Состав тела и метаболических арретирование анализ высокого жира ФРС мышей

Резюме

Этот протокол описывает использование анализатор состава тела и метаболических животных системы мониторинга характеризовать состав тела и метаболических параметров у мышей. Для применения этих методов в качестве примера используется модель ожирения, вызванных высоким содержанием жиров питание.

Аннотация

Изменения в составе тела (fat или мышечной массы), метаболических параметров, таких как потребление кислорода всего тела, затрат энергии и использование подложки и поведения, например, питания и физической активности могут обеспечить важную информацию относительно основных механизмов болезни. Учитывая важное значение состава тела и метаболизм в развитие ожирения и его последующие осложнения, это необходимо сделать точные меры этих параметров в параметре доклинических исследований. Достижения в области технологий за последние несколько десятилетий сделали возможным для получения этих мер в моделях грызунов в неинвазивные и продольные моды. Следовательно эти метаболических меры оказались полезными при оценке ответа генетических манипуляций (например нокаут или трансгенных мышей, вирусный нокдаун или гиперэкспрессия генов), экспериментальных наркотиков/соединение скрининг и диетическое, поведенческих или физической активности вмешательств. Здесь мы описываем протоколы, используемые для измерения состава тела и метаболических параметров с помощью системы в Чоу кормили высоких жира диета кормили мышей и мониторинга животного.

Введение

Метаболизм подкрепляет многие аспекты нормального клеточного, орган и физиологии всего тела. Следовательно в параметре различных патологий, изменения метаболизма может непосредственно способствовать базового условие или могут негативно повлиять как побочный эффект патологии. Традиционно метаболические и исследований в энергетический баланс были сосредоточены на области ожирения и соответствующих условий, таких как сопротивление инсулина, заранее диабет, глюкозы нетерпимость, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Это исследование является оправданным ввиду эскалации распространенности таких условий во всем мире и индивидуальных, социальных, и экономических издержек этих условий нанести. Таким образом развитие превентивных стратегий и новых терапии ожирения целевой является постоянной целью в исследовательских лабораториях во всем мире и доклинические мыши модели сильно полагаться на эти исследования.

В то время как взвешивание мышей обеспечивает надежную оценку веса или потери, он не обеспечивает разбивку различных компонентов, которые составляют всего тела композиция (жировой массы, мышечной массы, свободной воды, а также других компонентов, таких как мех и когти). Весом жировых отложений на завершение исследований, когда мышь умершего обеспечивает точное измерение различных жировых отложений, но может предоставить только данные для точки один раз. Как следствие часто бывает необходимо зарегистрировать несколько когорты для изучения развития ожирения в течение времени, значительно увеличение поголовья, время и затраты. Использование двойного энергии рентгеновская абсорбциометрия (DEXA) обеспечивает подход к оценке содержимого тела жира и мышечной ткани и позволяет исследователю для получения данных в продольные моды. Однако эта процедура требует мышей наркотизированных¹, и повторяющиеся приступы анестезии могут повлиять накопления жировой ткани или повлиять на другие аспекты метаболических регулирования. EchoMRI использует relaxometry ядерного магнитного резонанса для измерения жира и мышечной массы, бесплатная вода и общее содержание воды. Это достижимо благодаря созданию контраст между компонентами различных тканей, с различиями в продолжительности, амплитуда и пространственного распределения созданного радиочастот, позволяя определение и количественная оценка каждого типа ткани. Эта техника является выгодным, как это неинвазивный, быстрый, простой, не требует анестезии или радиации и, главное, позитивно протестирована против химического анализа².

Ключевым моментом ожирения и связанных с ними исследований является уравнение баланса энергии. Хотя накопление жира является более сложным, чем чисто энергии (пищи) против энергии из (расход энергии), они являются жизненно важными факторами, чтобы иметь возможность измерить. Ежедневные расходы энергии будет в общей сложности четыре различных компонентов: (1) расходы базальной энергии (метаболизма); (2 расходы энергии за счет теплового эффекта потребления продовольствия; (3) энергии, необходимой для терморегуляции; и (4) энергию потратил на физической активности. Как расходование энергии генерирует тепло, измерения производства тепла животное (известный как Прямая калориметрия) может использоваться для оценки расходов энергии. Кроме того измерение вдохновил и истек концентрации O₂ и CO₂, что позволяет для определения всего тела O₂ потребления и производства CO₂ , могут быть использованы как способ косвенно измерить (косвенные калориметрия) тепла производства и поэтому рассчитать расходы энергии. Увеличение потребления пищи или сокращение расходов энергии будет предрасполагают мышей к увеличению веса и наблюдения за изменениями в этих параметров может дать полезную информацию, вероятно механизмов действий в конкретных моделях ожирения. Связанные метаболических параметр интерес — коэффициент дыхательных путей обмена (RER), показатель доли субстрата/топлива (т.е., углеводов или жиров), переживает метаболизм и используются для производства энергии. Следовательно измерение потребляемой пищи (потребляемой энергии) в сочетании с уровни физической активности, O₂ потребления, RER и расходование энергии может обеспечить широкое понимание профиля метаболизм организма. Один из методов для сбора таких данных является использование всеобъемлющего лабораторных животных, мониторинга системы (МОЛЛЮСКИ), которая базируется на косвенные калориметрии метода для измерения расходов энергии и имеет дополнительные возможности определения уровней физической активности (луч перерывы) и потребление пищи через весы включены в измерительной камеры.

В этом протоколе мы предоставляем прямой описание использования анализатор состава тела для оценки состава тела в мышей и метаболических животных системы мониторинга для определения аспекты метаболизма. Соображения и ограничения для этих методов будет обсуждаться, а также предлагаемые методы анализа, интерпретации и представления данных.

протокол

Все эксперименты описал были утверждены Комитетом Альфред медицинских исследований образования участковых животных этики (AMREP АЭС) и мышей были предоставлены гуманной помощи с учетом национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) Австралии руководящих принципов Экспериментов на животных. Животные были в ведении их предписанные диеты и воды ad libitum и размещается в среде с контролируемой температурой (~ 21-22 ° C) с свет 12 h и 12 h темноте циклом. Семь неделя старый самцов мышей (на фоне C57Bl/6J) были откармливаются либо регулярные нормального Чоу (состоящий из 76% кДж от углеводов, 5% жира, белка 19%; см. таблицу материалы, энергия содержимого 14.3 МДж/кг) или для группы высокого кормления жиров, высоким содержанием жиров диеты (HFD) ( энергии содержание 19 МДж/кг, состоящий из 36% кДж из углеводов, жиров 43%, 21% белка, каналы специальности) за 3 недели. Вес тела и измерений состава тела с помощью EchoMRI машины были сделаны за неделю в то время как Метаболический Анализ мониторинга имели место в МОЛЛЮСКОВ после 3 недели диеты.

1. Процедура анализатор состава

Примечание: Для оптимального функционирования, EchoMRI 4-в-1 используется в настоящем протоколе должны содержаться в комнату, где температура воздуха является стабильной и не колебаться. В идеале это должна постоянно контролироваться. Перемещение машины и перерывы к власти также следует по возможности избегать. Если блок питания была прервана, и система должна быть перезапущена, позволяют по крайней мере 2-3 ч для машины, чтобы разогреть прежде чем использовать его снова. Перед началом, убедитесь, что вы носите правильные средства индивидуальной защиты.

1. До начала сканирования мыши, выполните тест системы на машине анализатор состава тела. Это включает использование стандарт калибровки (упоминаемый как рапсовое масло системы испытательный образец (расходы)) проверить точность этого документа и чтобы убедиться, что там было без дрейфа в ее точности.
   1. Откройте системного программного обеспечения, затем нажмите кнопку панели инструментов системы тестирования или нажав «Alt + Y» одновременно.
   2. Прежде, чем испытание системы осуществляется на компьютере, подождите напоминание, чтобы проверить, что правильно затраты (в данном случае мыши-расценки) помещен внутри Гантри системы ( рис. 1). После подтверждения, что это действительно так, согласиться продолжить тест, который займет несколько минут для завершения.
2. После того, как был принят системный тест, вперед продолжите сканирование.
   1. Если тест системы не удается, повторите тест системы.
   2. Если машина продолжает оставаться вне диапазона (указывает, что произошло отклонение), калибровка может быть необходимо исправить ситуацию. Выполните это, следуя указаниям или как описано в руководстве пользователя, предоставленное во время покупки. Если проблема не устранена, проверьте руководство³ или сообщить о проблеме в службу поддержки производителя и получить дальнейшие инструкции.
3. Место мыши в держатель мелких животных образца (длинный цилиндр) держать их содержащихся в машине. Чтобы сделать это, поместите держатель горизонтально, подобрать мышь и сначала вставьте его в отверстие головки блока цилиндров. Медленно и тщательно принести держателя в вертикальное положение так, чтобы указатель мыши находится в нижней части цилиндра и готовы для анализа.
4. Однажды в держатель, Вставьте разделитель для ограничения движения мыши во время измерения периода. В некоторых случаях, с чрезвычайно активные мышей может быть необходимо держать разделитель в месте с пальца.
   Примечание: Ознакомить мышей с размещением в держатели образца до их первоначального анализа для снижения стресса. Использование красного цвета животных образца держателя может также уменьшить потенциальной реакции на стресс, как мышей считают, что они находятся в темноте.
5. В рамках программного обеспечения выберите папку (Папка инструментов) для сохранения данных и создать имя файла.
6. При необходимости, уменьшить количество случайный шум в жировой и мышечной измерений путем увеличения числа первичных скоплений сканирования. После запуска программного обеспечения первичного накопления установлено рекомендуемое значение по умолчанию для общего ежедневного использования; Если нет особых причин для изменения этих параметров, параметры по умолчанию даст необходимый уровень точности для пользователей.
7. Если вы не заинтересованы в получении данных для свободной воды и воды, выключите воду стадии, выбрав вкладку, чтобы сказать нет. Это будет значительно сократить длительность проверки и повысить пропускную способность.
8. Инициировать сканирование, выбрав «начать проверку» или нажав клавишу F5 на клавиатуре. Введите все необходимые данные о животных (например, животное ID, массы тела, и т.д.) и нажмите «ОК» или клавишу F5, чтобы начать проверку, которая займет около 1 мин.
9. После того, как были получены данные, удалите держателя животного, содержащие мыши из машины и место животных обратно в своей клетке. После того, как все животные были отсканированы, экспортируйте данные для дальнейшего анализа и сортировки.
10. До и после использования тщательно очистите животных Держатели согласно инструкциям производителя. Как эти держатели изготавливаются из акрилового пластика, изопропиловый спирт этиловый спирт следует избегать и как они могут вызвать растрескивание владельцев и/или быстрое ухудшение держателя, тем самым увеличивая вероятность поломки. Вместо этого используйте теплую воду для мытья посуды решения или, если требуется дальнейшее дезинфицирующее, используйте F10 (при разбавлении колера) или других дезинфицирующим или чистящие аэрозоли, (см. Таблицу материалы) и затем вытереть.

2. метаболические животное процедуры системы мониторинга

Примечание: Система требует ~ 2 h для разминки и стабилизации. Если компьютер был выключен, он должен быть включен чтобы позволить циркония ячейку, чтобы быть нагрета до 725 ° C. Также мы обычно место мышей в анализатор состава тела предыдущий день до ввода системы мониторинга животного чтобы избежать любых проблем с сдержанность стресса.

1. Убедитесь компьютере, подключенном к системе мониторинга животного и открыть программу управления. Выберите параметр «Oxymax Utility» из меню инструментов инициировать насосов.
2. Заполнить бутылки воды с соответствующим водой, взвесить и проверить здоровье мышей и организовать питание. Если измерение потребления пищи в системе, рассмотрим растиранием пищи. Заполните пищи бункера, удручает подпружиненной платформы и кончик еда в воронку. Убедитесь, что еда Хоппер и бутылка воды полностью обеспечить, что есть достаточно пищи и воды в прошлом отведенное время экспериментальных.
3. Проверить статус drierite/осушитель; Если цвет индикатора, он должен быть синий и поэтому сухой, но если это Розовый/Пурпурный, он имеет значительные влаги поглощения и следует заменить или пополнить.
4. Проверьте состояние ловушки аммиака и известково и при необходимости замените. Если в ловушку аммиака подключен два в то время, когда вторая ловушка показывает признаки изменения цвета, заменить первый. Увеличение CO₂ смещение также может означать необходимость замены извести соды.
   Примечание: Осушитель можно сушить в духовке и повторно, однако мы следовать рекомендациям производителя системы использовать свежий каждый раз.
5. Соберите камер. Для этого, место пищи бункера на баланс, затем поместить камеру на вершине с перфорированной платформу, которая становится Пол камеры вставляется. Осторожно поместите курсор мыши в камере и наденьте крышку системы с передней и клипы и храните до позиционирования бутылку воды и крепления. В качестве меры предосторожности, повторно проверьте все крышки камеры, мыши и воды (рисунок 2A-D).
   Примечание: В зависимости от размера мышей рассматривается, это может быть необходимо отрегулировать высоту пространства выше Хоппер еда так что мышей имеют доступ к пищу, но не хватает пространства, что они могут спать прямо на вершине кормушки.
6. Как это было рекомендовано, что газовые датчики калибруются перед каждой эксперимент, калибровки системы.
   1. Используйте газ известные композиции (0,5% CO₂, 20,5% O₂, баланс азота). Подключите калибровки бензобака к системе через регулятор и шланг. Включите и обеспечить выходного давления бак является чтение 5-10 psi.
      Примечание: Некоторые системы будет иметь второй танк, шланг и регулятор для использования чистого азота как «смещения» газ. Система, которую мы работаем использует вместо извести соды для создания свободного воздуха CO₂ .
   2. Выполните процедуры для калибровки O₂ и датчики CO₂ . Выберите «Калибровка» из меню Сервис и последовательно калибровки O₂ и CO₂. Перед калибровки убедитесь, что пример 1) и ссылку потоков 0.400 LPM, датчик температуры 2 циркония O₂ 725 ° C (± 1 ° C), 3) образца и ссылка сушилка и воздушные насосы находятся на, и 4 газ калибровка придает и включен.
   3. При необходимости, когда калибровка датчика₂ O, слегка отрегулируйте смещение элемента управления на передней части датчика кислорода циркония для достижения значение коэффициента₂ O 1,0000 (± 0.0002). Это чтобы убедиться, что он находится в допустимых пределах (выделены зеленым шрифтом в программного обеспечения отображения на экране компьютера).
   4. После успешного O₂ и калибровка датчика CO₂ выключить газовый баллон калибровки и отсоединить шланг от регулятора. После калибровки,₂ O для ведения воздуха (атмосферного) следует читать 20.92 (± 00.02). Если калибровка из терпимости, повторить и относятся к неисправности гиды от производителя. В противном случае обратитесь к изготовителю для получения дальнейших инструкций.
7. Перейти к экспериментальной установки. Выберите «экспериментальная файл открыть» из меню «эксперимент». Выберите соответствующий шаблон (например, мышь). Под «Настройка» в меню «эксперимент» определяют параметры эксперимента, которые должны быть записаны (например, мыши ID, веса, группа и т.д.) отменить выбор любой камеры не в использовании и выберите место для эксперимента, чтобы спастись.
8. Обеспечивать весы были тарированного если измерения потребления пищи и начать захват данных, выбрав «Запуск» в меню «эксперимент». Данные регистрируются на разные сроки в зависимости от фенотип, институциональных руководящих принципов на животных изоляции и использования системы.
   Примечание: В наших руках, регулярно эксперимента в течение 48 часов, с первой 24 h используется как акклиматизации в новой среде и второй 24 h, используемых для анализа данных. Период сбора данных на основе как долго следователь хочет держать их мышей поодиночке жильем и зависит от одобрения животных этики. Кроме того если существуют положения, мышей может прижились в камерах до помещены в систему и подключен. Каждая палата измеряется приблизительно раз в 13 мин, когда 12 камерная система используется.
9. Регулярно проверяйте и результаты, которые получены в то время как мыши в системе для обеспечения благополучия животных и что соответствующие данные собираются. Любой вопрос может быть могут быть определены на данном этапе и исправить. Проверить на каждой мыши, ежедневно утром и вечером, когда они находятся в системе.
10. Проверьте метаболических вкладки в верхней части страницы файла данных для данных, собранных в реальном времени для каждой мыши в отношении потребления, RER и энергии расходы кислорода. Тем временем, луч перерывы и данные о потреблении продуктов питания могут быть расположены в активность и питание вкладок, соответственно. Проверьте, что «O₂ в» чтение вокруг 20.90-20.94, «CO₂ в» составляет около 0,040 - 0.050, RER между 0,7 и 1, а скорость потока постоянна на 0,5 - 0,6 Л/мин.
11. На регулярной основе проверьте что мышей имеют доступ к продовольствию и воде, и что они потребляют каждый. Убедитесь, что они не демонстрируют каких-либо признаков бедствия как копать в перфорированного настила. Кроме того отслеживать результаты, которые отображаются.
12. По завершении экспериментальных отведенное время, выберите «остановить» из меню «эксперимент» и экспортировать результаты (CSV-файлы, файл > Экспорт > создать тему CSV) для анализа.
13. Проверьте здоровье мышей, взвесить их и затем вернуться в их дома клетки.
    1. Мышь может быть враждебными друг к другу после разделения, поэтому контролировать после того, как они размещаются вместе снова.
    2. Разбирать клетки, удалить избыток продовольствия из бункеров и наконечник из фекалий, мочи и питание от клетки. Погружаться бутылки и sippers в разбавленный раствор T-bac, замочить и чистой других компонентов в растворе разбавленных отбеливатель. Промойте чистой водой и оставить воздух сухой.
14. Вычислить метаболических параметров с программным обеспечением. Программное обеспечение использует ряд уравнений для предоставления окончательных данных выход⁴.
    Для расчета потребления и двуокиси углерода производства кислорода: потребление кислорода: VO₂ (LPM)_{= V},_яO_2i - V_oO_2o; Производство двуокиси углерода: VCO₂ (LPM)_{= Vo}CO_2o-V,_яCO_2i
    Где: V,_я = скорость ввода вентиляции (LPM), V_o = производительность вентиляции (LPM), O_2i = O₂ концентрация на вход, O_2o = O₂ концентрация на выходе, CO_2i = CO₂ концентрация на вход, CO_2o = концентрация CO₂ на выходе.
    Для расчета RER: RER = VCO₂ / VO₂. Обратите внимание, что окисление белков не измерялась и поэтому RER не была скорректирована для этого.
    Для расчета энергии расходов: расходы энергии: CV = 3.815 + 1.232* RER
    Жара (ккал/ч)) = CV * VO_2. Где: CV-теплотворная способность (отношения между тепла и объем потребления кислорода). Это происходит от «элементы из науки питания» ссылаются как на Table ласк, входят Грэм ласк.

Результаты

Типичные изменения отображены результаты, показано на рисунке 3 в параметров состава тела при высоких жиров питание, измеренного через EchoMRI. В начале был никакой разницы в любой параметр измеряется (рис. 3A-F). Однако после всего 1 ...

Обсуждение

Важнейшие шаги

Протоколы, описанные здесь, представляют собой пример способов измерения состава тела и различных метаболических параметров в мышей, используя анализатор состава тела и метаболических животных, система мониторинга. Для обоих методов критически...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 in 1 system	EchoMRI	4 in 1 system	Whole body composition analyser
Canola oil test sample (COSTS)	EchoMRI	Mouse-specific (contact company for cat number)
Animal specimen holder	EchoMRI	103-E56100R
Delimiter	EchoMRI	600-E56100D
12 chamber system	Columbus Instruments	Custom built	Metabolic Caging System; includes control program
Drierite	Fisher Scientific	238988	CLAMS consumable
Calibration gas tank	Air Liquide	Mixed to order	Gas calibration (0.5% CO2, 20.5% O2, balance nitrogen).
Normal chow diet	Specialty Feeds	Irradiated mouse and rat diet
High fat diet	Specialty Feeds	SF04-001
Balance	Mettler Toledo	PL202-S	Balance for weighing mice
TexQ Disinfectant spray	TexWipe
Hydrogen Peroxide cleaning solution	TexWipe	TX684