JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем собой протокол для сердечной специфичные генные манипуляции в мышах. Под наркозом сердца мыши были экстернализации через четвертое межреберное пространство. Впоследствии аденовирусы, которую кодирования конкретные гены вводили с помощью шприца в миокарде, следуют белка выражение измерения через изображений в естественных условиях и западной помарки анализа.

Аннотация

Генные манипуляции непосредственно в самом сердце существенно усиливать расследование Патомеханизмы болезни сердца и их терапевтический потенциал. В естественных условиях сердечной конкретных генов доставки обычно достигается системного или местной доставки. Системные инъекции через хвост Вены легко и эффективно в манипулировании экспрессии генов сердца с помощью рекомбинантной аденоассоциированный вирус 9 (AAV9). Однако этот метод требует относительно большое количество вектора для эффективной передачи и может привести к трансдукции гена nontarget орган. Здесь мы опишем простой, эффективный и экономии времени метод intramyocardial инъекции в естественных условиях сердечной специфичные генные манипуляции в мышах. Под анестезией (без вентиляции) грудные мышцы major и minor тупо были расчленены, и сердце мыши быстро был разоблачен ручной экстернализации через небольшой разрез на четвертый межреберное пространство. Впоследствии аденовирус, кодирование Люцифераза (Люк) и рецептора витамина D (VDR) или шпильки короткие РНК (индуцируемый) ориентации VDR, был введен с помощью шприца Гамильтон в миокард. Последующие в vivo изображений продемонстрировал, что что Люцифераза был успешно гиперэкспрессия непосредственно в самом сердце. Кроме того Западный анализ помаркой подтвердил успешные гиперэкспрессия или глушителей из VDR в самом сердце мыши. Как только освоил, этот метод может использоваться для манипулирования генов, а также инъекции клеток или других материалов, таких как nanogels в самом сердце мыши.

Введение

Сердечная болезнь является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире1,2. Отсутствие эффективных терапевтических стратегий для жизни болезней сердца, включая инфаркт миокарда и сердечной недостаточности привлекает интенсивное изучение базовых Патомеханизмы и выявление новых терапевтических возможностей3. Для этих научных изысканий сердечной специфичные генные манипуляции является широко используемым4,5. Сердца генные манипуляции и сгруппированы регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) и может быть достигнуто путем изменения генома используя активатор как эффекторных нуклеиназы мощный транскрипции (TALEN) / ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) средства, или Поставка внематочная генетических материалов (например, вирус векторы нося генов, кодирующих белки интерес)6. Хотя изменения генома позволяет точные и пространственно-временных изменений в жизни мышей, он по-прежнему длительным и трудоемким практика6. Кроме того сердечной специфичные генные манипуляции вирус вектор или малые вмешательства РНК (siRNA) комплексная поставка, регулярно выполняется6.

Доставка вектор вируса в сердце взрослого мыши достигается примерно две стратегии: системный или местных инъекций. Системные инъекции кардиотропных серотипа AAVs например AAV9 неинвазивный сердечной определенного гена манипуляций7. Однако этот метод требует относительно высокие количества вектора, необходимых для эффективного трансдукция и экспрессии генов и может привести к значительным трансдукции nontarget органов, таких как мышц и печени7. Местные вирусом инъекций достигается путем инъекций intramyocardial или интракоронарой доставки7. Интракоронарой доставки приводит к более равномерное распределение вируса в сердце, по сравнению с intramyocardial инъекции. Однако недостатки этой техники являются быстрое промывают вирусных векторов для кровообращения и трансдукция nontarget органов8, и его требования устройства для измерения давления во время операции. Напротив intramyocardial инъекции позволяет лучше вирус удержания в миокарде, а также конкретный сайт доставки, но не равномерно распределять вирусных векторов7. Для мелких животных интракоронарой доставка технически трудно выполнить, в то время как системный AAV9 инъекции и intramyocardial инъекции являются более широко практикуется4,5,7. Хотя легко для выполнения системных инъекции, обычных intramyocardial инъекции требует искусственной вентиляции легких и торакотомии, причиняет ущерб растяжение тканей и занимает много времени.

В настоящем докладе мы описали легко, экономия времени и весьма эффективный метод для инъекций intramyocardial. Аденовирусы кодирования Люцифераза и VDR или ориентации VDR, индуцируемый вводили манипулировать экспрессии генов сердца. Как только освоил, этот метод может использоваться для манипулирования генов, а также инъекции клеток или других материалов в самом сердце мыши.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены согласно национальных институтов здравоохранения руководящих принципов в отношении использования лабораторных животных и были утверждены Комитетом по этике животных Института. Самцов мышей C57BL/6J (в возрасте 8-10 недель) были использованы для всех экспериментов. Мышей были размещены бесплатно возбудителя условиях при 24 ° C ± 4 ° C, под свет/темно цикл 12-h, со свободным доступом к воде и пище.

1. Приготовление раствора аденовирус

  1. По прибытии решения очищенного аденовирус Сохраните решение в морозильной камере-80 ° С.
    Примечание: Аденовирус инъекции была исполнена в жизнеспособные мышей. Для обеспечения стерильности вектора аденовирус, аденовирус (кодирования Люцифераза, VDR или индуцируемый ориентации VDR) были подготовлены и очищенного коммерчески9,10.
  2. В день операции взять решение очищенного аденовирус (3 x 1010 доска формируя единиц [pfu] / мл) из морозильной камеры-80 ° C и разморозить аденовирус вектор решения на льду.
  3. Наденьте маску, стерильные перчатки и стерильные платье.
  4. Подготовка 50 мкл Гамильтон шприц, которой подверглись стерилизации за день до операции.
    Примечание: Для стерилизации, шприц Гамильтон был завернутый в марлю и помещены в стерилизатор высокой температуры/высокого давления. Был выбран режим «Стерилизации для тела» и стерилизации была начата, нажав на кнопку «Пуск».
  5. После полного оттаивания решения очищенного аденовирус, спрей трубка, содержащая аденовирус решение с 75% этанола и переместить аденовирус решение в Ламинарный шкаф стерильные.
  6. В ламинарный поток стерильного капот аспирационная 50 мкл аденовирус решения с помощью Гамильтон шприц без иглы, следуют вложения иглой 30 G Гамильтон шприца.
  7. Возьмите шприц с иглой 30 G вверх и аккуратно вставьте поршень шприца до тех пор, пока игла заполняется раствором аденовирус (подтверждается появление первых капель раствора из кончик иглы).
    Примечание: Это занимает около 45 мкл раствора для заполнения иглой 30 G, так что теперь решения почти не виден в шприц.
  8. Используйте выше подготовленный шприц для тщательно аспирационная еще 30 мкл аденовирус решение и место слабо рисуется шприц на льду для последующего использования.

2. анестезия и оперативной подготовки

  1. Добавить 20 мл изофлюрановая в изофлюрановая испарителем и подключите изофлюрановая Испаритель танк кислород.
  2. Откройте клапан и дайте кислорода поток от кислородного бака изофлюрановая испарителем. Поддерживать заданную скорость потока кислорода в 2 Л/мин через монитор потока кислорода в изофлюрановая испарителем.
  3. Побудить анестезии мыши с 4% изофлюрановая в 100% кислорода (2 Л/мин) 2 мин в клетке пластиковые, подключенных к изофлюрановая испарителем.
  4. Взять наркотизированных мыши из пластиковых клетки и закрепите его на пластиковой платформе в лежачем положении в стерильных Ламинарный шкаф и поддержания анестезии с 2% изофлюрановая в 100% кислорода (2 Л/мин) через носовой конус.
  5. Подтвердите адекватной анестезии, отсутствие ответа щепотку мыс.
  6. Применять Стерильные глазные крем для каждого глаза для защиты роговицы от высыхания.
  7. Бритье груди и верхней части живота. Применить коммерчески доступных депиляционный крем на бритые сайт, за 1 мин удалить для удаления волос крем и оставшихся меха с мокрой сетки.
  8. Стерилизуйте хирургические сайта (левая нижняя часть груди) с 3 скрабы на основе йода хлоргексидина антисептиком (например, entoiodine). Обложка хирургической сайта с стерильных пелерина.

3. Intramyocardial инъекции аденовирус в сердце мыши

  1. Снять перчатки и положить на пару новых стерильных перчаток.
  2. Стерилизовать щипцы, микро комаров кровоостанавливающий, хирургические ножницы, и иглодержатель за день до операции в высокой температуры/высокого давления стерилизатор (см. Примечание Шаг 1.4).
  3. Сделайте 0,5 см разрез вдоль линии, соединяющей мечевидный и подмышечной впадине. Тупо вскрыть пектораль основных и грудные мышцы мелкие с щипцами и кровоостанавливающий микро комаров.
  4. Разоблачить межреберное пространство путем втягивания пектораль крупных и мелких грудные мышцы. Пробить и открыть четвертый межреберное пространство (или максимально межреберные пространства путем наблюдения) с микро комаров кровоостанавливающий.
  5. Нажмите сердца к разрез воплощать сердце с указательный палец руки недоминирующих, осторожно нажав против с правой стороны грудной стенки.
  6. Аккуратно закрепите externalized сердце с указательный палец и большой палец руки недоминирующих.
  7. В общей сложности 30 мкл аденовирус решения придать миокарда левого желудочка в трех местах (брюшной и спинной боковой стенки левого желудочка) через шприц Гамильтон, наполненный аденовирус (рис. 1 c) с доминирующей рукой.
  8. После завершения инъекций немедленно поместите сердце обратно в внутригрудного пространство.
  9. Вручную эвакуации воздуха в внутригрудного пространстве, осторожно нажав грудной стенки к сайт разрез кожи.
    Примечание: Успешной воздушной эвакуации может быть подтверждено хлопать пектораль крупные и мелкие грудные мышцы, вызванные изгнанных воздуха.
  10. Закройте кожи, горизонтальные матрас шовный материал с Шелковый шов 5-0.
    Примечание: Пектораль основных и грудные мышцы мелкие должно не быть зашивается, потому что они разделяются только тупо и их анатомических структур нетронутыми на протяжении всей операции.

4. послеоперационное управление

  1. Администрировать бупренорфин (3 мг/кг) дважды ежедневно через подкожных инъекций для уменьшения послеоперационных болей в течение первых 48 часов после операции11.
  2. После операции немедленно сохранить мышей на площадку тепла (37 ° C) пока не полностью выздоровел. Поместите курсор мыши обратно к клетке, после того, как он полностью восстанавливается.
  3. Стерилизовать используемые Hamilton шприц и иглу шприца 30 G в стерилизаторе высокой температуры/высокого давления (см. Примечание Шаг 1.4). Соберите стерилизованные иглы шприца 30 G в Шарпс контейнер.

5. в естественных условиях изображений для измерения выражения сердечной Люцифераза

  1. На 5 день после инъекции аденовирус готовить свежие Стоковый раствор люциферин в 15 мг/мл в Дульбекко фосфатный буфер (DPBS). Фильтр решение через фильтр 0.2 мкм.
  2. Внутри peritoneally инъекционные проснулся мышей с решением люциферин в 150 мг/кг веса тела.
  3. Включите систему обработки изображений.
  4. После автоматическое самотестирование системы обработки изображений, выберите режим визуализации как «Светящийся» и задайте следующие параметры: экспозиции: Авто; Биннинга: 8; Ступень: 1; Возбуждение: Блок; Выбросы: открыт.
  5. В 10 мин после инъекции люциферин анестезировать мышей впрыской хлораль гидрат (300 мг/кг веса тела). Подтвердите адекватной анестезии, отсутствие ответа щепотку мыс.
  6. Закрепите наркотизированных мышей на сцене с подогревом изображений в лежачем положении, с груди, направлены на камеру.
  7. Собирать изображения (1 изображение для каждой мыши) и количественную оценку интенсивности сигналов используя идентичные круговые измерения регионы интереса (ROI) вокруг груди.
  8. После коллекции изображений пожертвовать мышей и собирать ткани, как указано в следующем разделе.

6. заготовка тканей

  1. В разное время точках после инъекции вируса (рис. 1B) анестезировать мышей с 4% изофлюрановая и поддержания анестезии с 2% изофлюрановая через носовой конус и закрепите его на пластиковой платформе в лежачем положении.
  2. Сделайте срединной брюшной разрез в передней шеи. Предоставить правой общей сонной артерии, втягивания omohyoid и ключично мышцы.
  3. Пожертвуйте мышей transecting правой общей сонной артерии и слива крови.
  4. Сделайте срединной брюшной разрез в брюшной полости. Cut ребра с обеих сторон вдоль линии midclavicular грудной клетки и разрез диафрагмы.
  5. Разоблачить сердце, подняв Мечевидный. Найти восходящей части аорты и аккуратно удалить периваскулярной жировой ткани.
  6. Иглу аорты и retrogradely perfuse сердце с иглой 30 G, прилагается к 1 мл шприц, заполнены с 0,5 мл 4 ° C фосфатного буферного раствора (PBS).
  7. После перфузии акцизный сердце и разделить его на левый и правый желудочки. Акцизы, печени, легких и селезенки.
  8. После двух стирок в холодных PBS (4 ° C) Храните все собранные ткани отдельно в криогенных флаконов в жидком азоте.

7. определение выражения протеина

  1. Подготовьте гомогенизации буфера, добавив коктейль ингибитор протеазы в коммерчески доступных литического буфера в соотношении 1: 100. Вычислите объем, основанный на количество выборок для обработки. Держите подготовленных гомогенизации буфера на 4 ° C для последующего использования.
  2. Вывезти тканей из бака жидким азотом. Вес ткани на высокоточные весы (примерно 60 мг на каждый кусок ткани).
  3. Передать новой microcentrifuge 1,5 мл трубки ткани. Сразу же добавьте 200 мкл буфера гомогенизации и помощи 1,5 мм стальных шариков (4 ° C) в пробки microcentrifuge.
  4. Безопасный microcentrifuge трубы в помощи (4 ° C) металлические держатели в автоматической ткани, шлифовальные машины и начать гомогенизации, запустив компьютер со следующими параметрами: частота: 70 Гц; время: 120 s.
  5. После гомогенизации центрифуга огневки (16 000 × g, 4 ° C) и тщательно передать новый 1,5-мл с пипеткой 100 мкл супернатант.
  6. Добавить загрузки буферного раствора (5 x) белка супернатант в соотношении 1:4 и денатурировать протеина при 100 ° C за 5 мин.
  7. Уровнях выражения протеина в сердце и других тканей органа далее контролируются Западный анализ помаркой (представитель результаты показаны на рисунке 2 c и 3 на рисунке) согласно протоколу описанных ранее12.

Результаты

Протокол эксперимента и некоторые из ключевых шагов для метода сообщил показаны на рисунке 1. 5 дней после инъекции intramyocardial кодирования Люцифераза аденовирус (Adv люк), в естественных условиях визуализации adv Люк вводят мышей указал надежных гиперэ?...

Обсуждение

Текущий отчет демонстрирует изменение техника для инъекций intramyocardial вирусных векторов для сердца генные манипуляции, который был модифицирован из метода индукции инфаркт миокарда, Гао и др. 13 в настоящее время, в естественных условиях характеристика конкретных ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана национального научного фонда для выдающихся молодых ученых (81625002), национальные естественные науки фонд Китая (81470389, 81270282, 81601238), из Шанхая академических исследований руководитель программы (18XD1402400), Шанхай муниципальных Образования Комиссии Gaofeng клинической медицины Грантовая поддержка (20152209), Шанхай Shenkang больница центр развития (16CR3034A), Шанхайский университет (YG2013MS42), Шанхай Цзяо Тун университета Школа медицины (15ZH1003 и 14XJ10019), Шанхай Парусный программы (18YF1413000) и программа последипломного инноваций в Бэнбу медицинский колледж (Byycx1722). Мы благодарим д-р Erhe Gao за его предыдущих помощь в нашей лаборатории.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipments
Laminar flow sterile hoodFengshi Animal Experimental  Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)FS-CJ-2F
CentrifugeThermo Scientific (Waltham, USA)75005282
Tissue grinding machineScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)Scientz-48
High temperature/high pressure sterilizerHirayama (Saitama, Japan)HVE-50
Isoflurane vaporizer Matrix (Orchard Park, USA)VIP3000
IVIS  Lumina III imaging systemPerkinElmer (Waltham, USA)CLS136334
Precision balanceSartorius (Göttingen, Germany)28091873
Instruments 
Eppendorf pipette (100 µL)Eppendorf (Westbury, USA) 4920000059
Eppendorf pipette (10 µL)Eppendorf (Westbury, USA) 4920000113
ForcepsShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. JD4020Curved tip
Hamilton syringeHamilton (Nevada, USA)80501Volume 50 μL
Micro-mosquito hemostatF.S.T (Foster City, USA)13011-12Curved, tip width 1.3mm
Needle holder Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)J32110
Surgical scissorsF.S.T (Foster City, USA)14002-12
1-mL SyringeWeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)
Materials and reagents
Anti-GAPDH antibodyCST (Danvers,  USA)#2118
Anti-Luciferase antibodyAbcam (Cambridge, UK)ab187340
Anti-rabbit IgGCST (Danvers,  USA) #7074
Anti-VDR antibodyAbcam (Cambridge, UK) ab109234
BuprenorphineThermo Scientific (Waltham, USA)PA175056
Chloralic hydrasLingFeng Chemical (ShangHai, China)
Cryogenic VialsThermo Scientific (Waltham, USA)3754181.8 mL 
Depilatory creamVeet (Shanghai, China)
Dulbecco's phosphate buffered saline Gibco (Grand Island,  USA)14040133
EntoiodineLiKang (Shanghai, China)310132
EP tubeSarstedt (Newton, USA)PCR001
FilterMillipore (Bedford, USA)Pore size 0.2 µm 
IsofluraneYipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)
LuciferinPromega (Madison, USA)P1041
Lysis buffer for western  blotBeyotime (Shanghai, China)P0013JWithout inhibitors
Ophthalmic creamApex Laboratories ( Melbourne, Australia))
PBSGibco (Grand Island,  USA)10010023
Protease inhibitor cocktailThermo Scientific (Waltham, USA)78438
5-0 silk sutureShanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)
Steel ballScientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)Width 1.5 mm
Syringe needleKindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)30 gauge 
Warm matWarmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )NF-GNCW

Ссылки

  1. Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
  2. Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
  3. He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
  4. Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
  5. He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
  6. Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
  7. Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
  8. Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
  9. Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
  10. Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
  11. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
  12. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  13. Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
  14. Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
  15. Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
  16. Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
  17. de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
  18. Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
  19. Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
  20. Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
  21. Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
  22. Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
  23. Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
  24. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены