JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол фокусируется на количественный анализ сложности нейрональных дендритных арборизация (NDAC) у дрозофилы, который может использоваться для исследования дендритных морфогенеза.

Аннотация

Дендриты разветвленной прогнозы нейрона, и дендритных морфология отражает синаптических Организации в ходе развития нервной системы. Дрозофилы личиночной нейрональных дендритных арборизация (da) является идеальной моделью для изучения морфогенеза нейронных дендритов и функции гена в развитии нервной системы. Есть четыре класса да нейронов. Класс IV является наиболее сложным с шаблоном ветвления, который охватывает почти всю площадь личиночной стенки тела. Мы ранее характеризуют эффект подавления Drosophila ortholog SOX5 класса IV нейрональных дендритных арборизация сложности (NDAC) с помощью четырех параметров: длина дендритов, площадь поверхности покрытия дендритов, Общее количество филиалов и разветвленной структуры. Этот протокол представляет собой процесс количественного анализа NDAC, состоящий из личинок рассечение, конфокальная микроскопия и процедур анализа изображений с помощью ImageJ программного обеспечения. Дальнейшее понимание да развития нервной системы и ее основные механизмы улучшения понимания нейрональных функции и предоставить подсказки о фундаментальных причин неврологические и нервной расстройств.

Введение

Дендритов, которые являются разветвленные прогнозы нейрона, покрывают поле, которое включает сенсорные и синаптической входы нейрона от других нейронов1,2. Дендриты являются важным компонентом формирования синапсов и играть решающую роль в интеграции синаптических входов, а также распространение электрохимических стимуляции в нейрон. Дендритных арборизация (da) представляет собой процесс, по которому нейроны образуют новые дендритных деревья и ветви для создания новых синапсов. Развитие и морфология-Да, как филиал плотность и шаблоны группировки, результатом многоэтапного биологических процессов и тесной взаимосвязи нейронов функции. Цель настоящего Протокола заключается в предоставляют метод количественного анализа сложности нейрональных dendritric арборизация в дрозофила.

Сложность дендритов определяет синаптических типы, подключения и входы от партнера нейронов. Ветвящиеся структуры и плотность дендритов участвуют в обработке сигналов, которые сходятся на дендритных поле3,4. Дендриты имеют гибкость для корректировки в области развития. Например синаптических сигнализации сказывается на организации дендритов соматосенсорные нейрон в ходе этапа развития и в развитой нервной системой5. Создание соединения нейронов опирается на морфогенеза и созревания дендритов. Пороки развития дендритов ассоциируется с нарушениями функции нейронов. Исследования показали, что аномалия да нейрон морфогенеза может способствовать этиологии множественные нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD), и Лу Гериг болезнь / Боковой амиотрофический склероз (ALS)6,,78. Синаптических изменения появляются на ранней стадии AD, в концерте с спад и ухудшение нейрон функция7,8. Однако специфика как дендритов патологии способствует патогенез этих нейродегенеративных заболеваний остается труднодостижимой.

Развития дендритов регулируется гены, которые кодируют сложную сеть регуляторов, например Wnt семейство белков9,10, факторов транскрипции и лигандами на поверхности рецепторы клеток11,12 . Дрозофилы да нейроны состоят из четырех классов (класса I, II, III, IV), из которых класса IV да нейроны имеют самые сложные структуры ветвления и использовали в качестве мощной экспериментальной системы для лучшего понимания морфогенеза13, 14. Во время ранних морфогенеза гиперэкспрессия или RNAi сайленсинга генов в класс IV да нейронов привести к изменениям в разветвленной структуры и дендритов обрезка13. Важно разработать практический метод количественного анализа нейрональных дендритных арборизация.

Ранее мы показали, что молчание Drosophila ortholog SOX5, Sox102F, привело к коротких дендритов нейронов да и уменьшение сложности в классе IV да нейронов15. Здесь мы представляем процедуры количественного анализа для нейронов дендритных арборизация сложности (NDAC) у дрозофилы. Этот протокол, взято из предыдущего описывается методология, предоставляет краткое метод для анализа развития да сенсорных нейронов. Это иллюстрирует надежные изображения маркировки и да нейрон в третьего возраста личиночной стенки тела16,17,18,19. Это ценный протокол для исследователей, которые хотят исследовать NDAC и развития различия в естественных условиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовка следующих реагентов: фосфат Дульбекко в буфер солевой раствор (PBS); Тритон X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Тритон X-100); 32% параформальдегида (PFA), разбавляют в 4% перед использованием; силиконовые эластомера базы и отвердителя; antifade монтаж среднего (например, продлить золото); и ноготь польский.
  2. Подготовьте следующее оборудование: рассечение микроскопа, два острые щипцы и ножницы для microdissection, количество контактов для microdissection, чашку Петри блюдо рассечение, Микроскоп слайды и coverslips, конфокального микроскопа и компьютер с установленным программным обеспечением ImageJ Фиджи.

2. личинки коллекция

  1. Мат в бла-Sox102F-RNAi мух с бас-GFP, ППК GAL4 или W1118 дикого типа мух, соответственно. Культура мух в стандартных условиях при 25 ° C.
  2. В ~ 5-6 дней, собирать третий instar личинки бла-Sox102F-интерференции / ППК GAL4, бас-GFP или UAS-GFP и ППК GAL4 / + управления тщательно с щипцами для рассечения.

3. рассечение личинок

Примечание: Все процедуры в этом разделе эксплуатируются под микроскопом microdissection. Масштаб — до следователей. Попробуйте настроить оптимальный вид вид. Рекомендуется увеличение X ~ 4-6.

  1. Место larva рассечение блюдо из силиконового эластомера базы и культуры ткани Петри.
  2. Закрепить личинка рот крюк, чтобы позволить спинной стороне для лицом вверх, и затем закрепить хвост личинки. Место спинной стороне в середине как можно больше подвергать средней линии, которая будет маркер открытого вверх.
  3. Добавьте 200 мкл PBS личинка для поддержания влажности тела.
  4. Сделайте надрез с ножницами вдоль наспинная срединной линии между двумя трахеи от каудально к Ростральные. Сделайте небольшой надрез на каждом из четырех углов тела личинки.
  5. Место ПИН-код в каждом из четырех углов тела так, что тело лежит плоский.
  6. Исправить стенки тела личинки в 4% PFA для 25 мин при комнатной температуре.
  7. Стирать в PBST на 5 мин повторить два раза больше.
  8. Удалите контакты из ткани. Затем перенесите ткани на стекло слайд, накройте antifade монтажа средних и смонтировать с крышки выскальзования. Воздух сухой для 1 h и уплотнение края с ноготь польский.

4. обработка изображений

Примечание: Изображения были взяты с помощью системы Перевернутый конфокального микроскопа. Пользователь может фотоснимок образца с помощью 20 X цели (рекомендуется).

  1. Z-серии снимков. Откройте диалоговое окно «Захвата Z-серии» в программном обеспечении конфокального микроскопа. Определите диапазон для захвата изображений серии Z.
    1. Нажмите на кнопку «Сверху и снизу». Определить в верхней и нижней позиции и входные значения для «внизу:» и «Top: «коробки. Установите «Шаг» в диалоговом окне «Захвата Z-серии» как 0,5 мкм. Затем нажмите кнопку «Запустить» для получения Z-серии изображений.
  2. Сохранение полученных изображений в *.tiff или *.nd2 файлов.
  3. Храните слайды в темной держатель на 4 ° C после съемки.

5. dendrite оценки

Примечание: Белка GFP был co оверэкспрессировали в Уан-GFP и ППК GAL4 летит в da нейронов для флуоресценции GFP визуализации анализа. Длина, ветвления и структура да нейронов в третьем instar личинки были количественно. Параметры анализа включают длины дендритов (мкм), площадь поверхности (2мкм), общее количество филиалов и разветвленную структуру (%). Рисунок 1 показывает параметры анализа в деталях.

  1. Длина дендритов
    Примечание: Длина дендритов является суммой всех дендритов, помечены в трассировщик плагин.
    1. Установка и запуск программного обеспечения20 ImageJ Фиджи (https://fiji.sc/). Затем разделить образы на отдельные каналы, если существует несколько каналов изображения.
      Примечание: Изображение в этот протокол имеет только один канал GFP.
    2. Запустите «изображение | Стеки | Проект Z» для получения Z проекции; появится новое окно с именем «Z-проекция.» Нажмите кнопку «Макс интенсивности» для типа проекции и организовать чисел между начало фрагмента и остановить ломтик зависящ на индивидуальных предпочтений. Нажмите кнопку «ОК». Z-проекция изображения появится, четко представляя проекции дендритов.
    3. Трассировка невритов.
      1. Выберите «плагины | Сегментация | Простой невритов Tracer» в окне трассировки дендритов. Найти нейрон сома и выберите одну точку на дендритов, начиная от тела клетки и еще один момент на кончике этого дендритов.
        Примечание: Программа будет подключить две точки с синей линией.
      2. Нажмите «Y» в окне плагина, если путь ясно; путь дендритов прослеживается до конечных точек выбранного пути в видимые изображения. Нажмите кнопку «полный путь» в том же окне плагина; сегмент завершена (рис. 2).
        Примечание: Некоторые дендритов закончилась дальше от начальной точки, в которых путь был разделен на меньшие сегменты. Сегменты были объединены, чтобы предоставить полный путь для трассировщика.
    4. После завершения путь, вернуться к новой точке, где ветви. Новый путь может быть построен на; поле окна «Все пути» будет показывать значения длины всех путей (рис. 3). Сохраните файл трассировки и продолжать с незавершенной следы, как показано на рисунке 2.
    5. Экспорт данных длины дендритов, нажав, «файл | Экспортировать как *.cvs» в окне «Плагин». Затем суммировать все длины пути и экспортировать данные в программное обеспечение анализа/таблицы данных. (Рис. 3).
  2. Площадь поверхности нейронов да
    1. Выберите инструмент рисования от руки в окне «Фиджи ImageJ». Проследить путь, а затем подключить конечные точки. Выберите из меню «Анализ», «набор измерений | Площадь.» Нажмите кнопку «мера» из меню «Анализ». Результат появится в новую коробку с значением для области (рис. 4). Скопируйте его в программное обеспечение для анализа данных.
  3. Общее число филиалов и ветвления структуры да нейронов
    1. Рассчитайте общее количество филиалов, открыв «Анализ» и затем «визуализации | Анализ Skeletonized пути» в окне плагина трассировки (рис. 5).
      Примечание: Структура Арбор является сумма уровней филиалов. Путь был определен между тела клетки и советы дендритов, и один путь может включать несколько ветвей, такие как первичный беседки дендритов из клеток тело нейрона. Вторичные беседок являются филиалами от первичного и так далее с третичного, четвертичные и пятикомпонентный беседки. Структура дендритов ветвления разделены в зависимости от уровня филиалов. Например основной % является количество филиалов делится на общее количество ветвления и так далее.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Дендритов нейронов да были помечены co экспрессирующих GFP (UAS-GFP; ППК GAL4) в da нейронных сома и дендритных беседки для флуоресценции GFP визуализации анализа. Морфология да нейрон дендритов было imaged Перевернутый Конфокальный микроскоп (рис. 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Дендритов, которые иннервируют эпидермис являются области входных нейронов, и их морфологии определить, каким образом информация поступает и обрабатывается индивидуальных нейронов. Развития дендритов морфология отражает гена модуляции дендритов Организации. Нейрон личиночной да ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Уильяма а. Eimer для визуализации технической помощи. Эта работа была поддержана Фондом Cure-Альцгеймера [в R.E.T], Национальный институт здравоохранения [R01AG014713 и R01MH60009 для R.E.T; R03AR063271 и R15EB019704 а.л.] и Национальный научный фонд [NSF1455613 а.л.].

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

Ссылки

  1. Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
  2. MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
  3. Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
  5. Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
  6. Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
  7. Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer's disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
  8. Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
  9. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  10. Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
  11. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
  12. Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
  13. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  14. Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
  15. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
  16. Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
  17. Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
  18. Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
  19. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
  22. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  23. Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
  24. Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
  25. Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).
  26. Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
  27. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  28. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143Dendrite

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены