и кодирования для синтетаза и тРНК, образуя ортогональных пара29. Второй плазмида кодировки для белка процентные янтаря кодон на сайте, предназначенные для модификации совместно transfected. NcAA просто добавляется к среднего роста клеток. Однако различные специализированные группы часто используют различные варианты конструкций плазмида даже для включения же ncAA. Конструкции отличаются расположения генов в вектор, тип синтетаза, использование кодон в синтетаза гена, Чистая Промоутер, вариант тРНК и количество кассет выражений тРНКГлу. Кроме того включение эффективность различных ncAAs могут сильно варьироваться из-за различных каталитической эффективности различных синтетаз, качество tRNA и другие факторы30. Таким образом важно иметь под рукой быстрый и надежный метод для оценки эффективности ортогональных пары, как выбрать наиболее подходящую систему для нужного приложения, так и для выполнения некоторых шагов оптимизации, которые улучшают общее выражение протеина урожайность.

Мы создали простой и надежной основе флуоресценции пробирного для оценки эффективности ортогональных пар29 (рис. 1). В assay клетки совместно transfected с кодировкой плазмиду для ортогональных пары, вместе с bicistronic репортер плазмида кодирования для зеленого флуоресцентного белка, принимая янтаря стоп-кодон в либеральной позиции (тегEGFP) и mCherry ген. Красный и зеленый флуоресценции целом-lysates клетки считываются в отдельных каналов на пластины читателя в 96-луночных пластине. Интенсивность флуоресценции зеленый напрямую коррелирует с эффективности работы автожелтого подавления, тогда как интенсивность флуоресценции Красного дает прямую оценку размера измеряемых образца и эффективность трансфекции. В отношении подобных анализов на основе флуоресценции вспомогательной ячейки, сортируя (FACS) зачитывает31,32, assay дает немедленное и всеобъемлющей оценки экспрессии белков клеточных населения, которая больше Представитель обычно экспериментальных условиях и предлагает упростить сбор и обработка данных со стандартным программным обеспечением. В целом основным преимуществом assay является, что от среднего до большого числа проб могут быть проанализированы параллельно. Используя этот assay, мы экранированный рационально разработан библиотека подавитель tRNAs для повышения эффективности Pyl ортогональные системы30. Эта работа описывает экспериментальный протокол для выполнения этот assay и показать примеры его применения, включая оптимизацию ортогональных пары для включения фото сшивки ncAA p-azido-L-фенилаланин (Ази) и сравнение Включение эффективность различных аминокислот (рис. 2).

За последние годы ncAA инструменты доказали очень мощный для изучения структурных и функциональных аспектов G-белка в сочетании рецепторов (GPCR)33,34,35,,3637 , 38. в организме человека, GPCR образуют большой семьи мембранных рецепторов (800 членов) и представляют собой главных мишеней для лекарственных средств. Прямые структурных характеристик GPCR еще сложной и весьма взаимодополняющими биохимические методы необходимы для их расследования. Мы первыми начали использовать Фото сшивки ncAAs карта GPCR поверхностей и обнаружить лигандом привязки карманы34. Используя наши оптимизированные системы для включения Ази, мы систематически учитываются Azi на протяжении всей juxtamembrane области GPCR непосредственно в живых клетках млекопитающих. После УФ-облучения Ази образует Высокореактивная nitrene видов, которые ковалентно захватывает соседних молекул. Когда лигандом добавляется к системе, Ази служит близость зонд выявить, какие позиции рецептора близко связанных лигандов. Таким образом режим привязки гормон нейропептида Urocortin I (Ucn1) на класс B GPCR АКТГ выпуская фактор рецептор типа 1 (CRF1R)33 был впервые открыт. В последнее время мы раскрыли собственный привязки шаблонов агонисты и антагонисты на же рецептора38. Аналогичный подход применяется другими раскрыть orthosteric и аллостерический привязки сайтов других пептидов и малых молекул лигандов на других GPCR39,40,,4142. Эта рукопись описывает экспериментальный протокол, применяется в нашей лаборатории для фото сшивки сопоставления GPCR поверхностей. Метод относительно быстро, просто и не требует никакого специального оборудования, так что это применимо в лабораториях стандартных биохимии. Важно отметить, что этот подход обеспечивает ценный инструмент не только для идентификации сайтов связывания лиганд, где 3D структурных данных не хватает, но и дополнить существующие в vitro данные с информацией от полностью post-translationally модифицированных рецепторов в физиологической среды живой клетки.

Недавнее развитие Роман ncAAs подшипника на стороне цепочки химических групп подходит для сверхбыстрой бесплатно катализатор bioorthogonal химии открыло возможность установки последнего поколения флуорофоров для супер-резолюции изображений в белки непосредственно на живой клетки2,43. Такие химические анкеры включают напряженными cyclooctyne в SCOK14, nonyne бицикло [6.1.0] в BCNK12,17и транс cyclooctenes в ТШО * K13,15,17 среди других ncAAs укрывательство норборненом16,17,44 или cyclopropene45,группу в составе46 . Громоздкие ncAAs bioorthogonal химии, включаются в вариант PylRS, обычно обозначается как PylRSAF (указанием мутации Y271A и Y349F в . м. barkeri PylRS), а также других специальных развивались ncAARSs17 , 44. анкер bioorthogonal реагируют с тетразина реагенты47 через обратные электрон спрос Дильса-Альдера циклоприсоединения давать высокие урожаи маркировки в течение нескольких минут43,48. Однако применение этого мощного подхода к этикетке GPCR была сложной из-за низкой общей эффективности системы ортогональных ncAA включение. С помощью нашей усовершенствованной системы пыль, мы недавно продемонстрировали высокодоходные включение таких аминокислот в GPCR и сверхскоростной GPCR маркировки на поверхности живой клетки млекопитающих30. Приклеенные этикетку рецепторы были до сих пор функциональна, как они физиологически внутреннюю активировав с агонистом рецепторов. Экспериментальный протокол для включения bioorthogonal якоря в GPCR и следующие маркировки шаги описаны здесь. Оснащение GPCR небольшие яркие флуорофоров является первый основной шаг к изучению GPCR структурной динамики в живой клетке через микроскопии передовых методов.

протокол

1. на основе флуоресценции скрининг эффективности включения (рис. 1)

  1. Сохранить HEK293 клеток в среде Дульбекко изменение орла (DMEM; высокие глюкоза, 4 мм глутамина, пируват) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС), пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2.
  2. Семян за день до transfection клетки.
    1. Отсоедините клетки для 5 минут при 37 ° C в 0,05%, которые трипсина/PBS с 0,5 мм ЭДТА. Используете 1 мл трипсина/ЭДТА 10 см блюдо. Утоляйте 10 томах полного среднего и Ресуспензируйте клетки, закупорить. Подсчитать количество клеток в суспензии с помощью Горяева49.
    2. Семя 6.0 x 105 HEK293 клеток на хорошо 6-ну плит в полный рост среднего 2 мл. Подготовьте столько скважин как количество образцов и два дополнительных скважин для EGFP одичал тип и макет transfected образец, соответственно.
  3. Контроль слияния (площадь, занимаемая клетки) под микроскопом. Transfect клетки при впадении ~ 70% с помощью реагента полиэтиленимина (PEI).
    1. 1 час до трансфекции, добавьте соответствующее количество свежеприготовленный раствор ncAA для всех скважин для конечной концентрации ncAA 0,25-0,5 мм. Добавьте ncAA всех скважин, включая положительный контроль одичал тип и макет transfected клеток, чтобы предотвратить различия в флуоресценции сигналы, которые могут быть вызваны эффекты ncAA на клеточного роста.
      Примечание: Подготовить акций решения, распустить ncAA на 0,1-0,5 М с помощью 0,2-0,5 М NaOH. Однако некоторые ncAAs может потребоваться начальный солюбилизация в ДМСО и/или нейтрализация четыре тома 1 м HEPES (рН 7,4) перед использованием. Обычно производитель рекомендует Протокол подготовить раствор.
    2. В пробки microcentrifuge смешайте 1 мкг плазмида ДНК кодирования для ncAARS/tRNA пары, чтобы быть протестированы с 1 мкг репортер плазмидной ДНК (183TAG- mCherry pcDNA3.0-EGFP). В отдельных труб Подготовьте идентичные трансфекции, используя ссылку EGFP одичал тип и макет transfection.
      Примечание: Количество копий tRNA кассеты, встроенных в плазмиду кодировку для пары ncAARS/tRNA зависит от приложения. Чтобы облегчить клонирование, 1 tRNA копии рекомендуется при отборе различных tRNAs, тогда как 4 копии рекомендуется (хотя и не обязательно) когда тестирования различных ncAARS или включение различных ncAAs же ортогональных парой.
    3. Каждая трубка содержащие ДНК добавьте 100 мкл лактата буферизации физраствора (LBS), содержащий Лактат натрия 20 мм на pH 4.0 и 150 мм NaCl. Перемешать кратко.
    4. В каждую пробирку содержащую ДНК в фунтов мкл 6 1 мкг/мкл PEI в фунтов (соотношение PEI/ДНК = 3/1 Вт/w) и вихрь немедленно. Инкубируйте на RT для 10-15 мин.
    5. Возьмите 400 мкл клеток средних от каждой скважины и добавить его в смесь ДНК-Пей для нейтрализации pH. Капать ДНК смесь на клетки.
      Примечание: DMEM обычно содержит фенола Красного как индикатор пэ-аша. Во время шага нейтрализации цвет смеси, добавил в трубке будет меняться от желтого (кислой) красный (нейтральный). Хотя формирование комплексов ДНК в фунтов на кислой рН дает высокие урожаи трансфекции50, комплексов ДНК-Пей в качестве альтернативы может быть сформирован непосредственно на рН 7,4 (например в сыворотке бесплатно DMEM). Если с помощью DMEM формы ДНК комплексы, пропустите шаг нейтрализации 1.3.5. В любом случае важно, что не сыворотки присутствует в смеси при формировании комплексы.
  4. Урожай после transfection клетки 48 ч.
    1. Аспирационная среднего и промойте клетки один раз с 2 мл подогретым PBS (37 ° C). 800 мкл PBS, дополнена 0,5 мм ЭДТА и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 37 ° C. Отсоединение и приостановить клетки, закупорить вверх и вниз.
    2. Перенесите суспензию клеток в 1,5 мл пробирки, содержащие 200 мкл PBS, дополнена 5 мм MgCl2.
    3. Центрифуга для 2 мин на 800 x g и удалить супернатант.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. В этом случае флэш замораживание окатышей в жидкости N2 и хранить при температуре-80 ° C на срок до одного месяца. Всегда надевайте очки защита глаз.
  5. Добавить 100 мкл буфера lysis трис (50 мм трис-HCl рН 8,0, 150 мм NaCl, 1% X-100 Тритон, 1 мм ЭДТА и свежезаваренным добавлен PMSF) клеток гранул и инкубировать на льду за 30 мин. Для облегчения лизиса, вихревой каждые 5 мин.
  6. Спин вниз ячейки мусор за 10 мин при 4 ° C и g 14.000 x и перевести 90 мкл супернатант в черный 96-луночных пластины. Мера EGFP и mCherry с помощью читатель пластины оснащен модулем флуоресценции флуоресценции.
    Примечание: Используйте соответствующие фильтры возбуждения и выбросов для EGFP (λabs: 488 нм; λЭм: 509 Нм) и mCherry (λabs: 588 Нм; λЭм: 611 Нм). Измеренные значения EGFP охватит в диапазоне от минимального значения, полученные от МОК transfected клеток и максимальное значение, которое обычно получается из EGFP одичал типа. Позаботьтесь о настройке окна правильного измерения в документе.
  7. Эффективность ncAA включение рассчитывается как соотношение между флуоресценции образца и флуоресценции, полученные из выражения EGFP одичал типа. Все значения нормализованы в mCherry флуоресценции.
    figure-protocol-5478

2. генетические включения ncAAs GPCR для фото сшивки, сопоставление из взаимодействия лиганд-ХВГФ (рис. 3)

  1. Сохранить HEK293T клеток в среде DMEM дополнена 10% (v/v) FBS, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2.
  2. Клетки семян за день до transfection.
    1. Отсоедините клетки для 5 минут при 37 ° C в 0,05%, которые трипсина/PBS с 0,5 мм ЭДТА. Используете 1 мл трипсина/ЭДТА 10 см блюдо. Утоляйте 10 томах полного среднего и Ресуспензируйте клетки, закупорить вверх и вниз. Подсчитать количество клеток в суспензии с помощью Горяева49.
    2. Семя 5.0 x 105 293T клеток на скважину в полный рост среднего 2 мл в 6-ну пластины. Для каждой позиции быть проверены Подготовьте 1 хорошо за лигандом плюс один колодец для привязки элемента управления33,38. Дополнительные хорошо чтобы transfected с рецепторами одичал тип (wt) могут быть включены проверить уровень экспрессии мутант.
  3. На следующий день после, контролировать слияния (площадь, занимаемая клетки) под микроскопом. Transfect клетки при впадении ~ 70% с помощью пей.
    1. 1 час до трансфекции, добавьте Azi всех скважин до конечной концентрации 0,5 мм.
      1. Подготовьте 0,5 М Стоковый раствор Ази. За 6-ну тарелку, взвесить 1.2 мг Ази в трубку и растворить его в 15 мкл 0.5 M NaOH. Разбавить раствор в 1,2 мл полного среднего и 200 мкл смеси для каждой скважины.
        Примечание: Подготовьте свежие Стоковый раствор Azi для каждого эксперимента. Азид остаток имеет короткий период полураспада в водных растворах, особенно на базовых pH, и AziRS включает в себя нетронутыми, но и деградированных формы.
    2. Transfect на общую сумму 2 мкг ДНК на хорошо: 1 мкг плазмида кодирования для флага тегами GPCR, принимая кодоном тег в нужное положение и 1 мкг плазмида кодировки для ортогональных пары, посвященный Azi (E2AziRS51 и 4 копии Когнаты подавитель tRNA Bstям)33,38.
      Примечание: При включении wt сравнения для проверки уровней выражение, transfect меньшее количество плазмидной ДНК для wt рецептора. В зависимости от GPCR, 0,2-0,5 мкг плазмида кодирования wt рецептор доходность аналогичных уровнях как 1,0 мкг мутант плазмиды. Transfect же количество ДНК на всех скважинах, заполнив недостающие ДНК с макет (например пустой вектор).
    3. Действуйте, как описано в 1.3.3-1.3.5.
    4. 48 ч после трансфекции, продолжить либо с шаг 2.4 для фото сшивки лигандами или перейдите к шагу 2.5 для прямого сбора и анализа для проверки экспрессии рецепторов.
  4. Фото сшивки лиганд.
    1. Подготовка 1000 x лигандом Стоковый раствор. Растворите пептидных лигандов в концентрации 100 мкм в ДМСО.
      Примечание: Лиганд концентрация зависит от KD взаимодействие лиганд GPCR Константа диссоциации. Конечная концентрация 100 x KD рекомендуется. Если пептидных лигандов соль trifluoroacetic кислоты (ТФК), рассмотрим вес TFA при расчете молекулярная масса (1 x TFA за основные аминокислоты в пептида). Кроме того считают, что в целом гигроскопических пептиды. Избегать повторного замораживания порошковых пептида и никогда не открывайте контейнер пептид, до тех пор, пока она не достигла комнатной температуре.
    2. Разбавить раствор 1:1,000 лиганд в буфере привязки, состоящие из 0,1% BSA, 0,01% Тритон-X 100, 5 мм MgCl2 в HEPES диссоциации буфера (HDB), содержащий 12,5 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES)-HCl рН 7,4, 140 мм NaCl и 5 мм KCl. Подготовка 1 мл на Ази-GPCR мутант. Замените средой клеток с 1 мл раствора лиганда. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
      Примечание: Отрегулируйте время инкубации для конкретных GPCR, приходится лигандом кинетики и рецептор интернализации. Продлевая время инкубации не повысить урожайность сшивки.
    3. Облучить образцы для 20 мин в УФ сшивателя на 365 Нм с 5 x 8 Вт трубки и ~ 5 см расстояние до клетки. Отсоединить клетки, закупорить и перенести их в 1,5 мл реакции. Пелле клетки на 3 мин на 800 x g и удалить супернатант.
    4. Растворите таблетку ингибитора протеазы (PI) коктейль в 1 мл 25 мм ЭДТА/H2O сделать Стоковый раствор 50 x. Аликвота PI складе решения и хранить его при-20 ° C. Разбавить 50 x запас 1:25 в HDB и Ресуспензируйте клетки окатышей в 50 мкл 2 х пи в HDB. Флэш замораживание клеток в жидкости N2.
      Примечание: Носите очки защита глаз. На данный момент образцы могут храниться при температуре-80 ° C на срок до одного месяца. Перейдите к шагу 2.6.
  5. Урожай прямой клеток.
    1. Аспирационная среды. Мкл 800 0,5 мм ЭДТА в HDB. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT или на льду.
    2. Отсоедините клетки, закупорить вверх и вниз и перевести их в 1,5 мл реакции. Добавьте 200 мкл 5 мм MgCl2 в HDB. Пелле клетки на 3 мин на 800 x g и удалить супернатант.
    3. Ресуспензируйте клетки окатышей в 50 мкл 2 х пи в HDB и вспышки заморозить в жидкости N2. Носите очки защита глаз.
      Примечание: На данный момент образцы могут храниться при температуре-80 ° C до 1 месяца.
  6. Лизис клеток.
    1. Оттепель в клетки в водяной бане при 37 ° C за 30-45 s и вихревой кратко. Теперь держите холодной образцов. Пелле мембраны на 2500 x g и 4 ° C на 10 мин отбросить супернатанта, который содержит основную часть цитозольной белков.
    2. Ресуспензируйте гранулы 50 мкл HEPES литического буфера, содержащий 50 мм HEPES-HCl рН 7,5, 150 мм NaCl, 10% глицерина, 1% тритон X-100, 1,5 мм MgCl2, 1 мм EGTA, 1 мм DTT и свежезаваренным добавлены 2 х пи коктейль. Тщательно перемешать. Лизируйте клетки 30 мин на льду и вихревой каждые 5 мин.
    3. Спин вниз ячейки мусор за 10 мин в 14.000 x g и 4 ° C. Немедленно перевести супернатант в трубу свежие реакции.
      Примечание: Продолжите анализ сразу. Лизатов может храниться при температуре-20 ° C, однако, каждый цикл замораживания оттаивания ухудшает качество результатов.
  7. Западный анализ помаркой.
    1. Чтобы подготовить образец, взять 3-5 мкл lysate и заполнить его до 7 мкл с H2O. добавить 2 мкл 1 М DTT и 4 x 3 мкл пример буфер, содержащий 63 мм трис-HCl рН 6,8, SDS 2%, 10% глицерина и 0,04% bromphenol синий. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
    2. Когда ХВГФ гликозилированного и слабый или смазывают полосы являются проблемой, образцы deglycosylate с PNGase F для увеличения интенсивности сигнала и точить полос. Использование 3-5 мкл lysate и deglycosylate в общем объеме 10 мкл после поставщика протокола. Мкл 3 4 x буфер образца.
      Примечание: Мембранные белки часто являются гликозилированного в нескольких сайтов и государства, которая ухудшает качество резолюции в анализе SDS-PAGE. Однако делать не deglycosylate образцы для анализа выражения уровня мутантов Ази-GPCR, с использованием антител анти флаг, потому что он имеет отношение к оценить часть полностью гликозилированного, Зрелые рецептором на поверхности клетки.
    3. Разрешить образцы через стандартный SDS-PAGE и промокните передачи белки PVDF мембрану.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Акриламид нейротоксическое. Надевайте перчатки и защитные очки.
    4. Блокировать мембрана для 1 h на RT или на ночь при 4 ° C в 5% обезжиренное молоко в TBS-T, содержащий 20 мм трис-HCl рН 7,4, 0,15 М NaCl и 0.1% 20 анимации.
    5. Зонд мембраны с антитела анти лигандом следуют вторичное антитело проспряганное ПХ. В период между промыть TBS-T. Чтобы определить уровень экспрессии Ази-GPCR, зонд мембраны с коммерческой HRP антитела (см. Таблицу материалы).
    6. Выполните увеличенная хемолюминесценция (ЭСЛ) реакции с помощью домашнего ECL реагента и обнаружить сигналы за 5 мин в темноте.

3. Сверхбыстрая Bioorthogonal маркировки GPCR на живой клетки млекопитающих

Примечание: Протокол оптимизирован для 4-ну патрон coverslips (хорошо площадь = 2,2 см2). Для различных размеров хорошо протокол должен быть расширены соответственно.

  1. Поверхность покрытия скольжениях микроскопа. Осуществляют всю процедуру под капотом стерильные.
    1. Подготовить поли D-лизин гидробромида (MW = 500-550 кДа) раствор (PDL) в концентрации 1 мг/мл в 50 мм Борат буфере (рН 8,5). Хранить при 4 ° C на срок до 6 месяцев. Не замораживать.
    2. Разбавить раствор 1:40 PDL в стерильных ультра-чистой воде до конечной концентрации 25 мкг/мл (рабочий раствор), а затем фильтр решение через 0,22 мкм стерильным фильтром.
      Примечание: Рабочий раствор может храниться при температуре 4 ° C на срок до 3 месяцев.
    3. Полностью охватывают в нижней части каждой скважины микроскопии слайд с 500 мкл рабочего раствора PDL. Проинкубируйте втечение 20 мин в RT и аспирационная PDL рабочего раствора.
      Примечание: PDL рабочего раствора может использоваться до трех раз. Если решение необходимо повторно использовать, передавать используемое решение с покрытием слайды на свежие стерильную пробирку и этикетке трубки соответственно. Никогда не смешивайте рециркулированных решение с свежий раствор.
    4. Промойте каждый хорошо 3 x с ~ 700 мкл стерильные ультра-чистой водой и высушить для по крайней мере 1 час.
      Примечание: Это очень важно Промыть лунки точно, как остатки раствора PDL токсичны для клеток. Покрытые слайды могут быть использованы сразу для микроскопии или хранящиеся на срок до одной недели при 4 ° C.
  2. Сохранить HEK293T клеток в среде DMEM дополнена 10% (v/v) FBS, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO2.
  3. Клетки семян за день до transfection.
    1. Отсоедините клетки для 5 минут при 37 ° C в 0,05%, которые трипсина/PBS с 0,5 мм ЭДТА. Используете 1 мл трипсина/ЭДТА 10 см блюдо. Утоляйте 10 томах полного среднего и Ресуспензируйте клетки, закупорить. Подсчитать количество клеток в суспензии с помощью Горяева49.
    2. Семя 1.0 x 105 HEK293T клеток на колодец (площадь 2.2 см²) в 600 мкл красителя свободной полный DMEM.
      Примечание: Для визуализации целей, это очень удобно для работы с самого начала в среде, которая не содержит каких-либо красителей. Краситель бесплатные DMEM формулировки являются коммерчески доступными.
  4. Контроль слияния (площадь, занимаемая клетки) под микроскопом и transfect при впадении ~ 70% с помощью реагент на основе липидов transfection клетки.
    1. 1 час до трансфекции, подготовить свежая 100 мм Стоковый раствор ТШО * K 0,2 М NaOH и 15% (v/v) ДМСО.
    2. В Ну, смешать 3 мкл TCO * K Стоковый раствор с 12 мкл 1 М HEPES рН 7,4. Аккуратно добавить решение в колодцы для окончательного TCO * K концентрация 0,5 мм.
    3. Подготовьте общее количество 500 нг ДНК в колодец. В пробки microcentrifuge, разбавить 200 нг pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 нг плазмида кодировку для MbPylRSAF/tRNAпыль ортогональных пара (четыре кассеты tRNAM15) и 100 нг pcDNA3.1_Arrestin3 плазмида в 50 мкл среднего (краситель бесплатно, сыворотка бесплатно, антибиотик бесплатно).
      Примечание: В общем, Сопредседатель transfection Arrestin нет необходимости соблюдать GPCR интернализации. Однако, совместно transfecting Arrestin3 ускоряет интернализации CRF1R, что очень удобно при анализе интернализации многих мутантов.
    4. Разбавить 1,25 мкл Реагента липидных трансфекции (2,5 мкл на 1 мкг ДНК) в среде 50 мкл (краситель бесплатно, сыворотка бесплатно, антибиотик бесплатно) и добавить решение в смеси ДНК. Вихрь немедленно и инкубировать 5-10 мин на RT. Add ДНК липидных комплексов в клетки.
      Примечание: По нашему опыту морфологию клеток transfected с помощью трансфекции липидных выглядит более физиологичен по сравнению с которые клеток transfected с пей. Как ПЭЙ дает более высокую эффективность трансфекции, пей предпочтение следует течению приложений, как Западная помарка, в то время как на основе липидов трансфекции является лучшим выбором для transfect клеток для визуализации экспериментов.
  5. 24 ч после трансфекции, метка рецепторов с флуоресцентными красителями.
    1. Подготовить 0,5 мм краска тетразина раствор в ДМСО и 10 мг/мл ДНК, окрашивание Стоковый раствор красителя в ультра-чистой H2O.
    2. Перевести 100 мкл среднего от каждой скважины в 1,5 мл реакции. Добавление 1.8 мкл Стоковый раствор красителя тетразина и 0,3 мкл ДНК, окрашивание Стоковый раствор красителя. Перевести носитель содержит красители обратно в скважину и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
      Примечание: Тетразина оранжевый Люминесцентная краска имеет конечная концентрация 1,5 мкм.
    3. Аспирационная среднего и осторожно промойте клетки дважды с PBS для удаления избыточного красителя. 600 мкл полный краска, свободный рост среднего разогретую до 37 ° C.
  6. Люминесцентная микроскопия и рецепторов интернализации.
    1. Визуализировать помечены рецепторов до 63 x (или аналогичный) масштаб с помощью фильтров для GFP (λabs: 488 нм; λЭм: 509 Нм), краситель оранжево люминесцентные (λabs: 550 Нм; λЭм: 570 Нм) и ДНК, окрашивание краситель (λ АБС: 350 Нм; ΛЭм: 461 Нм). Сделайте снимок с каждым фильтром до активации рецептора.
    2. Содействие интернализации рецепторов, используя 200 Нм Ucn1.
      1. Подготовка 1000 Стоковый раствор x Ucn1 200 мкм в ДМСО.
        Примечание: В зависимости от растворимости пептида вы может быть в состоянии подготовить запас в чистой воде или буфера.
      2. Перевести 100 мкл среднего из колодца в 1,5 мл реакции и 0,6 мкл пептид агонист Стоковый раствор. Передачи средних обратно в скважину.
      3. Наблюдать за интернализации под микроскопом. Возьмите фотографии после явно обнаруживаемая возникновение интернализации (10-15 мин до часа, в зависимости от рецепторов и Гиперэкспрессия Arrestins) с помощью фильтров, упомянутых ранее.

Результаты

Наброски флуоресценции assay изображен на рисунке 1. В трех приложениях используется assay. В первую очередь проверяются несколько вариантов tRNA для включения Lys(Boc) пыль ортогональных парой. Lys(Boc) это аминокислота труднодоступных похож на пыль. Как пыль не яв?...

Обсуждение

Протокол описывает простой и надежный анализа для оценки эффективности ортогональных пар для включения ncAAs в белки, выраженные в mammalian клетках. Главное преимущество этого метода в отношении широко используемых анализов на основе СУИМ является, что она позволяет одновременной подготов...

Раскрытие информации

Авторы имеют конфликты не объявить.

Благодарности

Эта работа была основана на Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) под гранты CO822/2-1 (Эмми Нётер программы) и CO822/3-1-I.C.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

Ссылки

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134Non ncAAtRNAbioorthogonal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены